一、应用间期FISH技术探讨 cyclin D1基因在鼻咽癌中的扩增（论文文献综述）
李东杰[1]（2021）在《基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析》文中认为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤,发病率高,约占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%,其死亡率高、预后较差。然而近年来LSCC患者5年生存率及生活质量并无提高,其发病率亦呈逐年升高趋势,并且逐渐年轻化,严重破坏患者的发音、呼吸及吞咽三大功能,威胁患者的生存质量和生存期。对于LSCC的治疗,较晚期患者往往以牺牲喉的功能为代价来延长生命。LSCC是一种基因机制复杂的肿瘤类型,目前其病因和发病机制尚不明确,且尚缺乏用于指导诊断、治疗及预后的特异性肿瘤标志物。因此探究LSCC的发生机理,分析LSCC发生的分子机制以及找出LSCC的分子标志物对于LSCC的早期诊断及治疗越来越重要。遗传不稳定性如染色体不稳定性与LSCC的发生密切有关。拷贝数变异（Copy Number Variations,CNVs）是人类基因组内从1Kb到数个Mb不等的DNA片段拷贝数,包括DNA片段的删除、插入、复制和复合多位点的变异等类型。CNVs是造成个体表型差异的重要遗传基础,其在人类基因组中分布广泛,极大地丰富了基因组遗传变异的多样性。在人类肿瘤中,CNV是可能导致原癌基因的活化和抑癌基因的钝化的重要原因,这些基因在参与调控细胞生长、增殖、凋亡和转移等机制方面发挥着至关重要的作用。Array-CGH（Microarray comparative genomic hybrization）是一种高通量的基因组检测技术,一次实验就能对基因组的变化进行整体检测,并且能筛查出全部染色体的微重复、微缺失和非整倍体等变异,可成为筛选肿瘤发生、转移、复发、耐药等相关候选基因的研究靶点,对于寻找原癌基因和抑癌基因,监测肿瘤发生、发展过程及判断预后有重要的分子遗传学意义。在本研究中,我们通过array-CGH检测获得了LSCC的全基因组的缺失及扩增图谱。同时研究染色体畸变与临床病理特征的关系,通过整合GEO（Gene Expression Omnibus）数据库分析获得各染色体异常数据,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行筛选,为研究LSCC发生及发展提供相关候选基因。目的:通过array-CGH分析LSCC肿瘤组织的全基因组染色体的缺失及扩增图谱,探讨LSCC染色体水平拷贝数变异,并分析染色体CNVs与喉鳞癌临床及病理特征之间的关系,结合GEO数据库分析获得差异表达基因数据,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行筛选,为研究LSCC发生及发展提供相关候选基因。方法:我们使用Agilent公司的基因芯片对66例LSCC进行array-CGH检测,使用Cytogenomics 4.0对实验结果进行数据分析,同时分析染色体CNVs与临床及病理特征之间的关系,结合GEO数据库分析获得差异表达基因,同时绘制火山图及热图,进而对与LSCC发生及发展相关的基因进行整合分析筛选获得LSCC候选靶基因,通过免疫组织化学进一步分析候选基因在癌组织及癌旁组织中的表达,以及其与临床病理参数之间的相关性。结果:（1）本次研究的66例LSCC标本中,经array-CGH检测均有不同数目及大小的基因组CNVs（扩增、丢失、重复和纯合缺失）。66例LSCC中所检测到的基因组不平衡频率较高的染色体片段包括9个重复片段:3q26.1-qter,5pter-p12,7p22.3p14.1,8p12p11.22,8q24.13q24.3,11q13.2q13.4,12pter-p12.2,18pter-p11.31和20p13p12.1,以及5个缺失片段:3pter-p21.32,4q28.1-q35.2,5q13.2-qter,9pter-p21.3以及13 monosomy。3q26.32q27.2区域重复频率最高,其中最小重叠区域（smallest region of overlap,SRO）包含SOX2,EIF4G1,FXR1,DVL3,DCUN1D1和IGF2BP2等基因。8号染色体上有两个高度扩增片段,其中长臂8p11.2和短臂8q24.21,分别包含ADAM2和CCDC26基因。本实验中检测到4个纯合子缺失片段,其所覆盖NEIL3,CSMD1,CDKN2A和PCDH20等可能的抑癌基因。（2）根据临床特征及病理特点,高频染色体片段变异与淋巴结分期、肿瘤分期统计无相关性,3q26.1-qter、5pter-p12重复以及5q13.2-qter缺失在吸烟组与非吸烟组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）整合GEO数据库差异表达基因分析确定SOX2、EIF4G1、FXR1、DVL3、DCUN1D1、IGF2BP2、CCDC26以及CDKN2A、SPINK5、PCDH20、CSMD1、NEIL3候选基因。（4）PCDH20、NEIL3、DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2在喉癌和癌旁组织高表达率比较差异均有统计学意义,PCDH20表达与淋巴结转移、吸烟史负相关,NEIL3表达与淋巴结转移负相关,DCUN1D1表达与TNM分期正相关,EIF4G1、IGF2BP2表达与淋巴结转移正相关。结论:（1）本次研究的66例LSCC组织标本中,经array-CGH检测均有不同数目及大小片段的基因组CNVs（扩增、丢失、重复和纯合缺失）。（2）在LSCC中所检测到的高频扩增及纯合子缺失片段中含有重要相关癌基因以及抑癌基因。（3）特定染色体片段的重复及缺失与吸烟史存在一定相关性,部分筛选基因的表达与临床病理参数相关。（4）结合GEO数据库差异表达基因的整合分析可推定LSCC相关候选靶基因,为进一步研究LSCC的分子发生机制提供参考。
刘洁[2]（2020）在《MiR-B10-3p在牛疱疹病毒5型体外潜伏感染再激活中的作用研究》文中研究说明牛疱疹病毒5型（Bovine herpesvirus 5,Bo HV-5）是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属的一员,感染犊牛后引起严重神经系统疾病,造成巨大的经济损失。Bo HV-5感染首先在口腔或生殖器粘膜产生裂解感染以进行病毒复制;随后沿嗅觉和三叉神经途径逆行到感觉神经元,在此建立以潜伏期相关转录为特征的潜伏期;受到应激刺激后再激活,产生感染性病毒粒子。α疱疹病毒有两个典型特征:在神经细胞中建立潜伏感染和编码mi RNAs。Mi RNA体积小,功能灵活且不易产生免疫原性,作为新兴的调控因子,对调节病毒或宿主基因表达等方面具有重要功能。本实验室前期通过高通量测序和Northern Blot技术验证了Bo HV-5感染牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney,MDBK）后,其基因组编码至少11个mi RNAs基因,Bo HV-5-mi R-B1至Bo HV-5-mi R-B11,这些基因的前体mi RNA（pre-mi RNA）被加工成16种成熟的mi RNAs。然而,在裂解性感染过程中表达的Bo HV-5 mi RNAs对病毒潜伏期的建立和再激活的作用尚待阐明。由于动物模型成本较高且耗时长,目前缺乏能够研究与Bo HV-5再激活相关的关键分子的稳健实验模型,病毒mi RNAs在潜伏期的表达检测受到阻碍,对病毒在裂解感染和潜伏感染之间转换的潜在分子机制了解甚少。为了研究牛疱疹病毒miRNA在不同感染转换之间发挥的作用,我们进行以下的研究,具体内容如下:1建立BoHV-5体外潜伏感染再激活模型首先在体外分离培养了昆明鼠颈上神经节（superior cervical ganglion,SCG）细胞,验证SCG支持Bo HV-5有效感染。在100μm ACV和125 IU/m L IFN-α存在下Bo HV-5感染SCG后表现出潜伏期的关键标志,包括潜伏相关基因（Latency-related,LR）积累、可检测的裂解基因表达的缺失和潜伏期病毒基因组的存在,以及神经生长因子（nerve growth factor,NGF）去除后感染性病毒粒子的产生。2 BoHV-5体外感染中mi RNA的表达在构建的Bo HV-5体外潜伏感染再激活模型基础上,通过茎环引物反转录PCR（stem-loop RT-PCR）检测裂解感染、潜伏感染和再激活三种情况下Bo HV-5编码的16种mi RNAs的表达时序,并通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术鉴定了mi R-10-3p和mi R-10-5p的存在。我们的结果表明Bo HV-5在裂解感染和潜伏状态micro RNAs的差异表达。3 miRNA-B10-3p在Bo HV-5体外感染中的作用研究最终将在裂解感染时读数最高并在潜伏期可检测到的miR-10-3p作为后续研究病毒mi RNA在Bo HV-5生命周期中作用的代表角色。我们使用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）重组方案将miRNA-B10-3p的靶位点UL39的3’UTR产生7个碱基突变。结合实验室前期构建的miRNA-B10-3p致弱毒株,与野生型相比,突变株失去对靶基因调控表现为裂解感染期高拷贝DNA的复制,导致需要提高抗病毒药物使用量才能在体外建立潜伏期,潜伏期基因组表现出比野生型更强的活跃度和高效率的再激活。总之,我们的试验结果表明,BoHV-5潜伏期的研究将从体外神经元培养模型中获益,并证明BoHV-5体外潜伏感染再激活模型有助于研究不同感染时期中miRNAs的表达。MiRNA-B10-3p对BoHV-5潜伏和再激活的影响揭示了独立于宿主对病毒基因组的沉默之外,病毒自身miRNA可以作为病毒在不同感染状态之间转换的开关之一。
罗宏涛[3]（2020）在《LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究》文中研究表明背景与目的食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）对低线性能量传递（Linear energy transfer,LET）X射线中度敏感,放疗后局部控制率低,极易出现局部复发和远处转移。碳离子为高LET射线,具有优于低LET射线的物理学和放射生物学特性,对低LET X射线辐射不敏感或辐射抗拒肿瘤具有较好的治疗效果。白血病抑制因子（Leukaemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能细胞因子,通过白血病抑制因子受体（LIFR）和糖蛋白（gp）-130传递信号,激活STAT3信号通路,刺激肿瘤的生长、增殖和转移,与化疗耐药和放疗抗拒相关。本研究拟采用低LET X射线和高LET碳离子射线辐照食管鳞癌细胞,分析LIF对食管鳞癌细胞经不同LET射线辐照后生物学行为的影响并探讨其发挥作用的分子机制,进一步为高LET碳离子治疗ESCC提供理论基础。方法1.X射线对ESCC细胞辐射生物学行为影响的研究:0、1、2和4 Gy X射线辐照ECA109和KYSE150细胞,采用克隆存活实验检测各剂量X射线对两种细胞存活情况的影响,CCK8法检测各剂量X射线对两种细胞在辐照后24、48和72 h增殖活性的影响,流式细胞术检测各剂量X射线对ECA109和KYSE150细胞辐照后24和48 h凋亡和细胞周期的影响,划痕和Transwell实验检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对细胞迁移和侵袭的影响,免疫荧光共聚焦实验检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对γH2AX蛋白的表达的影响,Western blot检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对Bax,Bcl-2和γH2AX蛋白表达的影响。2.ECA109细胞中辐射抗性差异蛋白分子的筛选:根据上一步实验结果,选用2 Gy X射线辐照后培养48 h和未被辐照过的ECA109细胞两组样本,利用TMT蛋白定量技术进行蛋白组学检测,结合生物信息学方法对所得的结果经过差异分析,筛选得到显着差异的LIF蛋白分子。3.ESCC放疗患者血清中LIF的临床意义:采用ELISA检测60例ESCC患者放疗前后血清LIF浓度变化,并与30例健康者血清LIF浓度对照,观察血清LIF浓度变化与ESCC患者临床病理特征、疾病预后之间的关系。4.LIF通过靶向STAT3在食管鳞癌细胞中生物学效应的探索:采用si RNA技术下调ECA109细胞中LIF分子后采用克隆形成实验,CCK8试验、凋亡实验、迁移和侵袭实验,观察LIF对ECA109细胞克隆形成、增殖、凋亡和转移生物学行为的影响;利用RT-PCR技术和Western blot检测ECA109细胞中LIF和STAT3的表达情况。5.LIF通过STAT3信号通路调控食管鳞癌细胞对碳离子的辐射应答效应及分子机制研究:0、1、2和4 Gy碳离子辐照ECA109细胞,采用克隆存活实验检测各剂量碳离子对ECA109细胞存活情况的影响,CCK8法检测各剂量碳离子辐照ECA109细胞后24、48和72 h对细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测各剂量碳离子辐照ECA109细胞后24和48 h对细胞凋亡和细胞周期的影响,划痕和Transwell实验检测碳离子辐照ECA109细胞后48 h对迁移和侵袭的影响,实时荧光定量PCR检测碳离子辐照后ECA109细胞LIF,STAT3,MMP2,和E-cadherin m RNA表达情况,Western blot检测碳离子辐照后ECA109细胞LIF,STAT3,MMP2和E-cadherin蛋白表达情况。结果1.不同剂量X射线对ECA109和KYSE150细胞的生物学行为影响具有差异,与0 Gy组比较:2 Gy X射线辐照后48 h,ECA109细胞的增殖无显着抑制（p>0.05）,而KYSE150细胞增殖被显着抑制（p<0.05）;ECA109细胞在4 Gy辐照后48h细胞周期发生阻滞（p<0.05）,而KYSE150细胞在2和4 Gy辐照后48 h均出现细胞周期阻滞（p<0.05）;ECA109细胞经4 Gy辐照后48 h细胞凋亡显着增加（p<0.05）,而KYSE150细胞在2和4 Gy辐照后48 h细胞凋亡均显着增加（p<0.05）;2 Gy X射线对ECA109细胞侵袭和迁移的影响无显着变化（p>0.05）;2 Gy组ECA109细胞γH2AX焦点差异有统计学意义（p<0.05）;Bax,Bcl-2和STAT3蛋白表达量变化无明显差异（p>0.05）。2.本研究选用2 Gy X射线辐照后48 h的ECA109细胞行蛋白组学检测分析,获得差异表达蛋白399个（215个下调,184个上调）,其中LIF的表达差异显着（p=0.0003）,并且通过GO和KEGG通路富集分析显示LIF参与STAT3信号通路。3.临床血清样本检测结果显示:ESCC患者血清LIF浓度放疗前后分别为0.5224±0.1983μg/ml和0.3861±0.1506μg/ml,均高于健康对照者（0.3233±0.0985μg/ml）（p<0.05）;ESCC患者血清LIF浓度与肿瘤T分期、N分期、临床分期、组织学分级具有相关性（p<0.05）;13例患者放疗后血清LIF浓度较放疗前升高,47例患者放疗后血清LIF浓度较放疗前降低,血清LIF浓度升高组和下降组在随访期内（36个月）局部复发率分别为69.2%（9/13）和34.0%（16/47）,（p=0.023）;两组患者肿瘤远处转移率分别为53.8%（7/13）和23.4%（11/47）（p=0.034）。两组患者1、2、3生存率分别为76.9%、46.2%、30.7%和85.1%、66.0%、46.8%（p=0.048）。4.敲低ECA109细胞中LIF结果显示:下调LIF可诱导ECA109细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,与对照组比较,差异显着（p<0.05）。同时,下调LIF可降低ECA109细胞中STAT3的表达量（p<0.05）。5.不同剂量碳离子辐照ECA109细胞结果显示:与0 Gy组比较,2和4 Gy碳离子可诱导ECA109细胞凋亡,阻滞细胞周期在G2期,抑制ECA109细胞增殖、迁移和侵袭能力（p<0.05）。转录和翻译水平检测结果显示:2和4 Gy碳离子可显着下调ECA109细胞中LIF、p-STAT3、STAT3和MMP2表达量,上调E-cadherin表达量（p<0.05）。结论1.2 Gy X射线对食管鳞癌ECA109细胞增殖和转移的抑制作用不显着,辐照后细胞中γH2AX表达显着上调,STAT3表达变化不显着。2.LIF在2 Gy X射线辐照后的食管鳞癌ECA109细胞中表达下调;血清LIF浓度与ESCC患者局部复发、远处转移和预后具有相关性。3.食管鳞癌ECA109细胞中低表达的LIF通过靶向STAT3分子,介导STAT3信号通路调控食管鳞癌ECA109细胞的生物学行为。4.高LET碳离子通过下调食管鳞癌ECA109细胞中的LIF,诱导STAT3信号通路中相关分子的表达,从而调控食管鳞癌ECA109细胞的增殖和转移。
刘振华[4]（2019）在《TIGAR在胃癌发生发展中的机制研究》文中提出研究背景和目的胃癌是世界上第四大常见恶性肿瘤,癌症致死率居第二位。目前胃癌的治疗仍然是以手术为主的综合治疗,然而,即使是最大限度的三联疗法,胃癌的预后仍然很差,进展期胃癌中位生存时间为10-14个月。而且手术只是从形态学上消灭已经发生的肿瘤,不能从根本上防止或抑制肿瘤的发生。基于肿瘤发生机制的靶向治疗已被看作是近三十年来人们在癌症病因学方面对机制研究取得显着进步的标志性成果之一。每一种靶向药物都是针对肿瘤细胞的某一个特定的功能,其特点就是特异性强,缺点是作用都是暂时的,之后不可避免的会出现肿瘤复发。复发原因之一是肿瘤的某一种标志性功能通常是由多条信号通路调控的,而一个靶向药物只抑制了其中一条关键通路;复发原因之二是癌细胞适应性的从对某一特定功能的依赖向对另外一种功能依赖的转变,从而限制了靶向药物的疗效,这是肿瘤复发的又一重要原因。这也提示我们在开发药物和设计治疗方案时,将癌细胞不同的特定功能和与每一种功能相关的多条生化通路综合到一起考虑是有益的。到目前为止,尚没有任何一种药物可以持续有效作用,最终不可避免的会出现耐药,而且也没有任何一种药物可以完全抑制肿瘤的生长。这就要求我们继续寻找更多的通路,更多的靶点,开发更多的靶向药物,选择性的同时靶向多个核心和特定功能,联合用药,对于治疗肿瘤将会更有效,更持久。代谢的改变在肿瘤发生发展过程中的重要作用越来越明白,在每个被研究的多细胞生物中都有很多关于信号通路和代谢调控之间存在交联的证据,代谢直接或间接地参与了细胞的每一个活动。癌基因的激活和抑癌基因的失活直接影响癌细胞的代谢和生长。p53作为一个抑癌基因,近年来在代谢调节方面的作用逐渐被重视。p53可以通过调控下游多个基因来调节代谢,通过激活SCO2/GLS2/Parkin来促进氧化磷酸化,通过抑制GLUT1/3/4阻断葡萄糖的摄取,通过促进TIGAR表达来抑制糖酵解。总体上p53抑制肿瘤的作用与其在代谢方面的作用有关,但在代谢应激的时候可以通过降低ROS水平和维持能量动态平衡,对于正常细胞和肿瘤细胞都是有保护作用的,p53的作用类似一把双刃剑。TP53诱导酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator gene,TIGAR）是在p53活化后通过基因表达微阵列分析发现的,作为p53的靶基因,作用与其类似,具有两面性,既有通过抑制糖酵解发挥抑制肿瘤的作用,同时又可以通过抑制ROS聚集,增加GSH:GSSG比值,增加核苷的合成来发挥促进肿瘤细胞增殖和再生的功能。而且TIGAR对糖酵解和ROS的调节作用依赖于细胞类型,这也是肿瘤异质性的一个表现,不同的肿瘤和同一肿瘤内部不同部位,其代谢方式是不完全相同的。目前已有TIGAR在脑胶质瘤、肝癌、头颈肿瘤、骨肉瘤、乳腺癌、血液系统疾病及结肠癌中的作用的研究,TIGAR在胃癌中作用的研究尚未见报道。TIGAR在胃癌中的表达的研究已有报道,但仅有其在肿瘤中的表达情况的结果而无正常对照,且未进行更深入的功能和机制研究。TIGAR除了受p53调控之外,也参与其他的一些信号 通路。在鼻咽癌细胞中,抑制C-Met,导致TIGAR蛋白表达更低,NADPH下降和细胞死亡增加,另外,在HeLa细胞中也证明TIGAR蛋白的表达受PI3K-AKT-mTORC通路的调控。AKT是被整合素活化的一个下游的丝氨酸苏氨酸激酶,参与细胞的凋亡抑制、增殖、转移以及多个其它进程。AKT2的激酶结构域的体细胞突变在人类癌症中广为报道,其过度激活是人类恶性肿瘤中最常见的分子表现。胃癌中,AKT和pAKT的表达在肿瘤中的检出率分别是74%和78%。在一个50例进展期胃癌的报告中,pAKT表达与肿瘤浸润深度、淋巴结受累数量以及不良结局有显着相关性。核pAKT表达也被发现与凋亡指数呈负相关。这条通路不仅在胃癌的生物学上有重要意义,同时也参与了 TIGAR的调控。本研究拟通过免疫组化和Western blotting方法检测胃癌组织及癌旁组织标本中TIGAR表达情况;并通过组织芯片技术探讨TIGAR与肿瘤分期及预后等的相关性;构建TIGAR敲低的胃癌细胞系进行体外实验,探讨TIGAR对于胃癌生长的作用,并进一步研究探讨其作用机制。方法第一部分:首先采用免疫组化和Western blotting方法检测胃癌组织及癌旁标本中的TIGAR表达情况,发现TIGAR在胃癌组织中表达升高,并进一步在组织芯片中检测了其表达情况及与肿瘤分期和预后的关系。第二部分:采用胃癌细胞株在体外进行TIGAR的功能实验,采用慢病毒转染的方法构建TIGAR敲低和过表达的细胞系,然后分别用MTT法检测细胞生长情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力及生长速度,用流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡情况,体内成瘤实验检测TIGAR对成瘤能力的影响。第三部分:检测TIGAR敲低后pAKT、Cyclin D1、BCL-2等蛋白以及NADPH和ROS的变化以探讨其作用机制。统计学处理采用Kaplan-Meier生存分析法和log-rank统计检验进行生存期单因素分析,P值<0.05为差异有统计学意义;卡方检验分析TIGAR在癌和癌旁组织中的表达情况,P<0.05为差异有统计学意义。Western blotting 结果通过 Image Studio Lite,PS,AI 进行数据处理,通过prism5,SPSS 22.0对实验结果进行统计学处理和分析。结果第一部分:TIGAR在胃癌组织中的表达及与临床预后的关系1.TIGAR在人胃癌组织标本中高表达。Western blotting检测32例临床新鲜胃癌标本及癌旁对照中,有18例标本TIGAR表达在癌组织中要高于癌旁组织。免疫组化检测42例石蜡标本中,TIGAR蛋白表达水平在癌组织中要显着高于癌旁组织（采用卡方检验,P<0.01）。2.TIGAR表达与胃癌病人生存期显着相关,其高表达与不良预后相关。结果显示,TIGAR高表达组与低表达组病例在平均年龄（P=0.04）,肿瘤病理N分期（P=0.002）,临床AJCC分期（P=0.015）之间有显着差异,且具有统计学意义;TIGAR相关的单因素多因素结果分析显示胃癌病人生存期与病人年龄（P=0.034）,肿瘤大小（P=0.036）,组织学分级（P=0.001）,肿瘤 T 分期（P=0.008）,N分期（P=0.000）,M分期（P=0.014）,临床AJCC分期（P=0.000）,TIGAR表达（P=0.034）之间有显着相关性;TIGAR高表达的病人的生存期显着低于TIGAR低表达组病人（P=0.033）。第二部分:TIGAR在胃癌细胞中的功能研究1.TIGAR在人胃癌细胞株中存在高表达现象。2.TIGAR敲低抑制体内体外AGS和SGC7901细胞增殖和克隆形成。体外实验证明,TIGAR敲低后的细胞生长明显减慢,TIGAR过表达组增殖加快;克隆形成实验表明TIGAR敲低的细胞系其克隆形成能力明显减弱,而过表达组克隆形成能力增强。体内成瘤实验结果显示从一开始TIGAR敲低细胞的成瘤速度就要比未敲低细胞慢,且从14天开始,对照组生长速度明显加快,而TIGAR敲低组肿瘤生长速度比较平缓。3.TIGAR提高癌细胞拮抗氧化应激的能力,增加胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性。结果显示,凋亡细胞的比例在经H202处理后,在早期和总的凋亡分区里是增高的（P<0.05）。同时,凋亡细胞的百分比在TIGAR被敲低后的细胞中,在早期和总的凋亡分区里也是显着增高的（P<0.001）。这些结果表明,TIGAR保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡。TIGAR敲低和2-DG联合应用显着增加了细胞凋亡。结果表明TIGAR低表达使胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性增加。4.TIGAR敲低诱导体外SGC7901和AGS细胞G2/M期周期阻滞。用流式细胞术检测SGC7901细胞周期分布结果显示,G0/G1,S,G2/M期细胞比例分别为53.4%,30.21%,16.07%;将TIGAR敲低后,结果显示在SGC7901 shRNA TIGAR B6 组中,G0/G1,S,G2/M 期细胞比例分别为 47.13%,28.55%,23.98%;在SGC7901 shRNA TIGAR B5 组中,G0/G1,S,G2/M 期细胞比例分别为 50.69%,27.09%,22.07%。与正常SGC901细胞相比,TIGAR敲低后,G0/G1期细胞比例显着减少（p<0.01）,G2/M期细胞比例显着增多（p<0.05）,S期细胞略有增多,表明细胞被阻滞在G2/M。在AGS细胞系中也观察到G2/M期细胞显着增多（p<0.05）。第三部分:TIGAR在胃癌细胞中作用的机制研究1.TIGAR敲低导致NADPH产生减少和ROS生成增加,从而诱导细胞凋亡。结果显示,TIGAR敲低后显着减少了 NADPH的产生,导致细胞NADPH/NADP+比率下降,ROS生成增加。与体外实验结果一致,体内数据表明TIGAR敲低后显着减少了体内成瘤标本中NADPH/NADP+的比率（p<0.05）,说明TIGAR敲低后,细胞磷酸戊糖通路受到抑制,致使NADPH产量减少,ROS生成增加,从而诱导细胞凋亡。2.TIGAR敲低减少Cyclin D1表达,诱导SGC7901和AGS细胞周期阻滞,减少BCL-2表达诱导细胞凋亡。体外实验结果表明,TIGAR敲低后,BCL-2以及Cyclin D1有明显的表达下降。从体内成瘤的标本里提取蛋白检测,与体外实验的结果一致,在检测的蛋白中,BCL-2以及Cyclin D1有明显的表达下降。结论1.TIGAR在大部分胃癌组织中高表达,其高表达与胃癌不良临床预后相关。2.TIGAR在人胃癌细胞株中存在高表达现象。3.TIGAR敲低通过NADPH产生减少、ROS生成增加、BCL-2表达下调从而诱导SGC7901和AGS细胞凋亡。4.TIGAR敲低通过减少Cyclin D1表达诱导SGC7901和AGS细胞周期阻滞从而抑制细胞增殖。5.TIGAR敲低增加胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性。
陈秋惠[5]（2019）在《巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究》文中研究指明巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是一种大戟科橡胶树属的、多年生的、能生产天然橡胶的热带经济乔木。前人已构建有多张遗传图谱,大多数图谱都分为18条连锁群,而少数分为22或23条不等的连锁群。因此,就会存在多个连锁群对应一条染色体的情况,连锁群上的遗传标记在染色体上的真实位置也尚未清楚。橡胶树分子细胞遗传图谱是研究橡胶树的基因组学和橡胶树遗传发育的重要工具,能够揭示连锁群与染色体的对应关系,遗传标记在染色体上的排布及真实的物理位置,为橡胶树基因克隆和标记辅助育种提供了宝贵的理论依据。本研究选择了 Lespinasse等（2000）构建的巴西橡胶树遗传图谱中的第1 1号、第13号和第14号三个连锁群上的26个遗传标记,其中24个RFLP标记,2个SSR标记。通过荧光原位杂交和原位PCR的定位检测,经核型整合分析,构建了第1 1号、第13号和第14号三个连锁群的分子细胞遗传图。具体研究结果如下:（1）利用生物信息学方法,在NCBI上找到26个标记的DNA序列,并通过NCBI的Blast在线比对,获取含有标记在内的2500-3500bp左右大小的DNA序列进行引物设计,经电泳检测、生物公司PCR产物测序和序列比对等过程,最终筛选出特异性最强的26对引物。（2）利用FISH检测方法对第1 1号连锁群上的4个遗传标记MnSoD、M613、gHbCIR295.PB和gHbCIR636进行物理定位,结果全部定位在巴西橡胶树热研7-33-97第16号染色体上。遗传标记MnSoD和gHbCIR295.PB位于染色体短臂上,标记信号与着丝粒的平均百分距离依次是63.82和46.27;gHbCIR636和M613位于染色体长臂上,标记信号与着丝粒的平均百分距离分别为28.34和65.82。由此可知,第11号连锁群与第16号染色体存在对应关系,并构建了 16号染色体的细胞遗传图谱。（3）从第13号连锁群中选取了 9个遗传标记gHbCIR671.L2、gHbCIR402、gHbCIR506.L2、gHbCIR31、gHbCIR333、gHbCIR287、gHbCIR360、gHbCIR303 和gHbCIR670.PB进行荧光原位杂交实验。经核型分析,9个标记均定位在了巴西橡胶树热研7-33-97第18号染色体上,其中gHbCIR671.L2和gHbCIR31位于18号染色体的短臂上,标记信号与着丝粒平均百分距离分别是57.22和11.27;而余下7个标记 gHbCIR402、gHbCIR506.L2、gHbCIR287、gHbCIR360、gHbCIR333、gHbCIR303和gHbCIR670.PB均位于18号染色体的长臂上,标记信号与着丝粒平均百分距离分别是 8.39、23.51、29.14、40.18、41.65、60.48 和 60.59。由此可知,13 号连锁群与热研7-33-97的第18号染色体对应关系,并构建了 18号染色体的细胞遗传图谱。（4）从第14号连锁群上共选取了 13个遗传标记,gHbCIR686、gHbCIR425、gHbCIR261、gHbCIR682.L2、gHbCIR631.L2、gHbCIR330、gHbCIR412-493、gHbCIR602、gHbCIR20.L1、gHbCIR290、gHbCIR409415 和 gHbCIR644 用 FISH 检测方法,gHbCIR365.L2进行原位PCR检测。结果显示,14号连锁群上的13个遗传标记均位于第12号染色体上,其中gHbCIR686、gHbCIR365.L2、gHbCIR425、gHbCIR261、gHbCIR631.L2位于第12染色体短臂上,信号位点到着丝粒平均百分距离分别是 32.67、44.56、31.53、29.10 和1 1.46;gHbCIR682.L2、gHbCIR330、gHbCIR412493、gHbCIR602、gHbCIR20.L1、gHbCIR290、gHbCIR409415和gHbCIR644位于长臂上,信号位点到着丝粒平均百分距离分别是9.87、45.59、53.82、48.40、53.24、55.24、65.51和75.74。由此可知,第14号连锁群与第12号染色体存在对应关系,并构建了 12号染色体的细胞遗传图谱。
黄艳霞[6]（2018）在《LncRNA AK023391介导氧化苦参碱调控胃癌的分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:胃癌是常见的消化道肿瘤,其发病率高,预后差。近年来,人们研究发现长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤的发展进程中作用显着,我们课题组前期研究发现lncRNA AK023391（AK023391）在胃癌组织中高表达,而氧化苦参碱具有良好的抗胃癌作用,因此本研究通过探讨AK023391在胃癌组织及细胞系中的表达,并观察其对胃癌细胞生物学行为的影响。进一步探讨AK023391在胃癌细胞中的作用机制,并探讨氧化苦参碱调控胃癌细胞增殖及侵袭的分子机制,为胃癌治疗提供新的药物靶点。方法:1.应用原位荧光杂交技术（FISH）检测胃癌组织芯片中lncRNA AK023391的表达,并进行临床病理特征和预后分析。应用qPCR技术检测胃癌细胞系及正常胃粘膜组织中lncRNA AK023391的表达水平。2.通过慢病毒shRNA干扰AK023391在胃癌细胞系中的表达,并通过细胞增殖、迁移、侵袭等体外实验及裸鼠成瘤体内实验验证AK023391对胃癌细胞生物学功能的影响。3.应用全基因组表达谱芯片检测干扰lncRNA AK023391表达后,差异基因的表达,并使用KEGG通路分析富集基因,推断其下游靶基因,并使用Western blot技术进行验证。4.过表达AK023391后,设立不同组别,进行MTT、Transwell、Western blot实验检测氧化苦参碱对胃癌细胞的增殖和侵袭作用。研究结果:1.通过FISH检测,我们统计77例胃癌患者组织芯片发现lncRNA AK023391在45例胃癌患者的癌组织中的表达明显高于癌旁组织,同时,其在胃癌细胞系中的表达高于正常胃粘膜组织（P<0.05）。且多变量Cox回归模型表明AK023391的表达水平可作为胃癌患者生存的独立预后因素。2.干扰lncRNA AK023391的表达后（sh-AK023391）,在体外,CCK-8及克隆形成实验发现其可抑制胃癌细胞的增殖,Transwell实验证明sh-AK023391可降低胃癌细胞的侵袭能力,划痕实验表明sh-AK023391具有降低胃癌细胞迁移能力。同时,体内裸鼠成瘤实验结果表明,sh-AK023391可抑制肿瘤的生长。3.干扰AK023391表达后,全基因组表达谱芯片检测差异基因表达,发现共有394条基因明显上调,676条基因明显下调。使用KEGG通路分析富集,PI3K/AKT信号通路明显富集,推断该通路可能为lncRNA AK023391作用的途径,并在Western blot上得到验证。4.氧化苦参碱能抑制lncRNA AK023391的表达水平,在lncRNA过表达后,予以氧化苦参碱处理,AK023391抑制胃癌细胞增殖及侵袭的能力被削弱,推断氧化苦参碱抑制胃癌增殖和侵袭的作用可能与下调lncRNA AK023391的表达水平有关。结论:LncRNA AK023391在胃癌组织和胃癌细胞系中高表达,可作为胃癌患者独立预后因素,且其具有促进胃癌细胞增殖和侵袭的作用。LncRNA AK023391主要通过PI3K/AKT通路调控胃癌细胞的生物学行为。氧化苦参碱的抗胃癌机制可能与下调lncRNA AK023391表达,抑制lncRNA AK023391调控的PI3K/AKT通路相关,该研究为胃癌的治疗和药物筛选提供了有价值的重要靶点。
刘泽涵[7]（2018）在《CHD1L在人食管癌中的临床意义和生物学功能研究》文中研究说明背景:食管癌（Esophageal Carcinoma EC）是一种威胁人类健康和生命常见恶性肿瘤。我国食管癌以鳞状细胞癌多见,我国亦是食管癌发病率和死亡率较高的国家之一。食管鳞癌（Esophageal Squamous cell carcinoma,ESCC）是其最常见的组织学类型,对于早期食管癌的预后较好,中晚期患者手术、放化疗等治疗的预后极差。正是因为食管癌的发病率及死亡率较高,使得它的病因学研究就成为肿瘤研究的热点。染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因（Chromosomal helicase/ATPase DNA binding protein1-like CHD1L）是新发现的一种癌基因位于chr1q21,它在许多实体肿瘤中扩增。CHD1L是SNF-2类家族成员,具有高度保守的解旋酶功能,可调控转录、重组染色质并调节DNA与蛋白质之间的相互作用。已有研究表明,CHD1L在肝癌中表达比正常肝脏组织中高,且与组织分化程度和临床分期呈正相关,并可提高肿瘤细胞的转移和侵袭。然而,在食管癌中CHD1L蛋白表达及其临床意义是不确定的,更缺乏CHD1L在食管癌细胞系中生物学功能的研究。本文首次研究了CHD1L与不同病理生理特征的食管癌的关系,并探讨CHD1L在食管癌细胞系中的生物学功能,从而为进一步的研究奠定基础。目的:（1）免疫组化检测CHD1L在不同食管癌组织中的表达情况,探讨其与食管癌发生、发展、预后的相关性;为临床诊断、治疗和预后的评估提供理论依据。（2）Westerblot检测CHD1L在不同人类食管癌细胞株中的蛋白水平的表达,为后续生物学功能的研究做准备。（3）通过siRNA转染敲低内源性CHD1L表达,探讨CHD1L基因的增殖、凋亡、迁移等生物学功能,为深入探讨该基因在食管癌发生发展中的作用机制,寻找新的食管癌生物治疗提供理论依据。材料方法:（1）免疫组织化学:通过石蜡切片技术和免疫组化-SP的方法,检测在不同食管癌患者癌组织中CHD1L表达情况。选取福建省肿瘤医院胸外科手术切除治疗的191例食管癌存档蜡块为实验对象。（2）应用SPSS 22统计软件包整理病人的临床病理资料和随访资料;运用Kaplan-Meier法（Log-rank检验）、单因素及COX多因素回归模型,对食管癌患者进行生存分析,为临床诊断、治疗和预后的评估提供理论依据。（3）Western blot:分析CHD1L在不同食管癌细胞株中蛋白水平的表达情况,并筛选出内源性高表达CHD1L基因的细胞株。实验所用的食管癌细胞株为KYSE150和EC9706。为后续探讨其生物学功能做准备。（4）以EC9706细胞株为研究对象,应用siRNA转染技术、细胞划痕、CCK-8细胞增殖、流式细胞仪等技术和方法初步探讨CHD1L基因在人食管癌细胞中的迁移、增殖、凋亡等生物学功能。结果:（1）免疫组化结果表明:不同食管癌组织中CHD1L表达程度不同,且其表达随肿瘤恶性程度增高而增高（P<0.05）。CHD1L表达与食管癌的分化程度、临床分期和淋巴结有无转移相关（P<0.01）。CHD1L的表达与食管癌患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤大体分型均无相关性（P>0.05）,差异无统计学意义。（2）影响预后的单因素分析表明:CHD1L蛋白的高表达对食管癌患者的总生存率（包括3年生存率、5年生存率）均具有非常显着的影响（P<0.01）;食管癌临床分期、分化程度及淋巴结转移情况对患者的预后有显着的影响（P<0.01）。而食管癌患者的年龄、性别、肿瘤大体分型、肿瘤大小、肿瘤病变部位对其预后无明显的影响（P>0.05）,差异无统计学意义。（3）影响预后的多因素Cox模型分析表明:食管癌患者肿瘤的分化程度、病理分期及淋巴结转移情况是对其生存有影响的危险因素（P<0.05）,差异有统计学意义。（4）Westernblot结果表明:EC9706细胞株中的内源性CHD1L基因在蛋白水平的表达显着高于KYSE150细胞株（P<0.05）,差异有统计学意义。（5）siRNA转染实验结果表明:CHD1L-siRNA#4（5’-ACAAACTCTTGCAGCCATT-3’）序列可有效敲低内源性的CHD1L蛋白水平的表达（P<0.01）,差异有统计学意义。（6）细胞划痕实验结果表明:与未敲低CHD1L组相比,敲低CHD1L可有效降低食管癌细胞系的迁移能力（P<0.01）,差异有统计学意义。（7）细胞增殖实验结果表明:与未敲低CHD1L组及未做任何处理组相比,敲低CHD1L可有效降低食管癌细胞增殖能力（P<0.01）,差异有统计学意义。（8）细胞凋亡实验结果表明:与未敲低CHD1L组相比,敲低CHD1L可有效提高食管癌细胞凋亡水平（P<0.01）,差异有统计学意义。结论:（1）CHD1L的表达与食管癌有关:CHD1L表达随肿瘤恶性程度增高而增高;而CHD1L的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤大体分型均无统计学意义。（2）CHD1L高表达、临床分期、分化程度及淋巴结转移是影响食管癌预后的独立危险因素,可作为判断预后的可靠指标。（3）食管癌患者的年龄、性别、肿瘤大体分型、肿瘤大小、肿瘤病变部位与患者的预后均无统计学意义。（4）人食管癌细胞株EC9706中的CHD1L蛋白表达水平显着高于KYSE150细胞株。EC9706细胞株可作为后续深入功能学研究的良好材料。（5）CHD1L在人食管癌细胞中的高表达可促进肿瘤细胞迁移、增殖能力,抑制凋亡水平,从而为寻找人食管癌的生物学治疗方法提供了有意义的实验依据。
陈怡羽[8]（2017）在《microRNA-374a靶向CCND1失活PI3K/AKT通路抑制结肠癌的发展》文中认为背景:结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年升高的趋势,目前对结肠癌具体发病机制仍有很多尚待明确的地方。microRNA-374a（miR-374a）在不同肿瘤中发挥不同的作用,如在乳腺癌中miR-374a可促进EMT的发生,在胃癌中促进细胞增殖,在鼻咽癌中却可抑制细胞增殖、转移,增加细胞对顺铂的敏感性,而miR-374a在结肠癌中的作用有待我们去研究。目的:1.体内外功能实验研究miR-374a在结肠癌中的作用;2.探究miR-374a在结肠癌中发挥作用的机制;3.找到miR-374a在结肠癌中作用的靶基因及miR-374a如何通过靶基因调控相关通路;4.分析miR-374a和靶基因在结肠癌组织中表达的相关性及对预后的影响。方法:1.体内外功能实验研究miR-374a在结肠癌中的作用（1）在HCT116和SW620中构建稳定过表达miR-374a的细胞株;（2）体外实验验证miR-374a对细胞增殖、侵袭和迁移的影响;（3）裸鼠皮下成瘤和肝包膜转移模型验证miR-374a对细胞增殖和肝内转移能力的作用,并用免疫组化检测肝内肿瘤的EMT相关因子;（4）转染miR-374a inhibitors进行功能回复实验。2.探究miR-374a在结肠癌中发挥作用的机制:Western Blot检测增殖和EMT相关蛋白表达改变并找到相关通路。3.找到miR-374a在结肠癌中作用的靶基因及miR-374a如何通过靶基因调控相关通路（1）生物学软件预测miR-374a的靶基因并进行双荧光素酶报告验证;（2）Western Blot检测干扰靶基因后周期、EMT蛋白表达及相关通路的改变,功能实验检测干扰靶基因对细胞功能的影响。（3）Western Blot检测重新表达靶基因后周期、EMT蛋白表达及相关通路的改变,功能实验检测重新表达靶基因对细胞功能的影响。4.分析miR-374a和靶基因在结肠癌组织中表达的相关性及对预后的影响（1）免疫组化观察miR-374a和靶基因在结肠癌组织表达定位和表达量差异;（2）结合miR-374a和靶基因的表达分析两者相关性及对预后的影响。结果:1.miR-374a在体内外均抑制结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和肝内转移能力;2.miR-374a抑制PI3K/AKT通路及下游周期、EMT相关因子;3.miR-374a通过靶向CCND1来抑制PI3K/AKT通路;4.在结肠癌组织中,miR-374a与CCND1表达呈负相关,且miR-374a高表达、CCND1低表达的患者预后最好。结论:miR-374a在结肠癌中发挥一个潜在的抑癌基因的作用,它可通过靶向CCND1使PI3K/AKT通路失活,从而抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
魏巍[9]（2017）在《喉鳞癌组织中HDAC6、α-Tubulin、HSP90、Cortactin的表达及临床意义》文中认为目的通过检测喉鳞癌组织和声带息肉组织中组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6,HDAC6）、α-微管蛋白（α-tubulin）、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）及皮动蛋白（cortactin）的表达情况,探讨其与喉鳞癌患者临床病理特征的关系。方法收集2008年至2016年在华北理工大学附属医院耳鼻喉头颈外科接受手术治疗且组织学证实为喉鳞癌的患者的病理标本共55例作为实验组,同期收治的声带息肉患者病理标本41例作为对照组。应用免疫组织化学方法对HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin在喉鳞癌组织及声带息肉组织的表达情况进行定性检测。结果1 HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin在喉鳞癌组织中的阳性表达率分别为78.2%、65.5%、67.3%、58.2%,在声带息肉组织中的阳性表达率分别为34.1%、26.8%、22.0%、17.1%,HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin在喉鳞癌组中的阳性表达率明显高于声带息肉组,两组比较差异有显着统计学意义（P<0.01）。2Ⅲ期、Ⅳ期喉鳞癌组织中HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin的阳性表达率均高于Ⅰ期、Ⅱ期,两者比较差异均有统计学意义（P<0.05）。HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin阳性表达率随着分化程度的而降低而逐渐升高,三者比较差异有统计学意义（P<0.05）。3 HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin在喉鳞癌组织中的阳性表达率与患者年龄、性别及肿瘤原发部位均无关。结论1在喉鳞癌组织与声带息肉组织中HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin均有表达,两组比较差异均有显着统计学意义（P<0.01）。2除α-tubulin与cortactin组外,HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin两两比较表达均具有相关性。3在喉鳞癌组织中HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin的表达情况均与喉鳞癌组织的临床分期及分化程度密切相关,与患者年龄、性别、肿瘤原发部位均无关。
沈耿[10]（2016）在《猪苓活性成分通过调节HuR介导T24细胞增殖抑制和凋亡》文中研究说明目的：猪苓是药用真菌,具有增强免疫、抗肿瘤功能等作用,临床应用于膀胱癌的治疗取得了较好疗效,但其作用机制尚未完全阐明。猪苓的主要化学成分是多糖和甾体类,另外还有蛋白质、生物素等。本实验主要研究猪苓活性成分通过调节HuR介导膀胱癌T24细胞增殖抑制和凋亡的机制。通过实验达到如下目的：1、研究HuR能否调控T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达。2、研究猪苓多糖能否通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达。3、研究麦角甾醇能否通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达。方法：1、研究HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节T24细胞用无抗生素的培养基培养24小时后进行转染实验,实验设空白对照组（未做任何处理）、阴性对照组（用阴性对照质粒转染）、HuR质粒转染组（用HuR质粒转染）。用Western blotting检测各组HuR的表达,检验过表达的效果。构建HuR过表模型,于过表达HuR后相应时间点用放线菌素D（Actinomycin D）终止RNA的合成,并于处理后的0h、2h、4h、6h四个时间点分别收集细胞提取RNA,以RT-PCR的方法检测BCL-2 mRNA的半衰期,研究HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。构建HuR过表达模型,于过表达HuR后24h用RT-PCR测定BCL-2 mRNA表达,用Western blotting检测BCL-2蛋白的表达,分析HuR过表达后BCL-2 mRNA和蛋白表达量的变化。2、研究HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节T24细胞用无抗生素的培养基培养24小时后进行转染实验,用siHuR转染T24细胞,实验设空白对照组（未做任何处理）、阴性对照组（加入阴性对照siRNA）、 siHuR处理组（加入针对HuR编码区的siRNA）。转染24h后,用Actinomycin D终止RNA的合成,后按预定时间点检测BCL-2 mRNA的含量,并计算其半衰期,研究HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。构建构建HuR基因沉默模型,用RT-PCR测定HuR基因沉默对T24细胞BCL-2mRNA表达的影响,用Western blotting检测HuR基因沉默对T24细胞BCL-2蛋白的表达的影响。3、研究猪苓多糖（polyporus polysaccharide, PPS）通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达T24细胞常规培养后分4组,对照组（正常培养的细胞,未做任何处理）、PPS低剂量组（加入50μg/mL PPS）、PPS中剂量组（加入.100μg/mL PPS）、PPS高剂量组（加入200μg/mL PPS）。在进行细胞药理实验前,采用MTT法绘制细胞生长曲线,以掌握T24细胞的生长特性和确定合理的细胞接种密度,然后分别用Hoechst染色、流式细胞分析技术检测不同浓度PPS对T24细胞凋亡的影响。研究PPS对T24细胞BCL-2基因表达的影响：用Western blotting和RT-PCR技术,分别检测不同浓度PPS对T24细胞BCL-2蛋白和BCL-2 mRNA的影响。研究PPS对T24细胞BCL-2mRNA稳定性的影响：用Actinomycin D阻抑转录,用RT-PCR测定各处理组细胞BCL-2 mRNA的相对表达量。分别以各组0h的mRNA含量为100%,得到2、4、6h各时间点相对Oh的mRNA剩余含量,检测BCL-2mWh的半衰期,以确定PPS对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响。研究PPS对HuR在T24细胞内定位的影响：各实验组细胞经不同浓度PPS处理24 h后,收集细胞,分段提取胞浆、胞核蛋白,Western blotting分析胞浆、胞核HuR蛋白的表达,以确定PPS对HuR在T24细胞内定位的影响。研究PPS对T24细胞内HuR-mRNA复合物中BCL-2mRNA的含量：裂解细胞制备含mRNP的裂解液,预清除非特异性抗原,用抗体包被琼脂糖徽球,免疫沉淀后进行沉淀产物mRNA的纯化和目的基因的PCR扩增,以确定PPS对T24细胞内BCL-2 mRNA与HuR结合的影响。4、麦角甾醇通过HrR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达T24细胞常规培养后分3组,实验分3组,对照组（正常培养的细胞,未做任何处理）、0.5 μ M麦角甾醇组、1μM麦角甾醇组。分别用MTT染色、流式细胞分析技术检测麦角甾醇对T24细胞增殖的影响；用Western blotting和RT-PCR技术,分别检测不同浓度麦角甾醇对T24细胞cyclin D1蛋白和cyclin D1mRNA的影响。研究麦角甾醇对T24细胞cyclin D1 mRNA稳定性的影响：用Actinomycin D阻抑转录,用RT-PCR测定各处理组细胞cyclin Dl mRNA的相对表达量。分别以各组Oh的mRNA含量为100%,得到2、4、6h各时间点相对Oh的mRNA剩余含量,检测cyclin D1 mRNA的半衰期,以确定麦角甾醇对T24细胞cyclin D1 mRNA稳定性的影响。研究麦角甾醇对HuR在T24细胞内定位的影响：各实验组细胞经不同浓度麦角甾醇处理48 h后,收集细胞,分段提取胞浆、胞核蛋白,Western blotting分析胞浆、胞核HuR蛋白的表达,以确定麦角甾醇对HuR在T24细胞内定位的影响。研究麦角甾醇对T24细胞内HuR-mRNA复合物中cyclin D1 mRNA的含量：裂解细胞制备含mRNP的裂解液,预清除非特异性抗原,用抗体包被琼脂糖徽球,免疫沉淀后进行沉淀产物mRNA的纯化和目的基因的PCR扩增,以确定麦角甾醇对T24细胞内cyclin D1 mRNA与HuR结合的影响。结果：1、HuR过表达可提高T24细胞BCL-2 mRNA的稳定性,增加BCL-2 mRNA和蛋白的表达。HuR过表达后,空白对照组与阴性对照组比较,BCL-2 mRNA衰减速度、BCL-2 mRNA和蛋白的表达量没有明显变化；与空白对照组和阴性对照组相比,HuR过表达组BCL-2 mRNA衰减速度明显减慢,BCL-2mRNA和蛋白的表达量明显增高（P<0.05）。2、HuR沉默可降低T24细胞BCL-2 mRNA的稳定性,减少BCL-2 mRNA和蛋白的表达。HuR沉默后,空白对照组与阴性对照组比较,BCL-2 mRNA衰减速度、BCL-2 mRNA和蛋白的表达量没有明显变化；与空白对照组和阴性对照组相比,HuR沉默组BCL-2 mRNA衰减速度明显加快,BCL-2 mRNA和蛋白的表达量明显降低（P<0.05）。3、PPS可通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达。（1）PPS可促进T24细胞凋亡。细胞在不同因素作用24 h后,用Hoechst 33342染色,对照组细胞核呈均匀染色,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组可见部分细胞染色质浓缩状态,胞核浓染,为细胞凋亡的形态。不同浓度PPS作用T24细胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI双染T24细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,与对照组相比,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组早期凋亡率与对照组相比明显增加（P<0.05）。（2）PPS可降低T24细胞BCL-2蛋白表达量。PPS作用于T24细胞24h后,与对照组比较,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL一2蛋白表达明显减少（P<0.05）。（3）PPS可降低T24细胞BCL-2 mRNA表达量。荧光定量RT-PCR检测显示,与对照组比较,PPS作用于T24细胞24 h后,PPS低剂量组与对照组没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL-2 mRNA表达明显减少（P<0.05）。（4）PPS可降低T24细胞BCL-2 mRNA稳定性。不同浓度PPS作用24h后,用放线菌素D终止mRNA的转录,分别于0h,2h,4h,6h测mRNA的含量,绘制衰减曲线,与对照组比较,PPS低剂量组与对照组BCL-2 mRNA稳定性没有明显差别,PPS中、高剂量组BCL-2 mRNA稳定性明显下降（P<0.05）。（5）PPS可减少T24细胞HuR由胞核向胞浆的移位。不同浓度PPS作用24h后,各组细胞总的HuR蛋白比较,没有明显差异,各实验组与对照组胞浆HuR蛋白比较,PPS低剂量组没有明显变化,PPS中、高剂量组表达明显减少（P<0.05）；各实验组与对照组胞核HuR蛋白比较,PPS低剂量没有明显变化,PPS中、高剂量组表达明显增加（P<0.05）。（6）PPS可降低T24细胞内BCL-2mRNA与HuR的结合量。与对照组比较,PPS作用于T24细胞24h后测定与HuR结合的BCL-2 mRNA含量,与对照组比较,PPS低剂量组没有明显差别,PPS中、高剂量组表达明显减少（P<0.05）。4、麦角甾醇可通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达。与对照组比较,麦角甾醇作用后,T24细胞增殖明显抑制（P<0.05）, cyclin D1 mRNA稳定性降低（P<0.05）,cyclin D1 mRNA及蛋白表达减少（P<0.05）, HuR总蛋白没有明显变化,但胞浆HuR蛋白表达下降（P<0.05）,胞核HuR蛋白表达升高（P<0.05）,免疫共沉淀显示cyclin D1 mRNA与HuR结合的降低（P<0.05）。结论：猪苓可通过其活性成分猪苓多糖和麦角甾醇发挥抗膀胱癌的作用。猪苓多糖可促进膀胱癌T24细胞凋亡,该作用可通过HuR介导的转录后调节途径降低T24细胞BCL-2基因的表达实现；麦角甾醇可抑制T24细胞增殖,该作用可通过HuR介导的转录后调节途径降低T24细胞cyclin D1基因的表达实现。
二、应用间期FISH技术探讨 cyclin D1基因在鼻咽癌中的扩增（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用间期FISH技术探讨 cyclin D1基因在鼻咽癌中的扩增（论文提纲范文）
（1）基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 Array-CGH的研究进展 |
| 1.1.1 CGH技术概述 |
| 1.1.2 Array-CGH技术的发展 |
| 1.1.3 Array-CGH的基本原理 |
| 1.1.4 Array-CGH的应用 |
| 1.1.5 Array-CGH的优势及局限 |
| 1.1.6 Array-CGH的前景与展望 |
| 1.2 拷贝数变异(CNVs) |
| 1.2.1 CNVs概述 |
| 1.2.2 CNVs的检测方法 |
| 1.2.3 CNVs与肿瘤 |
| 1.2.4 CNVs研究展望 |
| 1.3 喉癌的分子遗传学研究进展 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 喉癌与CNVs |
| 1.3.3 喉癌相关基因 |
| 1.3.4 展望 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究样品采集 |
| 2.1.2 临床信息采集 |
| 2.1.3 研究样品的保存 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 试剂配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 喉癌肿瘤组织标本基因组DNA提取 |
| 2.3.2 喉癌基因组DNA质量检验 |
| 2.3.3 喉癌基因组DNA和对照DNA标记 |
| 2.3.4 Array-CGH样品杂交 |
| 2.3.5 Array-CGH基因芯片的洗涤 |
| 2.3.6 Array-CGH基因芯片的扫描 |
| 2.3.7 Array-CGH数据分析 |
| 2.3.8 GEO数据提取 |
| 2.3.9 数据库数据处理 |
| 2.3.10 绘制火山图和热图 |
| 2.3.11 RT-PCR检测基因表达 |
| 2.3.12 免疫组织化学染色 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 喉癌DNA微阵列比较基因组杂交分析 |
| 3.1.1 病例资料分析 |
| 3.1.2 Array-CGH结果分析 |
| 3.1.3 基因组不平衡与临床病理特征的相关性 |
| 3.2 基于GEO数据库HNSCC差异表达基因的筛选 |
| 3.2.1 GEO数据库差异表达基因分析 |
| 3.2.2 筛选LSCC相关候选基因 |
| 3.3 检测基因在喉癌中的表达及临床意义 |
| 3.4 免疫组化结果分析 |
| 3.4.1 PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A在喉癌组织中表达情况 |
| 3.4.2 喉癌组织PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A表达与患者临床病理特征的关系 |
| 3.4.3 DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2 在喉癌组织中表达情况 |
| 3.4.4 喉癌组织DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2表达与患者临床病理特征的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）MiR-B10-3p在牛疱疹病毒5型体外潜伏感染再激活中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 牛疱疹病毒简介 |
| 1.2 牛疱疹病毒5型病原学特征 |
| 1.3 牛疱疹病毒5型分子生物学特性 |
| 1.3.1 UL区 |
| 1.3.2 US区 |
| 1.3.3 IR和TR区 |
| 1.3.4 IE基因 |
| 1.3.5 LR区 |
| 1.4 感染周期 |
| 1.4.1 急性感染 |
| 1.4.2 潜伏感染 |
| 1.4.3 再激活 |
| 1.4.4 免疫应答 |
| 1.5 诊断和疫苗 |
| 1.5.1 诊断 |
| 1.5.2 疫苗 |
| 1.6 疱疹病毒编码的miRNAs |
| 1.6.1 促进潜伏期建立 |
| 1.6.2 潜伏期维持 |
| 1.6.3 免疫逃避 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第2章 BoHV-5体外潜伏感染再激活模型建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 细胞和病毒 |
| 2.2.2 主要试剂耗材 |
| 2.2.3 试验仪器 |
| 2.2.4 培养基及实验试剂配制 |
| 2.2.5 实验动物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 传代细胞培养 |
| 2.3.2 小鼠颈上神经节(SCG)细胞的分离与培养 |
| 2.3.3 小鼠背根神经节(DRG)细胞的分离与培养 |
| 2.3.4 病毒滴度测定 |
| 2.3.5 病毒生长曲线的测定 |
| 2.3.6 间接免疫荧光 |
| 2.3.7 荧光原位杂交(FISH) |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 KM鼠 SCG和 DRG的体外培养 |
| 2.4.2 SCG和 DRG的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.4.3 KM鼠神经元细胞对BoHV-5 感染的敏感性 |
| 2.4.4 BoHV-5在SCG细胞中潜伏感染的建立 |
| 2.4.5 BoHV-5体外潜伏感染的鉴定 |
| 2.4.6 NGF的去除使BoHV-5基因组重新激活 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 牛疱疹病毒潜伏感染的模型 |
| 2.5.2 ACV和IFN-α对病毒复制的抑制 |
| 2.5.3 荧光原位杂交实验评估神经元中疱疹病毒潜伏期基因组状态 |
| 2.5.4 疱疹病毒潜伏基因组的再激活 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 BoHV-5 体外感染中miRNA的表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 本研究中所用的引物和探针 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 提取细胞总RNA |
| 3.3.2 RNA的质量鉴定 |
| 3.3.3 茎环PCR检测miRNA |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 miRNAs在上皮细胞中积累 |
| 3.4.2 SCG细胞中BoHV-5裂解感染时miRNAs的积累 |
| 3.4.3 SCG细胞中BoHV-5潜伏和再激活时miRNAs的表达 |
| 3.4.4 FISH检测MDBK和SCG细胞中BoHV-5 miRNAs |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第4章 miRNA-B10-3p在BoHV-5 体外感染中的作用研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 病毒、质粒和菌种 |
| 4.2.2 试剂和耗材 |
| 4.2.3 培养基及试剂配制 |
| 4.2.4 主要实验仪器及设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 病毒基因组的小量提取 |
| 4.3.2 病毒基因组的大量制备 |
| 4.3.3 重组病毒环状基因组提取 |
| 4.3.4 限制性片段长度多态性分析(RFLP) |
| 4.3.5 磷酸钙转染法 |
| 4.3.6 质粒转染(脂质体介导转染法) |
| 4.3.7 大肠杆菌化学感受态细胞的制备 |
| 4.3.8 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 4.3.9 质粒的提取 |
| 4.3.10 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备 |
| 4.3.11 利用BAC构建重组病毒 |
| 4.3.12 引物 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BoHV-5-BAC的构建 |
| 4.4.2 BoHV-5 miR-B10-3p靶位点UL39突变株的构建 |
| 4.4.3 miR-B10-3p对BoHV-5在上皮细胞裂解感染的影响 |
| 4.4.4 miR-B10-3p对BoHV-5在SCG神经元裂解感染的影响 |
| 4.4.5 miR-B10-3p对BoHV-5体外潜伏期的影响 |
| 4.4.6 miR-B10-3p对BoHV-5体外再激活的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 牛疱疹病毒核糖核苷酸还原酶(RR)是病毒复制的关键酶 |
| 4.5.2 BoHV-5miR-B10-3p通过抑制UL39 的表达来抑制病毒复制 |
| 4.5.3 潜伏再激活与基因组的关系 |
| 4.5.4 BoHV-5miR-B10-3p对病毒潜伏、再激活感染的作用 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 食管癌现状与治疗进展 |
| 1.1.1 食管癌流行现状 |
| 1.1.2 食管癌治疗概述 |
| 1.2 食管癌放射治疗进展 |
| 1.2.1 线性能量传递 |
| 1.2.2 X线放射治疗食管癌现状 |
| 1.2.3 碳离子物理学和生物学特性概述 |
| 1.2.4 碳离子放射治疗食管癌研究进展 |
| 1.3 蛋白质组学研究 |
| 1.3.1 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 |
| 1.3.2 蛋白质组学在食管癌中的应用 |
| 1.3.3 蛋白质组学与辐射抗性 |
| 1.4 STAT3信号通路 |
| 1.4.1 STAT3信号通路与恶性肿瘤的关系 |
| 1.4.2 STAT3信号通路与放射治疗的关系 |
| 1.5 研究思路和临床意义 |
| 第二章 X射线辐照对食管鳞癌细胞辐射应答的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 实验细胞 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 辐照处理 |
| 2.3.3 细胞克隆存活实验 |
| 2.3.4 细胞增殖实验 |
| 2.3.5 细胞周期检测 |
| 2.3.6 细胞凋亡检测 |
| 2.3.7 迁移和侵袭实验 |
| 2.3.8 免疫荧光实验 |
| 2.3.9 Western blot检测蛋白的表达变化 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 X射线对ECA109和KYSE150 细胞存活分数的影响 |
| 2.4.2 X射线对ECA109和KYSE150 细胞增殖的影响 |
| 2.4.3 X射线对 ECA109 和KYSE150细胞周期分布的影响 |
| 2.4.4 X射线对ECA109和KYSE150 细胞凋亡的影响 |
| 2.4.5 X射线对ECA109细胞迁移和侵袭的影响 |
| 2.4.6 X射线对ECA109 细胞DNA链损伤的影响 |
| 2.4.7 X射线对ECA109细胞中抗辐射相关蛋白的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 ECA109细胞中辐射抗性差异蛋白分子的筛选和鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 实验细胞 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器和耗材 |
| 3.3 实验方法和步骤 |
| 3.3.2 蛋白质的抽提 |
| 3.3.3 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.4 FASP酶解 |
| 3.3.5 TMT标记 |
| 3.3.6 High PH RP分级 |
| 3.3.7 质谱分析 |
| 3.3.8 质谱鉴定 |
| 3.3.9 数据分析 |
| 3.4 生物信息学分析方法 |
| 3.4.1 Gene Ontology(GO)功能注释 |
| 3.4.2 KEGG通路注释 |
| 3.4.3 GO注释与KEGG注释的富集分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 蛋白质质量定量检测 |
| 3.5.2 TMT标记和仪器质控 |
| 3.5.3 样本一致性评估 |
| 3.5.4 差异蛋白质的统计分析 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 食管鳞癌放疗患者血清中LIF浓度的临床意义 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 资料与方法 |
| 4.2.1 临床资料 |
| 4.2.2 治疗方法 |
| 4.2.3 主要仪器及试剂 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 临床样本特征及血清LIF浓度测定 |
| 4.3.2 食管鳞癌患者放疗前后血清LIF浓度与临床病理特征的关系 |
| 4.3.3 食管鳞患者放疗前后血清LIF浓度变化与局部复发及远处转移的关系 |
| 4.3.4 放疗后血清LIF浓度升高组和下降组生存率比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF通过靶向STAT3 在食管鳞癌细胞中生物学效应的探索 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 实验细胞 |
| 5.2.2 实验试剂及耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 实验方法和步骤 |
| 5.3.1 细胞转染试验 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 克隆形成实验 |
| 5.3.4 细胞增殖实验 |
| 5.3.5 细胞凋亡试验 |
| 5.3.6 细胞迁移和侵袭实验 |
| 5.3.7 RNA的提取及反转录 |
| 5.3.8 Western blot |
| 5.3.9 数据统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 下调LIF对细胞克隆形成的影响 |
| 5.4.2 下调LIF后对ECA109 细胞增殖的影响 |
| 5.4.3 下调LIF对 ECA109 细胞的凋亡影响 |
| 5.4.4 下调LIF对 ECA109 细胞转移的作用 |
| 5.4.5 RT-PCR检测LIF和 STAT3 的表达 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 LIF通过STAT3 信号通路调控食管鳞癌细胞对碳离子射线的辐射应答效应及机制研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 实验细胞 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 实验方法和步骤 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 辐照处理 |
| 6.3.3 细胞克隆存活试验 |
| 6.3.4 细胞增殖试验 |
| 6.3.5 细胞周期检测试验 |
| 6.3.6 细胞凋亡试验 |
| 6.3.7 细胞划痕实验和侵袭试验 |
| 6.3.8 细胞总RNA提取 |
| 6.3.9 RT-PCR试验 |
| 6.3.10 Western blot试验 |
| 6.3.11 数据统计分析 |
| 6.4 试验结果 |
| 6.4.1 碳离子对ECA109细胞克隆存活的影响 |
| 6.4.2 碳离子对ECA109细胞增殖的影响 |
| 6.4.3 碳离子对ECA109细胞凋亡的影响 |
| 6.4.4 碳离子对ECA109细胞周期阻滞的影响 |
| 6.4.5 碳离子对ECA109细胞迁移和侵袭的影响 |
| 6.4.6 碳离子对ECA109 细胞中LIF和 STAT3 相关分子转录水平的影响 |
| 6.4.7 碳离子对ECA109 细胞中LIF和 STAT3 相关分子翻译水平的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）TIGAR在胃癌发生发展中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| (一)前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TIGAR在胃癌组织中的表达及与临床预后的关系 |
| (二) 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第二部分 TIGAR在胃癌细胞中的功能研究 |
| (二) 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 第三部分 TIGAR在胃癌细胞中作用的机制研究 |
| (二) 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| (三) 结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 结论 |
| (六) 参考文献 |
| 综述 TIGAR的功能及其与肿瘤关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 橡胶树种质资源和品种选育 |
| 1.2 巴西橡胶树遗传图谱的研究进展 |
| 1.2.1 遗传图谱概述 |
| 1.2.2 遗传标记分类 |
| 1.2.3 巴西橡胶树分子遗传图谱的构建及研究现状 |
| 1.3 细胞遗传图谱的研究进展 |
| 1.3.1 细胞遗传图谱概述 |
| 1.3.2 细胞遗传图谱在植物中的应用 |
| 1.3.3 巴西橡胶树细胞遗传图谱的研究进展 |
| 1.4 分子细胞遗传图谱构建的几种关键技术 |
| 1.4.1 荧光原位杂交的应用及研究进展 |
| 1.4.2 原位PCR技术的研究进展 |
| 1.4.3 植物染色体核型分析 |
| 1.4.4 染色体标本制备方法及研究现状 |
| 1.5 本研究的目的意义与及技术路线 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 生化试剂 |
| 2.1.3 主要器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 橡胶树染色体标本的制备 |
| 2.2.2 橡胶树基因组DNA的提取及检测 |
| 2.2.3 特异性引物的设计、合成和筛选 |
| 2.2.4 特异性引物的PCR反应体系和扩增程序 |
| 2.2.5 特异性条带回收纯化 |
| 2.2.6 序列比对 |
| 2.2.7 荧光原位杂交探针的制备 |
| 2.2.8 原位PCR操作流程 |
| 2.2.9 荧光原位杂交操作流程 |
| 2.2.10 染色体上信号位点的位置计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 巴西橡胶树热研7-33-97基因组DNA的提取和纯度的检测 |
| 3.2 26个遗传标记特异序列的PCR扩增与测序比对结果 |
| 3.3 巴西橡胶树11号连锁群的4个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.3.1 M613和MnSoD遗传标记的物理定位结果 |
| 3.3.2 gHbCIR295.PB和gHbCIR636遗传标记的物理定位结果 |
| 3.4 巴西橡胶树13号连锁群的5个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.4.1 gHbCIR333遗传标记的物理定位结果 |
| 3.4.2 gHbCIR402和gHbCIR506.L2遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5 巴西橡胶树14号连锁群的9个遗传标记的物理定位分析 |
| 3.5.1 gHbCIR365.L2遗传标记原位PCR检测的物理定位结果 |
| 3.5.2 gHbCIR425遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.3 gHbCIR602遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.4 gHbCIR330和gHbCIR412_493遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.5 gHbCIR261和gHbCIR20.LI遗传标记的物理定位结果 |
| 3.5.6 gHbCIR290和gHbCIR409_415遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6 巴西橡胶树13号和14号连锁群8个遗传标记的双探针物理定位分析 |
| 3.6.1 gHbCIR671.L2和gHb_CIR644遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.2 gHbCIR631.L2和gHbCIR670.PB遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.3 gHbCIR686和gHbCIR31遗传标记的物理定位结果 |
| 3.6.4 gHbCIR682.L2和gHbCIR360遗传标记的物理定位结果 |
| 3.7 巴西橡胶树连锁群的物理定位与其对应染色体的整合 |
| 4 讨论 |
| 4.1 染色体标本制备过程中的优化 |
| 4.2 橡胶树幼叶的采摘和适于制片时间的讨论 |
| 4.3 荧光原位杂交(FISH)注意事项的讨论 |
| 4.4 遗传标记在连锁群与染色体上位置关系的讨论 |
| 4.5 对含有已定位遗传标记的基因组scaffold的染色体归属问题的讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 附图3 |
| 附图4 |
| 附图5 |
| 附图6 |
| 附图7 |
| 附图8 |
| 附图9 |
| 附图10 |
| 附图11 |
| 附图12 |
| 附图13 |
| 附图14 |
| 附图15 |
| 附图16 |
| 附图17 |
| 附图18 |
| 附图19 |
| 附图20 |
| 附图21 |
| 附图22 |
| 附图23 |
| 附图24 |
| 附图25 |
| 附图26 |
| 附录Ⅰ 主要试剂的配制 |
| 附录Ⅱ 缩略语 |
| 附录Ⅲ 项目来源与硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）LncRNA AK023391介导氧化苦参碱调控胃癌的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照 |
| 第一部分 LncRNA AK023391在胃癌中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 干扰LncRNA AK023391表达对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 LncRNA AK023391促进胃癌细胞增殖及侵袭的分子机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 LncRNA AK023391介导氧化苦参碱调控胃癌细胞的研究 |
| 引言 |
| 材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（7）CHD1L在人食管癌中的临床意义和生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、CHD1L在食管癌中表达及临床病理生理特征相关性研究 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 免疫组织化学 |
| 1.4.2 结果判定 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CHD1L在不同食管癌组织中的表达情况 |
| 2.2 CHD1L表达与食管癌患者临床病理生理特征的关系 |
| 2.3 食管癌患者的独立危险因素分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 二、CHD1L在食管癌细胞系中生物学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要细胞系 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 细胞培养 |
| 1.5.2 蛋白印迹试验 |
| 1.5.3 siRNA转染实验 |
| 1.5.4 细胞凋亡分析 |
| 1.5.5 细胞划痕实验 |
| 1.5.6 CCK-8检测细胞增殖实验 |
| 1.5.7 血球计数板细胞计数技术 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选内源性高表达CHD1L的细胞系 |
| 2.2 筛选高效率siRNA |
| 2.3 CHD1L对食管癌细胞系迁移能力的影响 |
| 2.4 CHD1L对食管癌细胞系增殖能力的影响 |
| 2.5 CHD1L对食管癌细胞系凋亡水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 全文结构 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 CHD1L基因与肿瘤研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）microRNA-374a靶向CCND1失活PI3K/AKT通路抑制结肠癌的发展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 MIR-374A抑制结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和肝内转移能力 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 材料 |
| (二) 方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结与讨论 |
| 第二章 MIR-374A负性调控PI3K/AKT信号通路及其下游周期、EMT相关因子 |
| 一、材料和方法 |
| (一) 材料 |
| (二) 方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结和讨论 |
| 第三章 MIR-374A靶向CCND1抑制PI3K/AKT通路 |
| 一、材料和方法 |
| (一) 材料 |
| (二) 方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结和讨论 |
| 第四章 在结肠癌组织中MIR-374A与CCND1负相关,且MIR-374A表达高、CCND1表达低的患者预后最好 |
| 一、材料和方法 |
| (一) 材料 |
| (二) 方法 |
| 二、结果 |
| 三、小结和讨论 |
| 第五章 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照 |
| 博士期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）喉鳞癌组织中HDAC6、α-Tubulin、HSP90、Cortactin的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 实验方法与原理 |
| 1.1.5 实验步骤 |
| 1.1.6 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HDAC6在喉鳞癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系 |
| 1.2.2 α-tubulin在喉鳞癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系 |
| 1.2.3 HSP90在喉鳞癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系 |
| 1.2.4 cortactin在喉鳞癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系 |
| 1.2.5 HDAC6、α-tubulin、HSP90、cortactin在喉鳞癌中的表达相关性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HDAC6在喉鳞癌中的表达情况 |
| 1.3.2 α-tubulin在喉鳞癌中的表达情况 |
| 1.3.3 HSP90在喉鳞癌中的表达情况 |
| 1.3.4 cortactin在喉鳞癌中的表达情况 |
| 1.3.5 HDAC6、α-tubulin、HSP90及cortactin在喉鳞癌组织中表达相关性分析 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 头颈部肿瘤的研究进展 |
| 2.1 头颈部肿瘤的研究现状 |
| 2.2 头颈部肿瘤生物标记物的检测方法 |
| 2.3 头颈部肿瘤的基因水平变化 |
| 2.4 头颈部肿瘤的转录因子水平变化 |
| 2.5 头颈部肿瘤的蛋白水平变化 |
| 2.6 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录A 附图 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（10）猪苓活性成分通过调节HuR介导T24细胞增殖抑制和凋亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 猪苓现代临床药理作用研究进展 |
| 第二节 细胞死亡方式的研究进展 |
| 第三节 BCL-2与细胞凋亡研究进展 |
| 一、 BCL-2家族蛋白的结构特点 |
| 二、 BCL-2抑制细胞凋亡的机制 |
| 三、 BCL-2与肿瘤 |
| 第四节 Cyclin D1与肿瘤关系研究进展 |
| 第五节 RNA结合蛋白的研究进展 |
| 第六节 人抗原R(HuR)的研究进展 |
| 一、 HuR的结构与特征 |
| 二、 HuR蛋白的生理功能 |
| 三、 HuR与肿瘤 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 HuR对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节 |
| 第一节 HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节 |
| 一、 HuR过表达对BCL-2蛋白表达变化的影响 |
| 二、 HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA表达的影响 |
| 三、 HuR过表达对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响 |
| 第二节 HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA转录后表达的调节 |
| 一、 HuR沉默对T24细胞BCL-2蛋白表达的影响 |
| 二、 HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA表达的影响 |
| 三、 HuR沉默对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响 |
| 第二章 PPS通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞BCL-2基因的表达 |
| 第一节 PPS对T24细胞凋亡的影响 |
| 第二节 PPS对T24细胞BCL-2蛋白表达的影响 |
| 第三节 PPS对T24细胞BCL-2 mRNA水平的影响 |
| 第四节 PPS对T24细胞BCL-2 mRNA稳定性的影响 |
| 第五节 PPS对HuR在T24细胞内定位的影响 |
| 第六节 PPS对T24细胞内BCL-2 mRNA与HuR结合的影响 |
| 第三章 麦角甾醇通过HuR介导的转录后调节途径调控T24细胞cyclin D1基因的表达 |
| 第一节 麦角甾醇对T24细胞增殖的影响 |
| 第二节 麦角甾醇对T24细胞cyclin D1基因表达的影响 |
| 第三节 麦角甾醇对HuR在T24细胞内定位及与cyclin D1 mRNA结合的影响 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表的论文和参与课题 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、应用间期FISH技术探讨 cyclin D1基因在鼻咽癌中的扩增（论文参考文献）
- [1]基于微阵列比较基因组杂交技术对喉鳞癌全基因组染色体拷贝数变异的整合分析[D]. 李东杰. 吉林大学, 2021(01)
- [2]MiR-B10-3p在牛疱疹病毒5型体外潜伏感染再激活中的作用研究[D]. 刘洁. 华中农业大学, 2020(04)
- [3]LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究[D]. 罗宏涛. 兰州大学, 2020(04)
- [4]TIGAR在胃癌发生发展中的机制研究[D]. 刘振华. 大连医科大学, 2019
- [5]巴西橡胶树遗传图谱第11号、13号和14号连锁群26个遗传标记的物理定位研究[D]. 陈秋惠. 海南大学, 2019
- [6]LncRNA AK023391介导氧化苦参碱调控胃癌的分子机制研究[D]. 黄艳霞. 上海交通大学, 2018(01)
- [7]CHD1L在人食管癌中的临床意义和生物学功能研究[D]. 刘泽涵. 天津医科大学, 2018(02)
- [8]microRNA-374a靶向CCND1失活PI3K/AKT通路抑制结肠癌的发展[D]. 陈怡羽. 南方医科大学, 2017(12)
- [9]喉鳞癌组织中HDAC6、α-Tubulin、HSP90、Cortactin的表达及临床意义[D]. 魏巍. 华北理工大学, 2017(04)
- [10]猪苓活性成分通过调节HuR介导T24细胞增殖抑制和凋亡[D]. 沈耿. 广州中医药大学, 2016(11)