一、两种试剂盒快速检测疟原虫的比较（论文文献综述）
朱凌倩[1]（2021）在《按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like在疟原虫感染按蚊过程中的作用研究》文中提出目的:探讨按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like（tsl）对疟原虫感染按蚊的调控作用。按蚊体内的miR-2944a-3p在疟原虫感染后显着下调,而tsl基因在控制果蝇细胞免疫系统发育中起重要作用。通过实验验证按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因tsl在按蚊组织的分布及二者的靶向关系,并进一步探索其对疟原虫感染按蚊过程中的作用,了解两者之间互相作用的分子机制,开发新的疟疾控制策略,为推进我国疟疾消除计划及全球无疟疾愿景提供理论研究基础。方法:根据黑腹果蝇和冈比亚按蚊tsl编码基因,检索大劣按蚊全基因组并鉴别大劣按蚊tsl基因,设计多种特异性引物,采用PCR和qRT-PCR扩增目的基因。利用多种生物信息学软件分析其所编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构、蛋白质二级结构和三级结构等。在MEGA6软件中用Clustal W法对所选蛋白序列进行序列比对,并基于最大似然法（ML）、最大简约（MP）和邻接法（NJ）构建系统发育进化分析（Bootstrap检测值为1000次）。使用实时荧光定量PCR方法检测该基因在头、胸、腹、足的表达特异性。利用生物信息学方法预测miR-2944a-3p靶向作用于tsl基因的3’UTR区,先进行oligo转染及质粒转染验证,以293T细胞基因组DNA为模板,设计tsl基因的野生型和突变型载体序列,并设置对照组PC:即adi-miR-2944a-3p inhibitor两重复序列建入pmirGLO载体组;pmirGlO:即空载体组。并将其分别克隆到pmirGLO载体中,构建双荧光素酶基因报告载体。将miR2944a-3p mimics、mimics NC同野生型载体、突变型载体、PC载体,空载分别转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。采用qRT-PCR的方法了解miR-2944a-3p及tsl的存在和表达,检测雌性按蚊在头、胸、腹及剩余部位的表达水平。一方面鉴定miR-2944a-3p对疟原虫感染的影响:根据miR-2944a-3p的碱基序列,由生工公司合成miRNA模拟物（mimics）、miRNA阴性对照模拟物（negative control,NC）。挑选羽化后3-5日龄的雌性按蚊分别进行两种模拟物的显微注射,注射后两天进行过表达效率检测。同时用伯氏疟原虫感染的BALB/c小鼠（感染率为4%～6%）感染两组蚊媒,感染后8 d解剖中肠,通过荧光显微镜镜检计算两组肠道中疟原虫卵囊数,用Mann-Whitney test进行统计学检验。另一方面鉴定tsl基因对疟原虫感染的影响:利用RNAi技术,根据斯氏按蚊tsl基因及GFP基因的序列,进行扩增纯化,再通过T载体连接及DH5α感受态细胞转化,经过菌落PCR验证后提取质粒,构建体外表达载体,分别制备实验组dstsl和对照组dsGFP。挑选羽化后3-5日龄的雌性按蚊分别进行两种dsRNA的显微注射,注射后两天进行敲低效率检测。注射后四天用伯氏疟原虫感染的BALB/c小鼠（感染率为4%～6%）感染两组蚊媒,感染后8d解剖中肠,通过荧光显微镜镜检计算两组肠道中疟原虫卵囊数,用Mann-Whitneytest进行统计学检验。以此,来验证miR-2944a-3p及预测靶基因tsl对疟原虫感染的影响。结果:Tsl基因全长16751 bp,CDS区1134bp,编码377个氨基酸。TSL蛋白属于亲水性稳定蛋白。经预测TSL蛋白位于膜外的分泌蛋白并且包含信号肽。其二级结构含α-螺旋（51.72%）、延伸链（12.2%）、β-折叠（4.77%）和无规则卷曲（31.30%）,且能以5cj9.1.A为模板进行3D同源建模。系统发育进化分析发现大劣按蚊TSL与法老按蚊TSL亲缘关系较近。组织表达分析显示,该基因在大劣按蚊头、胸、腹、足中均有表达,且在头部表达最高,足部表达量较低。实验组中 adi-miR-2944a-3p mimics 与pmirGLO-ADIR006646-RA 野生型质粒共转48h,与共转mimicsNC组相比荧光素酶表达有统计学差异（P=0.0365）;将ADIR006646-RA的3’UTR序列中adi-miR-2944a-3p结合的位点突变后与adi-miR-2944a-3p mimics共转时,荧光素酶表达量与共转mimics NC组相比无显着差异（P=0.7360）。这一结果表明转染48h,此次实验中构建入载体的ADIR006646-RA 3’UTR序列能与adi-miR-2944a-3p结合,但是结合效果较弱。在斯氏按蚊头、胸、腹、余部中miR-2944a-3p和tsl基因均有表达。并且miR-2944a-3p在胸部表达较高,tsl基因在头部表达较高。鉴定miR-2944a-3p对疟原虫感染的影响:mimics组相对于mimics NC组相比,miR-2944a-3p的表达量升高了 80%左右。接下来通过Mann-Whitney检验计算感染8天后按蚊中肠疟原虫卵囊数发现,mimics和NC组的卵囊计数无差异显着性（P=0.8）。鉴定tsl基因对疟原虫感染的影响:制备的dstsl浓度为3.70 ug/ul,对照组dsGFP浓度为3.77 ug/ul。分别对两组按蚊从胸部注射dstsl和dsGFP,注射两天后使用qRT-PCR技术进行敲低检测。dstsl相对于对照组dsGFP,差异有统计学意义（P=0.0005）,且tsl的表达量敲低了61%左右。接下来通过Mann-Whitney检验计算感染8天后按蚊中肠疟原虫卵囊数发现,dstsl和dsGFP组的卵囊计数无差异显着性（P=0.61）。因此,miR-2944a-3p及tsl基因均未对疟原虫感染按蚊产生显着影响。结论:本研究从基因组水平鉴定了大劣按蚊tsl基因,分析预测了其蛋白结构,并获得了其组织特异性表达特征。采用双荧光素报告酶系统验证miR-2944a-3p是对大劣按蚊tsl基因（ADIR006646-RA）产生靶向调节作用。进一步验证miRNA及其靶基因功能,并分别通过miR-2944a-3p过表达、体外构建表达载体对按蚊进行活体RNAi（敲低tsl基因）进行疟原虫感染按蚊实验显示,二者均对疟原虫感染没有显着影响。
马冀[2]（2021）在《Seahorse XF原位检测恶性疟原虫能量代谢新方法的建立及其应用》文中进行了进一步梳理作为世界三大传染病之一,疟疾仍是危害人类健康的重大疾病。2019年WHO发布的《世界疟疾报告》中显示,恶性疟原虫和间日疟原虫是世界范围内较为常见的疟原虫,在疟疾高发的非洲地区由恶性疟原虫引起的疟疾发病病例占病例总数的99.7%。可见,合理的解决疟疾问题,仍是人类需要面临的重大挑战。疟原虫是疟疾的病原体,能够寄生于按蚊和脊椎动物中,寄生于人体红细胞内的阶段称作红内期。红内期疟原虫主要以糖酵解作为主要的供能方式,由氧化磷酸化途径的产能较少。红内期疟原虫通过增加自身糖酵解途径相关酶的蛋白表达以及改变红细胞膜的通透性来满足红内期阶段对葡萄糖的大量需求。疟原虫与肿瘤细胞相似,对能量的快速需求使其更偏向于反应过程较短且在胞浆中完成的糖酵解方式,糖酵解途径可以在短时间内提供能量。虽然氧化磷酸酸化途径供能较少,但是疟原虫的线粒体却在整个传播过程中发挥着至关重要的作用。对于目前的国际一线抗疟药物青蒿素类化合物而言,其抗疟机制仍是众说纷纭,但是众多假说中都提到了线粒体的参与作用,更有一种假说认为线粒体激活了青蒿素进而发挥抗疟作用。所以,线粒体作为抗疟药物可能作用的潜在靶点,本文旨在寻找一种能够测量疟原虫能量代谢途径的方法,用于考察红内期疟原虫有氧呼吸和糖酵解的作用。目前,细胞外通量分析已经成为检测细胞中生物能的一种主流方法,能够在不受外界环境干扰和不破坏细胞自身结构的前提下,实时监测细胞的能量代谢。Seahorse XF分析仪能够同时对细胞的有氧呼吸和糖酵解进行检测,并将检测得到的氧浓度与pH值转化为相应的OCR和ECAR值。本文所选用的Seahorse XFe96分析仪可以一次性测量多达96个样本的能量变化,其高通量的特点克服了传统使用Clark氧电极的局限性,使测量变得更高效,更灵活且便于重复。Seahorse XF分析多用于肿瘤细胞、成纤维细胞、神经元细胞和T细胞等细胞的分析,对于红细胞和红内期疟原虫的分析较少,缺乏较为成熟的方法。因此,本文综合现有理论和方法并根据红细胞和疟原虫自身的特点,对多种影响因素进行筛选与确定,最终建立了一种可实时原位检测红内期疟原虫能量代谢的新方法。并利用所建立的方法对现有的国际一线抗疟药物、在研药物以及相关抑制剂化合物作用于疟原虫的能量代谢进行考察,分别评价各类化合物对红内期疟原虫线粒体有氧呼吸和糖酵解的影响,为后续红内期疟原虫的深入研究提供基础数据。1.基于Seahorse XF分析仪——实时原位检测红内期恶性疟原虫能量代谢方法的建立体外培养P.falciparum 3D7,经多次同步化处理后培养出虫期较一致的滋养体期疟原虫,利用磁珠分选的磁性原理分离富集高纯度的滋养体期疟原虫,流式细胞仪检测富集纯度可达90.55%。富集的滋养体期疟原虫用于SeahorseXF分析的上机检测。首先对4种粘附剂进行筛选,初步确定Poly、C1010和Rat-0.12共3种粘附剂进行后续同细胞密度的同步筛选。在粘附剂和细胞密度同步筛选的过程中,分别优化了检测程序和上机培养基成分。检测程序由原来初始的3个Cycle增加至4个Cycle并取消了仪器原有的Mix过程,为了保证检测数值能在仪器的最适检测范围20-160pmol/min,初步将仪器建议的上机检测培养基AM改为与疟原虫生长相关的UB培养基。上机结果显示,细胞密度过高（9-10M）会导致疟原虫自身营养不足,活性降低最后死亡,检测的OCR值小于20pmol/min;低密度下,因疟原虫单位个数较少而不能满足仪器的最适检测范围,OCR值仅为20pmol/min左右,故综合后两次实验结果最终确定疟原虫最适的细胞密度为5M。然后在5M的最适细胞密度下寻找最佳的粘附剂,通过上清细胞个数和OCR值双重指标最终确定Poly作为上机选用的粘附剂,此时OCR值最大可达到78.18 pmol/min。随后采用最佳粘附剂Poly和最适细胞密度5M进行后续指标的筛选。在筛选粘附剂和细胞密度条件时,对上机培养基进行了初步的优化,所以又对上机检测培养基进行了详细的筛选。将包括疟原虫生长培养基在内的4种培养基进行了成分的比较,发现AM与其他3种培养基相比,缺少了部分缓冲成分,不适合疟原虫生长。上机整个过程的pH值比较发现,UB和UBP均能够维持疟原虫上机过程的生长环境,表现为疟原虫的活性状态较好,OCR值也相应较高。上机OCR值比较可知,AM作为上机培养基时整个检测过程的OCR值均在20pmol/min以下,UB和UBP的初始OCR值均为40pmol/min左右,检测过程中的OCR值均有上升趋势,其中UBP作为上机检测培养基时OCR值的上升趋势更大。结合上机前后pH值和OCR值响应的两个因素,最终确定UBP作为疟原虫上机检测的培养基。确定了粘附剂、细胞密度和上机检测培养基等几个条件后,对线粒体压力测试试剂盒中的Oligo和FCCP两种工具药物浓度进行筛选。结果显示,Oligo在低浓度（0-5μM）时不会降低体系的OCR值,系统无响应;逐渐增加Oligo的浓度后,在10 μM以上的浓度时体系的OCR值有降低趋势,10-15 μM浓度的效果相近。综合系统OCR值的响应程度和工具药物的作用趋势,得到两组较为合适的浓度,分别是Oligo浓度为10 μM、FCCP浓度为0.5μM和Oligo浓度为12.5 μM、FCCP浓度为1μM。将两组浓度再进一步比较后,最终选择Oligo浓度为10 μM、FCCP浓度为0.5μM的工具药组合作为疟原虫上机检测的最适工具药浓度。将粘附剂、细胞密度、上机检测培养基以及线粒体复合物的抑制剂等条件筛选确定后,编写了适合红内期疟原虫检测的一般程序,并绘制了P.falciparum 3D7正常情况下的线粒体呼吸图。2.同等实验条件下抗疟药物对恶性疟原虫增殖的影响对包含青蒿素及其衍生物在内的10大类别国际一线抗疟药物以及3大类别国际在研药物进行同一实验条件下的抗疟活性评价,得到24个化合物的IC50值。实验结果显示,对于国际一线抗疟药物来说,大部分药物的IC50值为nM级别,仅有少数类别的药物IC50值为μM级别。抗疟活性优于ART的药物有:CQ（IC50=14.10 nM）,Amo（IC50=4.48 nM）,Mef（IC50=10.50 nM）,Lum（IC50=11.22nM）,ARE（IC50=7.88 nM）,ARM（IC50=5.47nM）,ATS（IC50=5.00 nM）,DHA（IC50=3.80nM）,Ato（IC50=0.37nM）,Mal（IC50=4.27 nM）。其中Ato作为已知的ETC复合物Ⅲ的抑制剂其药效更是优于DHA。另外,3种在研药物均具有较好的抗疟活性,其IC50值低于大多数国际一线抗疟药物,IC50值分别为:DSM（IC50=7.84nM）,Cip（IC50=1.19nM）,Blue（IC50=5.93 nM）,3种药物的抗疟活性均优于ART,其中Cip的药效优于DHA。后续实验剔除IC50值较大的2种抗疟药物Sul和Cli,将其余的抗疟药物在同等IC50水平下进行考察。3.抗疟药物和相关抑制剂对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响选择线粒体压力测试试剂盒并利用已建立的方法对P.falciparum3D7线粒体不同时刻的生物能进行评价。绘制折线图直观的反应药物对疟原虫的实时影响,结果显示,青蒿素及其衍生物无论是低剂量还是高剂量均对P.falciparum3D7线粒体有氧呼吸无明显的影响。绘制能够代表线粒体功能的柱状图显示,ARM在增加线粒体的最大呼吸和质子漏上具有显着性（P≤0.001）,在某种程度上促进了线粒体呼吸,但是并没有从实质上破坏线粒体的ETC。对抗疟药物和在研药物的考察结果显示,13大类别共22种化合物在5×IC50和10×IC50两种浓度下,多数抗疟药物对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸无明显影响,并未破坏疟原虫线粒体ETC,青蒿素及其衍生物的结果与上述单独考察的结果相同。青蒿素及其衍生物随着药物剂量的增加,对提高线粒体最大呼吸的显着性增强。CQ和QN,在10×IC50浓度时对增加线粒体质子漏和降低储备呼吸量的水平具有显着性（P≤0.001）,但整个过程并未完全破坏疟原虫线粒体ETC的功能。Dap随着药物剂量的增加,对线粒体的抑制作用增强,10×IC50浓度下能够造成对线粒体呼吸的抑制,加药后能够显着增加线粒体的基础呼吸水平（P≤0.0001）。Azy随着药物剂量的增加,对线粒体的抑制效果增强,10×IC50浓度下能够显着降低线粒体的最大呼吸（P≤0.001）。Pro仅在高剂量10×IC50浓度下对线粒体呼吸有抑制作用,能够显着降低线粒体的最大呼吸（P≤0.0001）。Ato作为线粒体ETC复合物Ⅲ的抑制剂,在5×IC50和10×IC50浓度下,均能对曲线有明显的改变,表现为OCR值降低,耗氧率下降,能够明显抑制线粒体ETC,抑制疟原虫线粒体有氧呼吸。DSM和Cip在5×IC50浓度时对增加线粒体最大呼吸有显着性（P≤0.01）,Blue在10×IC50浓度时能够显着降低线粒体的最大呼吸（P≤ 0.01）,但是3种在研药物并未完全破坏疟原虫线粒体ETC的功能。所以在本实验条件方法及所选浓度下,除个别药物外,多数抗疟药物对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸均无明显影响,结合上述实验结果,推测多数抗疟药物在发挥抗疟作用时并不是最先启动线粒体的死亡机制,也反映出疟原虫死亡的过程中线粒体在其中应该不是早期事件。随后,对铁死亡诱导剂和与铁离子转运相关的离子通道抑制剂进行考察,结果显示,10×IC50浓度下Era和Sor能够抑制疟原虫的线粒体呼吸,RSL3对疟原虫线粒体的抑制作用不明显,但3种铁死亡诱导剂均能显着降低线粒体的基础呼吸和减少质子的泄漏（P≤0.01）。20×IC50浓度的离子通道抑制剂作用于疟原虫后,Baf和EIPA对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸无明显的影响,Ami对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸有明显的抑制作用。DHA与Ami、Baf和EIPA共3个离子通道抑制剂分别联用的结果显示,联用后三组药物均对P.falciparum 3D7线粒体有氧呼吸有抑制作用,可见DHA与离子通道抑制剂的药物联用对疟原虫线粒体的抑制效果有一定的协同作用。4.青蒿素类化合物和铁死亡诱导剂对恶性疟原虫糖酵解的影响选择糖酵解速率分析试剂盒并利用已建立的方法对P.falciparum 3D7糖酵解进行评价。为了排除RBC对疟原虫糖酵解检测造成影响,所以最先对RBC和iRBC的糖酵解进行考察。结果显示,正常情况下iRBC糖酵解的ECAR值在50-70左右,RBC糖酵解的ECAR值则在基线附近,iRBC的糖酵解强度大约是RBC的50-70倍。随后对青蒿素及其衍生物的考察结果显示,5种化合物在高浓度下对糖酵解仅有轻微的抑制趋势,抑制效果不明显,可见在本实验条件方法及所选浓度下,青蒿素类化合物对P.falciparum3D7糖酵解无明显的影响。能够反应糖酵解贡献率的PER百分比显示,ART不同剂量组和空白组的糖酵解PER与基础PER的百分比均能达到96%以上,线粒体OCR值与糖酵解PER的比值均小于0.1。说明红内期疟原虫是以糖酵解作为其主要的供能方式,由线粒体产生的供能少之又少。此外,对铁死亡诱导剂的考察结果显示,由于系统的检测时间过长导致了疟原虫的自身活性降低,空白组的曲线呈逐渐下降的趋势,所以提示在使用仪器分析红内期疟原虫能量代谢的途径时,系统整体的检测时间不宜过长,最好控制在3h以内,以保证疟原虫自身的活性和系统检测的准确性,因此铁死亡诱导剂对于P.falciparum 3D7糖酵解的影响有待进一步考察。
王晓星[3]（2021）在《羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究》文中研究表明羊巴贝斯虫病是一种蜱传性（tick-borne）血液原虫病,临床特征包括发热、血红蛋白尿和溶血性贫血等。目前,研究表明我国羊巴贝斯虫分布广泛、动物感染率高,严重危害我国养羊业的健康可持续发展。自噬（autophagy）是细胞在自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）的调控下,依赖溶酶体途径对长寿蛋白或受损细胞器进行降解的一种过程。近年来,研究表明ATGs不仅参与调控疟原虫和弓形虫自噬的发生,而且在维持顶质体、线粒体等细胞器的稳态及虫体的生长复制过程中起关键作用,同时也与耐药虫株（双氢青蒿素、氯喹和哌嗪等抗疟药物）的产生存在潜在的关系。巴贝斯虫、疟原虫和弓形虫等同属于顶复门原虫,但迄今为止,尚未见巴贝斯虫中是否存在自噬系统及其ATGs结构与功能的研究报道。因此,本研究以羊巴贝斯虫未定种新疆株（Babesia sp.Xinjiang,BspXJ）为研究对象,通过对梨形虫ATGs进行生物信息学分析、测定羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组、评价自噬抑制剂和诱导剂对ATGs表达丰度的影响、建立羊巴贝斯虫基因编辑技术和分析ATGs亚细胞定位及鉴定互作蛋白等工作,为深入开展巴贝斯虫ATGs功能的研究提供了基础数据,同时为利用基因编辑技术开展巴贝斯虫基因功能的研究建立了技术平台。主要研究结果总结如下:1.通过对梨形虫ATG的生物信息学分析,表明巴贝斯虫基因组中仅存在部分核心ATGs,包括ATG3、ATG4、ATG7、ATG8、ATG18和Vps34,其中ATGs蛋白的催化或结合位点在不同物种中高度保守,同时也显示其适于作为顶复门原虫进行分类研究的分子靶标;其次对羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组进行测定,结果显示其基因组大小分别为29916–30846 bp和5767–5946bp,以其基因组构建的系统进化树均表明我国羊巴贝斯虫可分为羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）,其中莫氏巴贝斯虫又分为两个亚种,该结果为后续ATGs基因功能的研究提供细胞器基因组数据。2.通过瞬时转染筛选最佳转染条件,结果表明最佳转染缓冲液、程序和质粒用量分别为Human T Cell nucleofector solution、V-024和20μg,启动子活性为Actin IG>ef1αAIG>ef1αBIG>Rap IG,在瞬时转染成功的基础上使用同源重组技术,将e GFP-杀稻瘟菌素（Blasticidin,BSD）融合蛋白插入BspXJ基因组的ef1α位点,经PCR、WB和IFA鉴定,结果显示获得稳定表达e GFP-BSD融合蛋白的单克隆虫株,表明成功建立了BspXJ瞬时和稳定转染系统,为后续研究基因功能提供了技术支持。3.制备BspXJ的ATGs多克隆抗体,经WB分析,结果显示天然ATG蛋白的表达量较低;利用建立的稳定转染系统,构建过表达ATGs的BspXJ虫株,经q PCR、PCR、WB和IFA鉴定过表达ATGs的虫株,结果显示成功获得过表达ATG3和ATG8的BspXJ虫株;然后通过IFA和Co-IP等方法进行ATG3和ATG8蛋白的亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定,结果表明ATG3和ATG8与顶质体和线粒体均部分共定位,与其互作的蛋白主要参与调控自噬、泛素降解、入侵和线粒体主要功能等生物学过程。4.通过筛选BspXJ自噬抑制剂和诱导剂的最佳作用浓度,应用q PCR检测自噬抑制剂和诱导剂处理后不同时间点ATGs的表达丰度,结果显示最佳作用浓度依次为2 m M 3-甲基腺嘌呤、12.5n M巴非霉素A1、12.5μM氯喹和5μM雷帕霉素,HBSS和雷帕霉素自噬诱导剂处理后,均可增高ATGs的表达丰度,其中ATG8表达量增加3–26.5倍,而自噬抑制剂处理后,ATGs表达丰度降低/增高倍数小于1,表明BspXJ的ATGs参与调控其自噬过程。5.利用同源重组技术敲除ATG3和ATG8后,经过多轮筛选均未获得稳定转染的基因敲除虫株,结果表明ATG3和ATG8是BspXJ生长复制过程中的关键基因;为进一步研究其基因功能,稳定表达TIR1-3Flag的虫株中转染p BS-m Cherry-AID-3HA质粒,成功筛选获得稳定表达m CherryAID-3HA的虫株。在加入400μM IAA 4 h时,WB和IFA检测结果显示m Cherry-AID-3HA蛋白的表达水平显着降低,表明成功建立了BspXJ的条件性基因敲除系统,从而为将来开展ATG3和ATG8作用机制的研究提供了技术平台。综上所述,本研究成功建立了BspXJ的瞬时、稳定转染及条件性基因敲除技术,初步阐明了虫体内存在自噬途径,且其ATGs参与调控自噬途径,为深入开展巴贝斯虫自噬相关基因的作用机制提供了基础数据,同时为开展巴贝斯虫入侵、繁殖、致病、代谢等方面机制的研究提供了技术平台。
侯谦[4]（2021）在《口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价》文中研究说明快速简便的核酸检测方法能够在第一时间发现口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）,在疫情防控中发挥至关重要作用。实验室广泛使用的荧光PCR方法高度依赖于特定设备和专业人员,无法满足条件有限的基层检测需求,所以建立一种适于现场检测需求的新型核酸检测方法具有重要意义。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有操作简便、设备需求简单、快速、灵敏和特异等独有的优势,非常适于基层使用。本研究通过在反应液中引入染料,实现了RT-LAMP结果的直接肉眼可视化判断,建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法,为口蹄疫的现场检测提供了便利。首先对FMDV的A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3这七个血清型的基因组进行序列分析,选择高度保守的3D聚合酶基因作为RT-LAMP扩增靶区域。通过3D序列同源性分析,选择39条3D基因（3′端500bp）序列,在5′端引入T7启动子,合成后以Amp+的pUC57为载体进行重组。重组质粒（3D-T7pUC57）经鉴定正确后,用于后续试验。鉴于FMDV为RNA病毒,所以,以3D-T7pUC57质粒相应的RNA转录本为模板建立可视化RT-LAMP检测方法。通过对RT-LAMP引物、引物浓度、反应时间和反应温度、以及显色剂（羟基萘酚蓝、钙黄绿素、SYBR green I、中性红、酚红和溴百里酚蓝）的系统系列筛选,建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法。RT-LAMP的总反应体系20μL,包括RT-LAMP缓冲液15.2μL,Bst AMV酶混合液1.5μL,外引物F3和B3各0.04μL（100μM）,内引物FIP和BIP各0.5μL（100μM）,环引物Floop和Bloop各0.11μL（100μM）,中性红1μL（500μM）,模板1μL。反应时间55 min,反应温度65℃。反应结束后,若反应管溶液变为粉红色判为阳性,若为橘黄色则判为阴性。交叉反应实验表明FMDV可视化RT-LAMP不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV3等病毒发生反应,具有良好的分析特异性。以10倍倍比稀释的RNA转录本为模板进行分析敏感性检测,并与OIE推荐的检测方法进行比较,结果表明RT-LAMP检出限为104拷贝/μL,RT-q PCR和RT-PCR方法检出限分别为103和104拷贝/μL。采用FMDV可视化RT-LAMP检测39份代表7种FMDV血清型的3D RNA转录本和59份临床样品,并与RT-q PCR和RT-PCR进行比较,结果表明RT-LAMP方法的阴、阳性检出率为100%和95.7%。对6份临床样品10倍倍比稀释后进行检测,结果表明RT-LAMP与RT-PCR检出限相近,相当于RT-q PCR CT值为32.5时检出的病毒含量。本研究成功地建立了FMDV可视化RT-LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性。操作简便,设备需求简单（恒温热块）,结果直接肉眼观察判断,能够满足基层现场检测需求,具有良好的应用前景。
杨帆[5]（2021）在《伯氏疟原虫Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26双靶位联合疫苗传播阻断潜能的评估》文中研究指明目的:疟疾是一种由疟原虫所致,对人类健康及生命安全造成极大危害的虫媒传染病。由于疟原虫在人与蚊双宿主之间传播的复杂特性,疟疾的治疗和预防同样面临着众多挑战。2020年世界疟疾报告中显示,2019年现存约2.29亿疟疾感染病例,40.9万死亡病例。疫苗,一种广泛应用于各类传染病的生物制品,近年来在疟疾中已有长足发展。红前期疫苗,红内期疫苗和传播阻断疫苗是目前国际上研究较为广泛的三种疟疾疫苗,其中传播阻断疫苗（Transmission Blocking Vaccines,TBVs）旨在阻断疟疾在人与蚊宿主间的传播,能够起到大范围的预防保护作用,具有更深远的意义。然而,迄今为止仅有少数几个TBVs候选抗原具有明确的传播阻断活性,也并没有达到完全阻断的效果。疟原虫生命周期的复杂性以及疟原虫逃避免疫反应的机制导致了其表面抗原存在较大变异,单价疫苗免疫效果不理想。因而,研制疟疾复合疫苗是当今的发展趋势。我们的研究选取了前期课题组得到的传播阻断优势候选抗原Pbg37,PSOP25和PSOP26。之前的研究结果表明Pbg37主要表达于疟原虫雄性配子体上,在雄配子体的生成和下一步发育中发挥作用。疟原虫有性阶段动合子表面表达的PSOP25和PSOP26,基因功能分析显示其显着影响动合子的形成,对卵囊数量和蚊感染率有显着影响。我们希望通过不同方式组装并应用这些抗原以实现比单抗原疫苗更高的传播阻断活性。因此,我们设计并表达了由Pbg37和PSOP25两片段以及PSOP25和PSOP26两片段组成的两种融合蛋白。免疫方案上,我们使用单抗原,两种抗原混合以及两种抗原融合蛋白分别免疫小鼠,并对混合或融合抗原免疫反应性,免疫干扰及传播阻断活性进行分析,为开发多抗原和多阶段传播阻断疫苗提供新的指导和理论依据。研究方法:1)疟原虫,小鼠和按蚊。所有动物实验均符合中国医科大学动物伦理委员会要求且经过委员会批准。疟原虫株为P.berghei ANKA 2.34伯氏疟原虫。疟原虫通过尾静脉注射方式在鼠中传代培养,其入侵鼠红细胞后发育增殖。蛋白免疫使用6-8w Balb/c雌性小鼠。按蚊品种为斯氏按蚊（Hor株）,饲养条件为温度25℃,湿度60-70%。2)蛋白表达载体构建。蛋白表达片段为各基因截短区域（Pbg37:26-88 aa,PSOP25:45-245 aa,PSOP26:50-254 aa）。提取疟原虫基因组DNA或者总RNA反转录为c DNA作为基因扩增模板,设计引物后通过PCR方法得到Pbg37、PSOP25和PSOP26片段,之后通过Overlap PCR方法扩增得到Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26融合片段。原核蛋白表达载体pET32a（+）和PCR获得的片段均使用限制性内切酶Bam H I和Not I进行消化处理,使用连接酶连接载体和片段,构成原核蛋白表达重组载体。3)蛋白的表达和纯化。将序列鉴定正确后的质粒转化至Rosetta-gami B（DE3）菌株中进行蛋白表达。菌液在20℃条件下经浓度为1m M的IPTG诱导8小时后,高速离心回收细菌。之后使用Ni树脂胶特异性结合含His标签的表达蛋白。纯化蛋白检测纯度和浓度后备用。4)实验动物免疫方案纯化蛋白按如下方案进行免疫小鼠（n=5）,各免疫组使用重组蛋白分别为:1组:PBS对照组;2组:Trx-His标签蛋白免疫组;3组:rPbg37单独免疫组;4组:rPSOP25单独免疫组;5组:rPSOP26单独免疫组,6组:rPbg37+rPSOP25混合免疫组;7组:rPSOP25+rPSOP26混合免疫组;8组:rPbg37-PSOP25融合免疫组;9组:rPSOP25-PSOP26融合免疫组。诱导纯化50μg的重组蛋白混合等体积的完全弗氏佐剂乳化后,以皮下注射方式打入小鼠体内。免疫间隔为14天。免疫14天后,使用25μg纯化后的蛋白等体积混合不完全弗氏佐剂,混合乳化后进行两次增强免疫。最终免疫后14天收集血清,并检测抗体滴度。5)免疫血清识别疟原虫天然抗原情况。为了检测天然疟原虫蛋白与血清的特异性反应,我们应用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光实验观察血清能否识别疟原虫天然抗原。Western Blot实验采用配子体和动合子时期抗原提取物与各免疫组抗血清反应,通过ECL化学发光法检测血清与天然蛋白反应情况;IFA实验通过使用各免疫组小鼠抗血清孵育结合各时期疟原虫,采用荧光抗体标记,在Nikon共聚焦显微镜下拍摄观察抗体结合情况。6)传播阻断能力评估我们通过体外动合子形成和蚊喂养实验评估各组抗血清传播阻断能力。体外实验中,我们以1:5和1:10（V/V）的稀释条件,将血清融入培养基。在25℃条件下,雄配子体加入培养基培养15min后,检测雄性配子体出丝情况,并继续在19℃培养24小时后检测动合子形成情况。蚊喂养实验中,经蛋白免疫的各组小鼠末次免疫14天后,小鼠经苯肼治疗处理,再经腹腔注射感染疟原虫,感染后3天,通过按蚊叮咬小鼠的方式将疟原虫摄入体内,血餐12天后,显微镜下解剖按蚊将其中肠取出,溴酚红染色后显微镜下观察中肠上卵囊数。我们通过计算感染疟原虫的按蚊占总按蚊的百分比,以及感染的按蚊中肠中卵囊密度综合评估抗血清传播阻断活性。7)统计学差异分析相关数据采用SPSS23.0软件进行统计学差异分析。采用方差分析方法分析抗体效价、雄性配子体出丝中心和动合子形成数量等多组间差异。Mann-Whitney U检验分析组间卵囊数量差异。组间蚊感染率分析采用Fisher确切概率法。数据用平均值（Mean）±标准误（SEM）表示。检验水准为α=0.05。结果:1)Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26原核蛋白表达。我们使用课题组之前筛选出的已证明具有传播阻断活性的多个候选抗原组成新的融合抗原,其中包括表达于疟原虫配子体时期的Pbg37和表达在动合子阶段的PSOP25和PSOP26。首先我们构建了两种融合抗原的蛋白表达载体,一个是组装了主要表达于疟原虫配子体阶段的Pbg37和主要表达于疟原虫动合子阶段的PSOP25,构成不同阶段抗原融合表达载体:Pbg37-PSOP25。另一个选择均主要表达在动合子阶段的PSOP25和PSOP26,构成了同阶段不同位点抗原融合表达载体:PSOP25-PSOP26。我们延用了三个抗原前期研究采用的表达位点,分别为Pbg37:26-88aa（63aa）,PSOP25:45-245aa（201aa）和PSOP26:50-254aa（205aa）,拟构建通过柔性linker（15aa）串联连接的融合蛋白:Pbg37-PSOP25（63aa+15aa+201aa）和PSOP25-PSOP26（201aa+15aa+205aa）。构建成功的两个融合质粒含His标签,其成功转化并表达后,SDS-PAGE和WB结果分析表明,rPbg37-PSOP25和rPSOP25-PSOP26两融合蛋白分子量符合预期大小,分别为51kDa和66kDa。2)各免疫组血清抗体滴度检测。使用Ni-NTA纯化后的各重组蛋白分别免疫小鼠,在第三次免疫14天后采集鼠血并分离得到鼠血清,通过ELISA方法检测血清中的抗体滴度。结果显示,单独抗原免疫小鼠后所得抗血清仅针对各自蛋白发生特异性反应,混合和融合蛋白免疫小鼠后所得抗血清,可与两个单独抗原发生同效价抗原抗体结合反应,且抗体滴度均可达到1:128000,表明混合或融合后的抗原无免疫干扰现象。同时,我们采用蛋白免疫印迹实验评估了免疫血清的特异性。单独抗原免疫血清可与融合蛋白反应。混合和融合抗原免疫血清也可与单独抗原产生特异性条带。结果表明免疫抗原在小鼠体内引发了强烈的免疫应答并且产生的抗体特异性较强。3)混合和融合蛋白诱导产生的多克隆抗体可以特异性结合疟原虫天然蛋白。首先我们采用Western Blot方法检测混合和融合蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体是否能与疟原虫天然蛋白发生反应。等量的配子体和动合子蛋白裂解提取物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后,转印至PVDF膜上,后分别与各实验组所得抗血清孵育,检测蛋白免疫印迹。结果显示,抗rPbg37鼠血清与配子体,动合子的裂解提取物反应识别出大小为～37kDa的蛋白条带;rPSOP25和rPSOP26鼠血清与动合子的裂解提取物反应分别识别出大小为～40kDa和～91kDa的蛋白条带;与抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25血清结合反应后,配子体裂解提取物识别显示一条蛋白条带,大小为～37kDa,动合子裂解提取物识别显示两条蛋白条带,大小分别为～40kDa和～37kDa;与抗rPSOP25-PSOP26血清结合反应后,仅有动合子裂解提取物识别显示两条蛋白条带,大小分别为～91kDa和～40kDa。其次,我们采用IFA实验验证各组抗血清与疟原虫天然蛋白结合情况。结果显示,无性阶段疟原虫孵育各组抗血清后,镜下均未检测到荧光信号;配子体阶段疟原虫孵育抗rPbg37,rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清后,镜下可见明显荧光信号,且采用雌雄配子体特异性标记抗体区分雌雄配子体后,以上3种抗血清孵育后的雄性配子体荧光信号明显强于雌性配子体。同样检测rPSOP25,rPSOP26,rPSOP25+rPSOP26和rPSPO25-PSOP26抗血清与配子体孵育后未见明显荧光信号。动合子阶段疟原虫孵育抗rPSOP25,rPSOP26,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSPO25-PSOP26鼠血清后,均检测到较强荧光信号。两实验结果表明,抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清可与疟原虫有性阶段中配子体和动合子时期天然抗原发生结合,抗rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-POSP26鼠血清仅可与疟原虫有性阶段动合子时期天然抗原发生结合。混合或融合免疫后,所产生的多克隆抗体针对所包含单独抗原均产生了免疫应答。4)混合和融合蛋白抗血清具有明显传播阻断活性。我们采用体外和体内实验两种方式验证两种融合蛋白的传播阻断活性。体外实验中雄配子体出丝中心和24小时动合子形成阻断结果显示,相比于Trx-His对照组,抗rPbg37,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25鼠血清在1:5稀释条件下,雄性配子体出丝相比对照组下降68%,68%和70%,在1:10稀释条件下,雄性配子体出丝相比对照组下降63%,63%和61%。24小时动合子形成阻断结果显示,抗rPbg37,rPSOP25和rPSOP26鼠血清在1:5稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降68%,55%和49%,在1:10稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降60%,53%和42%;抗rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26鼠血清在1:5稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降74%,77%,59%和59%;在1:10稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降65%,67%,55%和56%。蚊喂养实验结果显示,将最终免疫14天后的小鼠感染疟原虫后喂养蚊子,与Trx-His对照组相比,各实验组均显示下降的蚊疟原虫感染率,rPbg37,rPSOP25,rPSOP26,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26分别下降了:3%,13%,7%,16%,20%,14%和15%。卵囊密度下降水平分别为:rPbg37:48%,rPSOP25:62%,rPSOP26:52%,rPbg37+rPSOP25:75%,rPSOP25+rPSOP26:66%,rPbg37-PSOP25:77%,rPSOP25-PSOP26:66%。结论:1)混合和融合蛋白免疫所得抗血清均具有较高抗体效价并可识别特定阶段疟原虫天然蛋白,同时,所包含的两抗原间无免疫干扰现象。2)抗混合和融合疫苗抗血清均显示显着的传播阻断能力,且抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清在阻断蚊胃内卵囊生成的能力上相比两单位点蛋白免疫血清显着升高,蚊感染率方面,混合和融合蛋白免疫血清均显示增强阻断的趋势。抗rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26免疫血清在阻断蚊胃内卵囊生成的能力上相比抗rPSOP26免疫血清显着升高;蚊感染率方面,混合和融合蛋白免疫血清均仅显示增强阻断的趋势。3)多时期多位点疫苗传播阻断活性强于同时期多位点疫苗。
胡凤悦[6]（2021）在《蛋白芯片技术在疟疾血清学研究中的应用》文中指出背景疟疾（malaria）是一种传染性的寄生虫疾病,通过雌性按蚊在人群中传播,对人类的健康和生命有着极大的威胁。目前,在全球范围内对疟疾的防治已取得重大成果,但全面消除疟疾任重道远。对疟疾高风险区人员的筛查和防治以及疟疾疫苗的研发都是疟疾消除过程中的必经之路。随着蛋白芯片技术的发展,使得对疟疾相关蛋白进行大规模、高通量研究成为现实,这种技术与血清学研究相结合,为发现具有高免疫原性的疟原虫抗原提供了极大的便利;为后续挑选候选血清标记物进行大规模高风险人群筛查提供了依据;获得疟原虫入侵宿主细胞过程中理想靶位点,为疟疾疫苗和药物研发提供研究基础。目的本研究基于实验室蛋白芯片的制备,利用不同重组蛋白对韩国和中国收集到的血清样本进行筛查,并分析发现具有高免疫原性的疟原虫抗原。方法以自制的氨基化玻片和镍螯合物玻片这两种不同包被的玻片作为基片,比较其应用于蛋白芯片的差异;基于蛋白芯片技术,利用三种间日疟原虫重组抗原即PvLSA-N、PvCSP-VK210和PvMSP1-19对韩国间日疟高风险地区的血清样本进行筛查,评估该地区间日疟流行情况;基于无细胞麦胚系统小量表达体系表达卵形疟原虫重组蛋白,对表达的蛋白进行初步鉴定,并应用蛋白芯片技术检测其与卵形疟现症患者、既往感染者及无疟疾感染史健康人的血清学反应,同时检测其与恶性疟和间日疟现症患者的血清进行交叉反应的情况。结果两种不同包被的玻片对His标签重组蛋白均有着较好的固定作用,相关性和重复性均较好,均可应用于以His为标签的重组蛋白的芯片制备;通过对韩国间日疟高风险地区血清样本的筛查以及血清学分析,三种重组间日疟蛋白均可用作于血清学标记物来监测疟疾的感染情况,其中PvLSA-N可有效监测有无间日疟既往感染史的情况,在此基础上可充分利用蛋白芯片技术应用于大量血清样本的筛查;利用麦胚无细胞表达系统成功表达了 20种卵形疟原虫蛋白,应用蛋白芯片技术进行两轮筛查,获得8种具有高免疫原性的卵形疟原虫蛋白,均对间日疟患者和恶性疟患者的血清有着较高的敏感性,对卵形疟现症患者和既往患者有着一定的敏感性。结论蛋白芯片技术可用于疟疾血清学研究,不仅可以用于疟疾流行情况的评估,还可用于筛选具有高免疫原性的疟原虫蛋白,具有重要的应用价值。
吴宇迪[7]（2021）在《应用伯氏疟原虫动合子转录组学筛选潜在传播阻断疫苗候选基因》文中指出目的:疟原虫是疟疾的病原体,全球范围内的多种脊椎动物可能受到感染,包括鸟类、爬行动物、两栖动物和人类,传播如此广泛的病原体对人类的健康构成了巨大的威胁。开发有效的抗疟疾疫苗的主要障碍是对疟原虫复杂的生活史以及对疟疾感染的复杂免疫反应了解不足。根据寄生虫发育的阶段,疟疾疫苗可分为三类:红前期疫苗（Pre-erythrocytic vaccines,PEVs）,红内期疫苗（Blood stage vaccines,BSVs）和传播阻断疫苗（Transmission-blocking vaccines,TBVs）。TBVs不仅可以有效控制疟疾,还可以预防耐药寄生虫的出现和传播。发现新的TBVs靶点成为时下最关键的任务之一。TBVs通过影响蚊阶段的感染来阻断疟疾的传播。目前传播阻断效果较好的候选抗原包括配子体和配子表面抗原P48/45和P230以及合子和动合子表面抗原P25和P28。P48/45和P230敲除导致合子形成减少,P25和P28则影响动合子的存活和卵囊的发育,研究表明P25和P28缺失都会导致蚊子中肠几乎没有卵囊形成。由于不受人体免疫选择压力的影响,表达在雌雄配子受精后阶段的抗原可以产生较长的免疫力且变异较少。利用体外培养系统培养动合子、使用梯度密度离心法分离纯化培养后的动合子可极大程度上分离非动合子阶段疟原虫及RBC,得到的动合子纯度较高,可用于进一步的研究。转录组,指细胞某一时期所有基因的转录水平,转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。简而言之,转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。对疟原虫合子到动合子阶段的转录组的研究和比较可以揭示在这一阶段基因的转录水平,从而揭示特定基因的作用机制或其相关功能。因此,本研究拟通过分析伯氏疟原虫雌雄配子结合后继续培养2h、6h、12h、24h的转录组,鉴定这一阶段的转录特征来推断和发现潜在的TBVs候选基因。研究方法:1)野生型伯氏疟原虫动合子培养及纯化。20只6～8周龄的雌性KM小鼠平均分成4组,每组每只小鼠经腹腔注射0.06mg/ml的苯肼,3d后经尾静脉注射5×106个野生型伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）感染的RBC（infected red blood cell,iRBC）,待原虫血症达10%左右取眼球血,4组眼球血分别置于动合子培养基中在19℃环境下培养2h、6h、12h和24h,培养物经涂片染色鉴定培养效果。使用62%Nycodenz溶液纯化疟原虫,用0.2%红细胞裂解液裂解红细胞,裂解后的产物经PBS洗涤两次。2)转录组学实验。使用洗涤后2h、6h、12h、24h样本提取Total RNA样品,适温变性打开其二级结构,使用oligo（d T）磁珠分别富集4组mRNA,加入打断试剂将mRNA片段化,使用PCR仪合成一链cDNA,继续合成二链cDNA。适温反应,修复双链cDNA末端,并在3’末端加上A碱基,配制接头连接反应体系,将接头连接至cDNA。将PCR产物变性为单链后适温反应得到单链环形产物,消化掉未被环化的线性DNA分子后,即得到最终的文库。使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库的片段大小及浓度。通过联合探针锚定聚合技术进行测序,得到50bp/100bp/150bp的测序读长。3)转录组学的生物信息学分析。筛选雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h差异表达的基因。对表达量经过log2转换,采用MEV进行聚类分析,选取2h、6h、12h、24h表达量持续上调的一组Cluster,以热图展现表达差异,同时对这组Cluster进行GO功能分类,选择2h、6h、12h、24h表达量持续上调且在膜上表达的1个基因进行综合分析。4)qRT-PCR实验验证转录组数据。提取雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h的四组RNA,反转录成cDNA备用。选择基因PBANKA＿1241500设计qRT-PCR引物,以β-tubulin为内参进行qRT-PCR实验。产物经琼脂糖凝胶电泳及Tanon扫胶仪进行可视化,使用Image J进行定量分析。5)基因加HA标签型虫株的构建。使用双交叉同源重组法给基因C端加HA标签,加标签质粒电转染至成熟野生型伯氏疟原虫裂殖体内,并通过尾静脉将转染后的裂殖体注射给小鼠。带有耐药基因的加标签型虫株通过小鼠饮用乙胺嘧啶进行阳性筛选,提取疟原虫基因组,PCR鉴定电转是否成功。电转成功后进行极限稀释法单克隆化筛选,PCR鉴定单克隆结果。6)候选基因的蛋白定位。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）检测蛋白表达阶段及表达部位,免疫印迹实验（Western blotting,WB）验证蛋白的表达情况。结果:1)转录组学GO功能分类。转录组学生信分析表明,在雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h,表达量持续上调的基因可检测到193个,GO功能分类显示在生物过程（Biological process,BP）这一大类中包括有机氮化合物代谢过程、生物合成的过程、细胞生物合成的过程等,其中有机氮化合物代谢过程占比最高,占比8.8%;细胞组分（Cellular component,CC）可分为膜片段、膜的本征成分、胞质部分等,其中膜片段占比最高,达27.8%;分子功能（Molecular function,MF）可分为结合、杂环化合物结合和催化活性等功能,其中结合功能催化活性占比最高,分别占比10.0%,杂环化合物结合功能次之,占比8%。2)qRT-PCR验证转录组学数据。根据下载自Plasmo DB的PBANKA＿1241500序列设计qRT-PCR引物,qRT-PCR结果表明PBANKA＿1241500表达量在2h、6h、12h、24h持续上调,即与转录组结果一致。3)候选基因蛋白表达阶段预测。IFA和WB结果表明PBANKA＿1241500在2h、6h、12h、24h都有表达,IFA结果表明该基因表达在膜上,在动合子阶段,于动合子基底部有明显高表达。结论:1)PBANKA＿1241500在疟原虫种属中保守性较好,在动合子基底部有高表达;2)结合疟原虫数据库对动合子转录组学数据进行筛选,可以为发现传播阻断疫苗候选基因提供依据。
丁祎[8]（2021）在《两种具有NTPase结构的疟原虫蛋白表达水平及功能研究》文中指出目的:疟疾（Malaria）是由疟原虫引起的原虫感染性疾病,是世界卫生组织重点公共卫生扶持项目之一。据世界卫生组织（WHO）2019年统计全球已有疟疾病例近2.28亿,每年在全世界死亡人数达百万人。疟原虫感染早期,红细胞感染率和配子体数量升高,然而配子体对蚊的感染力却显着减弱或完全丧失,即疟原虫向媒介按蚊的传播过程中,出现蚊阶段虫体发育障碍的自然传播阻断现象。通过蛋白质组学方法筛选出感染后期配子体原虫表达下调的蛋白共106个,对其蛋白功能域分析确定一组含有P-loop核苷三磷酸水解酶结构域（P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase,NTPase）的蛋白很可能与配子体的活力相关。本研究通过利用基因重组技术建立带有HA标签的目的基因疟原虫株,通过免疫学和分子生物学实验方法确定两个具有NTPase结构蛋白在疟原虫配子体的表达与定位,通过敲除目的基因确定目的蛋白在疟原虫发育过程中的生物学功能,以期为研制和开发新型抗疟药物靶点提供有效的实验室依据。研究方法:1.HA标签虫株的建立。通过基因重组技术构建插入HA标签的伯氏疟原虫株。利用电转仪将目的片段电转染至疟原虫成熟裂殖体,尾静脉感染小鼠,24h后给予小鼠乙胺嘧啶进行药物筛选。7d后尾静脉取血提取阳性克隆虫株的基因组DNA进行PCR鉴定,筛选HA标签虫株。2.候选基因基本生物学分析。使用间接免疫荧光实验（IFA）和免疫印迹技术（WB）确定HA标签虫株蛋白的定位与表达。3.体内实验。观察基因敲除虫株与野生虫株感染小鼠的原虫血症、生存率。4.体外实验。观察基因敲除虫株与野生虫株感染小鼠的雄配子出丝以及动合子培养形成数量。结果:1.通过IFA检测HA标签荧光信号证实PbANKA＿040430、PbANKA＿083270能够在疟原虫配子体阶段表达。运用WB检测发现PbANKA＿040430、PbANKA＿083270蛋白分子量与Plasmodb数据库的预测一致。2.通过线粒体纯化实验确定PbANKA＿040430、PbANKA＿083270在疟原虫线粒体表达。3.△pb040430、△pb083270虫株感染小鼠疟原虫血症与WT感染组相比未见统计学差异。△pb040430感染小鼠比WT感染小鼠提前出现死亡情况,两组均在第16天全部死亡。△pb083270感染小鼠与WT感染小鼠死亡情况相同,两组均在第18天全部死亡。4.△pb040430、△pb083270虫株感染小鼠雄配子出丝能力比WT感染小鼠雄配子出丝能力明显降低,且体外动合子培养实验结果显示敲除虫株感染小鼠形成动合子数量明显少于WT组。结论:1.具有P环NTPase结构的PbANKA＿040430、PbANKA＿083270蛋白在疟原虫配子体时期表达,表达部位位于疟原虫线粒体;2.具有P环NTPase结构的PbANKA＿040430、PbANKA＿083270蛋白缺失导致疟原虫雄性配子体出丝能力降低,动合子体外无法形成,提示其在疟原虫有性阶段发育过程中具有一定的生物学功能。
林祖锐,周耀武,张振彬,王剑,李建雄,段凯霞,许时燕,孙晓东[9]（2020）在《"新吉尔"疟原虫快速检测试剂盒检测效果评价》文中指出目的采用疟疾厚薄血片镜检法（金标准）和"新吉尔"疟原虫抗原检测试剂盒（胶体金法）进行平行检测,评价该疟疾快速检测试剂盒的检测效果。方法收集948份血样,采用镜检作为金标准与新吉尔快速诊断试剂盒进行盲法平行检测,计算试剂盒检测结果的灵敏度、特异性和诊断准确性,分析两种检测方法检测结果的一致性。结果共检测948份血样,其中镜检疟原虫阳性416份。以镜检法结果为标准,"新吉尔"疟原虫检测试剂盒检测灵敏度为96.88%,特异性为100%,诊断准确性为98.63%,一致性系数kappa为0.9721。其中检测间日疟的灵敏度为94.76%,特异度为100%,诊断准确性为98.62%,一致性系数kappa为0.9638;检测恶性疟灵敏度达98.41%,特异度为100%,诊断准确性为99.58%,一致性系数kappa达0.9892。间日疟原虫的检出下限介于105.19-157.94个/?l之间,恶性疟原虫的检测下限介于77.76-103.68个/?l之间。结论与镜检法相比,新吉尔疟原虫检测试剂盒具有较高的灵敏度、特异度和一致性,其中对恶性疟检测的灵敏度和一致性略高于间日疟,但是在原虫密度较低情况下漏检较多。该试剂盒可用于不具备开展镜检的基层医疗机构进行疟疾的快速检测和初筛,但不建议用于健康人群或无症状人群的筛查和检测。
刘紫玲[10]（2020）在《缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查》文中研究指明目的:世界卫生组织近三年来的疟疾报告显示全世界感染疟疾的临床确诊病例数略有增加（2016年2.16亿、2017年2.19亿、2018年2.28亿）,并且每年都有40万以上的患者死于疟疾感染。2016年,东南亚地区的疟疾确诊病例和死亡人数分别占全球的7%和6%。湄公河次区域（中国,缅甸,泰国,老挝,越南,柬埔寨）已将2030年消除疟疾作为区域性的抗疟目标。降低疟疾感染区域的感染率及感染范围并保持住疟疾传播中断地区的无疟疾状态,是实现这一目标的关键。在湄公河次区域,疟疾负担最重的缅甸毗邻多国,疟疾传播在大多数国际边境地区持续存在,这对周边国家产生了严重的危害,严重阻碍了区域性的疟疾消除计划。通常情况下,疟疾流行地区的大多数疟疾感染是无症状的,而确诊的急性疟疾病例只是“冰山一角”。虽然无症状疟疾感染很少导致急性疾病,但这类无症状的携带者能够感染蚊子,从而成为疟疾持续传播的潜在宿主。由于无症状感染和复杂的传播模式可能导致疟疾的持续,无症状感染中普遍存在的抗疟耐药株可能是耐药性迅速传播的基础。缅甸治疗恶性疟原虫感染使用的多种一线治疗药物均出现了杀虫效果减弱的清除延迟现象,耐药株的出现和传播威胁着本地消除疟疾的目标。恶性疟原虫的抗疟耐药性往往出现在感染率低的地区,特别是在东南亚和南美洲,然后扩展到撒哈拉以南非洲的高感染率地区。目前,无症状感染的耐药性数据还很有限。对无症状疟疾流行的可靠估计,监测抗疟耐药性的传播对维持疟疾控制的最新进展和实现区域消除疟疾的目标至关重要。本研究收集了缅甸分散在不同地区的数个城镇的人群滤纸血片,以分析无症状疟原虫的感染率以及恶性疟原虫感染中抗疟耐药性基因的突变。这些结果将提供关于缅甸多个地区无症状疟原虫的感染和恶性疟原虫疟疾耐药性状况的最新信息,对制定在该国消除恶性疟原虫感染的战略非常重要。研究方法:第一部分感染率的研究在2017年雨季对缅甸4个疟疾年发病率不同的乡镇（Bilin、Thabeikkyin、Banmauk和Paletwa）进行了横断面调查。共从当地村庄招募1991名志愿者,通过光学显微镜（LM）、快速诊断试验（RDTs）和nested PCR（nPCR）对疟原虫亚临床感染率进行评估。nPCR分析采用改进的混合池策略（pooling strategy）进行,该策略根据感染率的初步估计进行优化。数据处理方法包括:数据采用SPSS v.22.0进行分析。疟疾感染率通过交叉试验计算。Logistics回归分析计算二元变量的比值比（OR）,适当时使用卡方检验或Fisher’s精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。以LM或嵌套PCR为金标准,通过交叉试验,计算uRDT（超灵敏快速检测试验）和cRDT（传统快速检测试验）对本研究人群中镜检玻片和nPCR呈阳性恶性疟原虫感染检测的敏感性和特异性。第二部分的研究主要通过nPCR和测序,在缅甸地理分散的三个乡镇:Laiza、Banmauk和Paletwa进行横断面研究,测定恶性疟原虫耐药标记的遗传变异,耐药标记基因为:双氢叶酸还原酶（pfdhfr）、双氢蝶呤合成酶（pfdhps）、氯喹耐药转运蛋白（pfcrt）、多药耐药蛋白1（pfmdr1）、多药耐药相关蛋白1（pfmrp1）、Kelch蛋白13（k13）。数据处理方法包括:序列比对采用MEGA7.0.26,核苷酸和氨基酸位置按3D7参考序列编号。采用Microsoft Soft Excel 2007和SPSS 22.0软件对不同基因的SNP数据进行分析。采用皮尔逊卡方检验或Fisher’s精确检验确定差异有统计学意义（P<0.05）。采用中值连接算法（the median joining algorithm）,由DnaSP 6和Network software 5.01.0构建单体型网络。结果:第一部分:基于所有方法的疟疾总体感染率为13.9%（277/1991）,各乡镇之间的感染率差别很大,西部边境的Paletwa感染率最高（22.9%）,缅甸中部的Thabeikkyin感染率最低（3.9%）。nPCR方法较显微镜镜检（LM）和快速检测试验（RDTs）方法敏感,发现226人（11.4%）有疟原虫感染。在疟原虫种类中,间日疟原虫是所有地区最普遍的,而值得提出的是恶性疟原虫占西部城镇Paletwa感染的32%。两个基于hrp2抗原检测的RDTs共检测到103例恶性疟原虫感染,而uRDT检测到的恶性疟原虫感染比cRDT多20%。相比之下,LM只检出14例疟原虫感染,漏检了大部分亚临床感染。第二部分:pfdhfr、pfdhps、pfcrt、pfmdr1、pfmrp1和k13分别有92.5,97.6,84.0,98.7,68.3和61.4%的恶性疟原虫发生突变。pfcrt K76T、pfmdr1 N86Y、pfmdr1 I185K和pfmrp1 I876V分别有82.7%、2.5%、87.5%和59.8%的突变。pfdhfr、pfdhps、pfcrt、pfmdr1最常见的单体型分别为51I/59R/108N/164L、436A/437G/540E/581A、74I/75E/76T/220S/271E/326N/356T/371I、86N/130E/184Y/185K/1225V。此外,57株分离株在k13基因中有3种不同的点突变（K191T、F446I和P574L）和3种N端插入（N、NN、NNN）。共鉴定出43种不同的潜在与多药耐药相关的单体型。结论:1.横断面调查发现,在缅甸流行区人群中存在很高数量的无症状疟原虫感染,间日疟原虫成为主要的寄生虫种类。基于混合池策略的nPCR为大规模寄生虫流行病学研究提供了一种更实用的策略。对无症状的恶性疟原虫感染中耐药分子标记的分析显示,缅甸地区与耐药性相关的突变非常普遍,这些地区的恶性疟原虫对磺胺多辛乙胺嘧啶疗法和氯喹药物具有严重耐药性,恶性疟原虫治疗应该首选青蒿素联合疗法。对抗疟药物耐药性的分子监测可能有助于制定和更新在缅甸使用抗疟药物的指南。
二、两种试剂盒快速检测疟原虫的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种试剂盒快速检测疟原虫的比较（论文提纲范文）
（1）按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like在疟原虫感染按蚊过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 疟疾流行形势及控制策略 |
| 1.2 miRNA在疟原虫感染按蚊过程中的研究进展 |
| 1.3 miRNA参与的信号通路及其在按蚊感染过程中的功能研究 |
| 2 研究目标 |
| 2.1 总体目标 |
| 2.2 具体目标 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 按蚊tsl基因鉴定、分子结构及表达特征 |
| 3.2 按蚊miR-2944a-3p与tsl基因靶向关系的验证 |
| 3.3 按蚊miR-2944a-3p和tsl基因对疟原虫感染的影响 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 按蚊Torso-like基因鉴定、分子结构及表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验按蚊 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 tsl基因鉴定和序列分析 |
| 1.4 tsl基因编码蛋白生物信息学分析 |
| 1.5 tsl基因编码蛋白的系统发育分析 |
| 1.6 tsl基因在大劣按蚊各组织中的表达分析 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大劣按蚊tsl基因鉴定 |
| 2.2 大劣按蚊tsl基因编码蛋白的理化性质预测分析 |
| 2.3 TSL蛋白系统发育进化 |
| 2.4 大劣按蚊tsl基因表达特征 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 双荧光素酶报告基因系统验证miR-2944a-3p对tsl基因的调控作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 细胞效率评价转染 |
| 1.4 靶基因结合位点的预测 |
| 1.5 miR-2944a-3p片段的设计 |
| 1.6 双荧光素报告酶载体的构建 |
| 1.7 细胞转染 |
| 1.8 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 oligo效率评价及质粒效率评价 |
| 2.2 miRNA靶基因结合位点预测 |
| 2.3 双荧光素酶系统检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 miR-2944a-3p及预测靶基因tsl对疟原虫感染的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 斯氏按蚊饲养 |
| 1.5 RNA的提取 |
| 1.6 cDNA反转录 |
| 1.7 miRNA cDNA第一链合成 |
| 1.8 miR-2944a-3p及tsl在组织中特异性的表达 |
| 1.9 Tsl基因的扩增 |
| 1.10 体外转录模板的制备 |
| 1.11 制备dsRNA |
| 1.12 实验组及对照组显微注射 |
| 1.13 荧光定量PCR检测过表达及敲低效率 |
| 1.14 疟原虫感染按蚊 |
| 2 结果 |
| 2.1 miR-2944a-3p及tsl基因在各组织中的相对表达量 |
| 2.2 miR-2944a-3p过表达对疟原虫感染的影响 |
| 2.3 制备dsRNA |
| 2.4 干扰tsl基因对疟原虫感染的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表文章 |
| 附件 |
（2）Seahorse XF原位检测恶性疟原虫能量代谢新方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词(Abbreviation) |
| 综述-红内期疟原虫能量代谢过程 |
| 1 青蒿素类化合物抗疟机制现状 |
| 2 红内期疟原虫能量代谢概述 |
| 3 疟原虫糖酵解途径 |
| 4 疟原虫氧化磷酸化途径 |
| 5 疟原虫与能量代谢相关的其他途径 |
| 6 能量代谢途径与其他途径之间的相互联系 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于Seahorse XF分析仪——建立实时原位检测红内期恶性疟原虫能量代谢的新方法 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 磁珠分选恶性疟原虫的富集纯度 |
| 2.2 不同粘附剂对上机检测恶性疟原虫贴壁效果的影响 |
| 2.3 不同粘附剂与细胞密度对上机检测恶性疟原线粒体呼吸的影响 |
| 2.4 不同培养基对上机检测恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.5 不同浓度工具药Oligo、FCCP和Rot/AA对上机检测恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.6 基于Seahorse XF细胞外通量分析——实时原位检测红内期恶性疟原虫能量代谢方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 第二章 常用抗疟药物对恶性疟原虫增殖的抑制强度比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 青蒿素及其衍生物对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 2.2 国际一线抗疟药物对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 2.3 国际在研抗疟药物对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 常用抗疟药物和相关抑制剂对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 青蒿素及其衍生物对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.2 国际一线抗疟药物对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.3 国际在研抗疟药物对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.4 铁死亡诱导剂对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 2.5 离子通道抑制剂对恶性疟原虫线粒体呼吸的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 常用抗疟药物和相关抑制剂对恶性疟原虫糖酵解的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 青蒿素及其衍生物对恶性疟原虫糖酵解的影响 |
| 2.2 铁死亡诱导剂对恶性疟原虫糖酵解的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巴贝斯虫 |
| 1.1.1 我国羊巴贝斯虫的分离与鉴定 |
| 1.1.2 我国羊巴贝斯虫的分布情况 |
| 1.1.3 巴贝斯虫的体外培养 |
| 1.1.4 顶复门原虫基因功能研究技术现状 |
| 1.2 顶质体研究进展 |
| 1.2.1 顶质体的发现与起源 |
| 1.2.2 顶质体的基因组 |
| 1.2.3 顶质体的生物学功能 |
| 1.2.3.1 顶质体II型脂肪酸生物合成 |
| 1.2.3.2 顶质体铁硫簇生物合成 |
| 1.2.3.3 顶质体血红素生物合成 |
| 1.2.3.4 顶质体类异戊二烯生物合成 |
| 1.3 自噬 |
| 1.3.1 经典自噬途径 |
| 1.3.2 疟原虫及弓形虫自噬的研究现状 |
| 1.3.3 感染疟原虫或弓形虫宿主细胞自噬研究现状 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 梨形虫ATG生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 梨形虫ATG基因的生物信息学分析及扩增 |
| 2.2.2 梨形虫ATG序列比对及相似性分析 |
| 2.2.3 遗传进化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 梨形虫ATG基因的分布 |
| 2.3.2 梨形虫ATG氨基酸序列比对分析 |
| 2.3.3 基于顶复门原虫ATG氨基酸序列构建的遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 羊巴贝斯虫顶质体与线粒体基因组序列测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 顶质体和线粒体基因组的扩增与测序 |
| 3.2.3 顶质体和线粒体基因组的拼接与注释 |
| 3.2.4 cytb基因序列比对 |
| 3.2.5 系统发育分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 顶质体和线粒体基因组序列分析 |
| 3.3.2 羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组与其他顶复门原虫比对分析 |
| 3.3.3 Sanger与Illumina方法测序的顶质体和线粒体基因组比对分析 |
| 3.3.4 cytb基因序列分析 |
| 3.3.5 系统进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 顶质体基因组 |
| 3.4.2 线粒体基因组 |
| 第四章 羊巴贝斯虫未定种新疆株瞬时和稳定转染体系的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 羊巴贝斯虫未定种新疆株体外培养 |
| 4.2.2 评估BSD对羊巴贝斯虫未定种新疆株抑制效果 |
| 4.2.3 质粒的构建 |
| 4.2.4 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.2.5 BspXJ稳定转染虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.3.2 BspXJ稳定转染虫株的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BspXJ瞬时转染 |
| 4.4.2 BspXJ稳定转染 |
| 第五章 ATG蛋白亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 BspXJ的ATG、顶质体Marker分子基因的扩增 |
| 5.2.2 ATG和顶质体Marker分子基因分析 |
| 5.2.3 原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 蛋白诱导表达及纯化 |
| 5.2.5 抗体的制备及鉴定 |
| 5.2.6 ATG3与ATG8过表达质粒的构建 |
| 5.2.7 ATG3与ATG8过表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 5.2.8 ATG3与ATG8亚细胞定位 |
| 5.2.9 ATG3和ATG8互作蛋白的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目的基因分析 |
| 5.3.2 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 5.3.3 抗体纯化及鉴定 |
| 5.3.4 ATG3过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.5 ATG8过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.6 ATG3和ATG8在BspXJ中的亚细胞定位 |
| 5.3.7 ATG3与ATG8相互作用蛋白鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 自噬抑制剂和诱导剂对羊巴贝斯虫ATG表达丰度的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 实验材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 筛选BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.2.2 qPCR检测HBSS饥饿诱导BspXJ后ATG基因表达丰度 |
| 6.2.3 自噬抑制剂和诱导剂处理BspXJ后ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.3.2 饥饿诱导对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3.3 自噬抑制剂和诱导剂对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 羊巴贝斯虫ATG基因敲除虫株的构建及条件性基因敲除平台的建立 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 主要仪器 |
| 7.1.2 实验材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 ATG基因敲除虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.2 TIR1表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.3 IAA对BspXJ虫株生长的影响 |
| 7.2.4 mCherry-AID-3HA表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 ATG3和ATG8 基因敲除虫株的筛选及鉴定 |
| 7.3.2 TIR1-3Flag表达虫株的PCR、WB及 IFA鉴定结果 |
| 7.3.3 IAA对BspXJ形态及染虫率的影响 |
| 7.3.4 m Cherry-AID-3HA虫株WB及IFA鉴定 |
| 7.3.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A ATGs氨基酸比对结果 |
| 附录B 顶质体基因组扩增引物、线粒体基因组比对图和顶质体基因组图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫与口蹄疫病毒 |
| 1.2 口蹄疫流行现状与防控 |
| 1.3 FMDV诊断技术 |
| 1.4 环介导等温扩增技术及应用 |
| 1.4.1 LAMP简介 |
| 1.4.2 LAMP扩增原理 |
| 1.4.3 LAMP反应体系和产物检测 |
| 1.4.4 LAMP的发展及应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 第二章 口蹄疫病毒目的基因3D片段的筛选、合成与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂与溶液配制 |
| 2.1.2 生物信息学软件 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 FMDV七种血清型目的片段序列筛选与合成 |
| 2.2.2 FMDV七种血清型39 个甘油菌扩大培养及质粒DNA提取 |
| 2.2.3 重组质粒的PCR扩增鉴定及测序鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FMDV七个血清型序列筛选结果 |
| 2.3.2 FMDV七种血清型甘油菌扩大培养及质粒DNA提取 |
| 2.3.3 FMDV七个血清型序列PCR鉴定及测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 FMDV可视化 RT-LAMP检测方法的建立及优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要生物试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 RNA模板制备 |
| 3.2.3 RT-LAMP方法引物筛选 |
| 3.2.4 RT-LAMP方法引物含量优化 |
| 3.2.5 RT-LAMP方法反应时间优化 |
| 3.2.6 温度优化 |
| 3.2.7 RT-LAMP方法染料的筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 模板制备 |
| 3.3.3 RT-LAMP引物筛选结果 |
| 3.3.4 RT-LAMP方法引物浓度筛选结果 |
| 3.3.5 时间优化结果 |
| 3.3.6 温度优化结果 |
| 3.3.7 RT-LAMP方法染料的筛选结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 RT-LAMP方法的特异性、敏感性检测及临床样品检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒和病毒 |
| 4.1.2 主要生物试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 特异性测定 |
| 4.2.2 敏感性测定 |
| 4.2.3 临床样品的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 交叉反应验证 |
| 4.3.2 敏感性检测 |
| 4.3.3 临床样品的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）伯氏疟原虫Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26双靶位联合疫苗传播阻断潜能的评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 数据库网址及生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒、宿主菌、虫株与实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂(盒) |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 基因扩增及原核蛋白表达载体构建 |
| 2.2.3 融合蛋白表达与纯化 |
| 2.2.4 实验动物免疫及血清采集 |
| 2.2.5 ELISA检测抗血清的抗体滴度 |
| 2.2.6 P.berghei配子体和动合子虫抗原提取 |
| 2.2.7 检测混合与融合免疫血清和天然蛋白的特异性反应 |
| 2.2.8 传播阻断能力的评估 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.2 pET32a(+)- Pbg37-PSOP25和pET32a(+)- PSOP25-PSOP26 重组载体的构建 |
| 3.3 rPbg37-PSOP25和rPSOP25-PSOP26 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.4 抗rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26 血清特异性抗体检测 |
| 3.5 抗rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26 血清可与疟原虫的天然蛋白的特异性结合 |
| 3.6 抗rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26 鼠血清传播阻断能力较强 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 疟疾疫苗的研究进展及前景展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）蛋白芯片技术在疟疾血清学研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 两种不同包被玻片应用于蛋白芯片的比较分析 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 玻片 |
| 1.2 蛋白、血清及抗体 |
| 1.3 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 氨基化玻片的制备 |
| 2.2 基于蛋白芯片技术的血清学分析 |
| 3. 实验数据分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 两种玻片应用于蛋白芯片的制备及质量评估 |
| 4.2 两种蛋白芯片均可应用于间日疟患者血清的筛查 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第2章 蛋白芯片技术应用于韩国间日疟血清流行病学调查 |
| 1. 仪器与材料 |
| 1.1 玻片 |
| 1.2 蛋白、血清及抗体 |
| 1.3 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 氨基化玻片的制备 |
| 2.2 基于蛋白芯片技术的血清学分析 |
| 3 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 针对三种间日疟原虫重组抗原的血清学筛查 |
| 4.2 有无疟疾感染史的血清学反应的比较分析 |
| 5 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第3章 基于疟原虫感染体液免疫应答谱的卵形疟原虫候选抗原筛选 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 中提质粒 |
| 2.2 抗原候选分子高通量表达 |
| 2.3 Westem-blot分析 |
| 2.4 基于蛋白芯片技术的血清学分析 |
| 3 数据分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 免疫印迹(Western-blot)分析无细胞表达蛋白 |
| 4.2 重组卵形疟蛋白芯片的第一轮筛选及质量评价 |
| 4.3 重组卵形疟蛋白芯片的第二轮筛查及质量评价 |
| 4.4 重组卵形疟蛋白芯片第二轮筛查结果的进一步分析 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）应用伯氏疟原虫动合子转录组学筛选潜在传播阻断疫苗候选基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂与材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 野生型伯氏疟原虫的合子、retort、动合子的培养和纯化 |
| 2.2.2 转录组学实验流程 |
| 2.2.3 转录组学生物信息学分析 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR)验证转录组测序结果 |
| 2.2.5 PBANKA＿1241500加HA标签型虫株的构建 |
| 2.2.6 检测PBANKA＿1241500 蛋白表达阶段 |
| 2.3 伦理批准 |
| 3 结果 |
| 3.1 野生型伯氏疟原虫2h、6h、12h和24h动合子纯化结果 |
| 3.2 qRT-PCR验证转录组学结果 |
| 3.3 动合子转录组学生信分析 |
| 3.4 候选基因在不同疟原虫种属中的同源性分析 |
| 3.5 PL0034HA-PBANKA＿1241500-5U-3U打靶载体的构建与鉴定 |
| 3.6 加标签型虫株的获取与鉴定 |
| 3.7 Western blotting检测蛋白表达阶段 |
| 3.8 IFA检测PBANKA＿1241500 的表达阶段 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 动合子入侵按蚊相关机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）两种具有NTPase结构的疟原虫蛋白表达水平及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 主要研究方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 加标签基因虫株建立 |
| 2.2.3 间接免疫荧光分析 |
| 2.2.4 免疫印迹 |
| 2.2.5 线粒体蛋白提取 |
| 2.2.6 免疫沉淀技术纯化蛋白 |
| 2.2.7 质谱分析 |
| 2.2.8 基因敲除虫株建立 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 网络信息学评估15 个具有NTPase功能结构域蛋白 |
| 3.2 成功构建HA打靶载体 |
| 3.3 成功获得加标签虫株 |
| 3.4 加标签虫株的定位与表达 |
| 3.5 加标签虫株线粒体蛋白纯化鉴定 |
| 3.6 质谱分析 |
| 3.7 成功获得基因敲除虫株 |
| 3.8 基因敲除虫株有性阶段发育检测 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 NTPase的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）"新吉尔"疟原虫快速检测试剂盒检测效果评价（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 血样 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 样本量的确定 |
| 2.2 镜检 |
| 2.3 新吉尔疟原虫快速检测试剂盒检测 |
| 2.4 低原虫密度血样的检测 |
| 2.5 间日疟原虫和恶性疟原虫检测下限的初步评价 |
| 2.6 交叉反应检测 |
| 2.7 质量控制 |
| 2.8 统计学分析 |
| 结 果 |
| 1 血样基本信息 |
| 2 镜检结果 |
| 3 试剂盒检测结果与镜检法比较 |
| 4 试剂盒检测间日疟和恶性疟效果比较 |
| 5 试剂盒检测低原虫密度血样检测结果 |
| 6 试剂盒检测间日疟原虫和恶性疟原虫下限的确定 |
| 6.1 间日疟原虫检测下限 |
| 6.2 恶性疟原虫检测下限 |
| 7 试剂盒检测的交叉反应性 |
| 讨 论 |
（10）缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :缅甸无症状疟疾感染流行特点分析 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 调查地点 |
| 2.1.4 研究样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 光学显微镜镜检及快速检测实验鉴定无症状疟疾感染 |
| 2.2.2 滤纸血样本的DNA抽提 |
| 2.2.3 基于混合池策略的 nested PCR 鉴定无症状疟疾的感染类型 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 疟疾感染率的地区差异 |
| 3.2 不同方法检测恶性疟原虫感染的比较 |
| 3.3 无症状疟疾感染的危险因素分析 |
| 3.4 混合池策略在分析流行病学检测中的效率 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :缅甸无症状恶性疟原虫感染中与耐药性相关的遗传变异 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 研究地点和样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 恶性疟原虫无症状感染的诊断 |
| 2.2.2 耐药基因的选择、扩增和测序 |
| 2.2.3 序列分析与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 横断面调查的血液样本中的无症状感染 |
| 3.2 与 SP 耐药相关的的 Pfdhfr 和 pfdhps 突变 |
| 3.3 与氯喹耐药相关的pfcrt和 pfmdr1 突变 |
| 3.4 Pfmrp1突变 |
| 3.5 K13突变 |
| 3.6 单体型网络的构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、两种试剂盒快速检测疟原虫的比较（论文参考文献）
- [1]按蚊miR-2944a-3p及其预测靶基因torso-like在疟原虫感染按蚊过程中的作用研究[D]. 朱凌倩. 中国疾病预防控制中心, 2021
- [2]Seahorse XF原位检测恶性疟原虫能量代谢新方法的建立及其应用[D]. 马冀. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究[D]. 王晓星. 中国农业科学院, 2021
- [4]口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的初步建立与评价[D]. 侯谦. 中国农业科学院, 2021
- [5]伯氏疟原虫Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26双靶位联合疫苗传播阻断潜能的评估[D]. 杨帆. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]蛋白芯片技术在疟疾血清学研究中的应用[D]. 胡凤悦. 扬州大学, 2021
- [7]应用伯氏疟原虫动合子转录组学筛选潜在传播阻断疫苗候选基因[D]. 吴宇迪. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]两种具有NTPase结构的疟原虫蛋白表达水平及功能研究[D]. 丁祎. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]"新吉尔"疟原虫快速检测试剂盒检测效果评价[J]. 林祖锐,周耀武,张振彬,王剑,李建雄,段凯霞,许时燕,孙晓东. 中国病原生物学杂志, 2020(07)
- [10]缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查[D]. 刘紫玲. 中国医科大学, 2020(01)
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