一、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt-1 Extracellular Domain 1-3 Loop cDNA in Pichia pastoris, Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Activity（论文文献综述）
刘国强[1]（2018）在《靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制》文中认为目的:PD-1/PD-L1是目前抗癌药物研发的明星靶点,截止到2018年3月,全球已经有5个抗PD-1/PD-L1的抗体药物上市,并取得了良好的临床疗效。靶向该通路的抗体药物通过阻断PD-1/PD-L1的结合,消除PD-1蛋白对抗原呈递信号的负向调控作用,恢复T细胞对PD-L1过表达的肿瘤细胞的识别杀伤能力,达到克服肿瘤免疫逃逸的目的。正常情况下PD-1胞外域接受配体提供的信号,负向调控T细胞的活化与增殖,避免T细胞过度活化导致的自身免疫性疾病。但该通路被PD-L1过表达的肿瘤细胞利用后,会促进肿瘤细胞的免疫逃逸。针对该通路的特点,本课题靶向PD-1与PD-L1结合的配体界面区设计了一种高亲和力的纳米抗体,通过阻断PD-1胞外域与PD-L1的结合,恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:1.噬菌体展示技术淘筛高亲和力抗体通过生物信息学的手段,模拟PD-1与PD-L1的结合,确定胞外域与配体结合界面的氨基酸序列,并人工合成该段序列。从商用人单域抗体噬菌体展示库中经多轮ELISA淘筛获取对结合界面的高亲和力单域抗体。通过测序获得DNA序列后,翻译获得其氨基酸序列。2.单域抗体的真核表达系统构建（1）单域抗体氨基酸序列的优化:通过与同源人单域抗体比较,对可能发生突变的氨基酸进行修正。（2）真核表达目的基因的合成与载体构建取优化后的抗体序列,用毕赤酵母偏爱密码子优化,在该基因的前端加上MF-α分泌信号肽、在末端加上His tag与终止子、在两端加入酶切位点XhoⅠ与XbaⅠ,并人工合成该基因。通过PCR法扩增。与pGAPzα-A空载体双酶切后,用T4连接酶连接,并转化至E.coli JM109中。（3）毕赤酵母X-33高效表达株的构建与筛选提取重组质粒,线性化并电转化至表达宿主毕赤酵母X-33。通过菌落PCR与博来霉素（Zeocin）高抗性筛选获得阳性转化子,并通过表达鉴定获得高表达菌株。（4）真核表达系统表达产物的纯化与亲和力常数测定取发酵上清液,用过硫酸铵沉淀除去大部分杂质后,通过分子筛与镍柱进行纯化。纯化产物置换缓冲液后,用ELISA法检测,确定亲和力常数。（5）糖基化鉴定:取纯化后的产物用内切糖苷酶H（Endo H）鉴定糖基化。3.单域抗体的原核表达系统构建（1）原核表达目的基因的合成与载体构建取优化后的序列,在末端加入His与终止子、在两端加入pET21b载体上含有的Nde I、Hind III两个酶切位点人工合成后PCR扩增,并通过双酶切试验连接至pET21b上,热激法转化至E.coli DH5α。（2）E.coli BL21（DE）的高效表达株的构建筛选:提取重组质粒,同法转化至E.coli BL21（DE）中,用菌落PCR及表达鉴定的手法进行高表达筛选。（3）可溶性表达产物的纯化采用低温培养的形式诱导工程菌进行可溶性表达,同法确认表达形式,并用CM柱及镍柱对破菌上清进行纯化。3.活性鉴定取获得的纯化产物,与人PD-1蛋白共孵育,加至PD-L1蛋白过表达的肿瘤细胞中,用带FITC标记的His tag抗体做二抗,用流式细胞仪检测荧光。结果:1.噬菌体筛选结果成功获17株阳性菌株,通过测序分析16个阳性菌编码序列高度同源,16个阳性菌的编码的V区蛋白序列完全一致。成功淘筛到高亲和力的靶向PD-1配体结合界面的单域抗体。2.真核表达体系的构建结果将优化后的抗体命名为Nb:PD-1,成功获得Nb:PD-1的自分泌型毕赤酵母X-33高效表达株,该工程菌糖基化酶活力不足。并用CM柱与镍柱成功获得纯度较高的表达产物,通过内切糖苷酶确认发生里部分糖基化修饰。3.原核表达体系的构建结果成功获得Nb:PD-1的E.coli BL21（DE）高效表达株。成功构建了可溶性表达发酵体系,并成功获得纯度较高的表达产物。4.活性鉴定结果间接ELISA法测得真核表达的Nb:PD-1亲和力为106mol/L,原核表达的Nb:PD-1亲和力为105mol/L。获得的抗体经流式细胞仪鉴定有活性。结论:成功淘筛到靶向PD-1配体结合界面的单域抗体,并优化了该抗体的氨基酸序列。并成功构建了真核与原核两种表达体系,且成功获得了纯化较高的表达产物,初步鉴定了其具有活性与亲和力。本研究成功研制出靶向PD-1配体结合界面的单域抗体Nb:PD-1。
孔晶瑶[2]（2017）在《重组跨膜肽—人表皮生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达》文中研究表明表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）是一类含有53个氨基酸的小分子多肽,结构稳定,分子量约为6.0k Da。EGF能促进细胞增殖、分化和迁移,参与胚胎发育、组织再生等生理过程。在临床中应用于灼伤烫伤等各类创伤、溃疡以及角膜损伤等方面的医治。另外,EGF还可以加快正常表皮细胞的新陈代谢能力,作为化妆品添加剂添加到美容护肤品中可发挥延缓皮肤衰老,美白嫩肤的作用。近年来对于EGF的研究俞发成熟,不论是作为医疗药品还是化妆品添加剂均存在巨大的应用价值与不容小觑的市场前景。细胞跨膜肽（cell-penetratingpeptides,CPPs）是近年来发现的一种能有效地穿越细胞膜的多肽,TAT蛋白属于阳离子型细胞跨膜肽,是HIV-1的反式作用因子,研究证明TAT蛋白在保障不破坏细胞膜的条件下,可以介导外源蛋白、核酸等物质安全有效地进入细胞,且具有转导作用的是47-57的11个氨基酸残基。TAT蛋白作为一种新型药物运载工具,具有独特的优势,应用前景广阔。本研究将人表皮生长因子（human epidermal growth factor,h EGF）与细胞跨膜肽TAT（47-57）相连,意在改善h EGF透皮能力,增加透皮率,从而更好地发挥生物学活性。将TAT（47-57）与h EGF氨基酸序列串联,根据毕赤酵母偏爱密码子,在不改变氨基酸序列的前提下设计合成TAT-h EGF基因序列。利用基因重组技术构建真核表达载体p PICZαA-TAT-h EGF,经线性化后电转至毕赤酵母X-33,经筛选、鉴定,选取成功转化的重组子进行甲醇诱导表达,筛选出高表达菌株,且第6天的目的蛋白表达量最高,可达约0.6mg/m L,最佳诱导p H值为4.6。摇瓶诱导表达的蛋白上清通过等电点沉淀、40%饱和硫酸铵盐析初步分离浓缩目的蛋白,通过凝胶过滤层析,使用30mmol/L醋酸-醋酸钠（p H5.2）缓冲液成功洗脱分离蛋白,进而通过离子交换层析,使用30mmol/L醋酸-醋酸钠（p H5.2）缓冲液含300mmol/L的Na Cl成功获得纯化的融合蛋白TAT-h EGF。生物活性实验结果表明,纯化所得的融合蛋白对NIH/3T3有明显的促进增殖作用。
梁引库[3]（2016）在《血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究》文中研究表明Kringle 5是纤溶酶原的第五个片段,分子量约8KD,是Cao等于1977年通过蛋白酶消化人纤溶酶原和分子克隆的方法得到的。Kringle 5主要作用于血管内皮细胞,使血管内皮细胞生长周期停滞而导致血管内皮细胞凋亡,Kringle 5还能抑制血管内皮细胞的迁移。但Kringle 5对于其它细胞,如成纤维细胞、人干细胞等没有作用。虽然Kringle 5具有抑制血管内皮细胞增殖和分化的作用,对于治疗肿瘤具有重要的意义,但Kringle 5的作用靶点是什么?它是如何导致血管内皮细胞凋亡的?等等问题,到目前为止,还没有明确的答案。针对这种情况,本研究以原核表达的Kringle 5为靶蛋白筛选Kringle 5在体内的结合蛋白,并通过SPR和前沿色谱法确认了VDAC-1与Kringle 5的结合和相互作用。我们试图建立一种通过噬菌体肽库技术结合分子对接技术和SPR技术筛选蛋白体内结合蛋白的快速筛选系统,为Kringle 5体内结合蛋白的筛选和研究其抑制血管内皮细胞生长机理奠定基础。本研究主要取得了以下成果：（1） 根据NCBI数据库中人Kringle 5蛋白的基因序列设计引物扩增出Kringle 5基因,将其成功表达在pET28b原核表达载体中,并在BL21细胞中诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现,带有His标签的Kringle 5蛋白出现在破碎细胞上清液中。上清液经镍亲和柱分离后,得到纯度约为86%的重组Kringle 5蛋白。（2）以Kringle 5蛋白为靶蛋白,对噬菌体环7肽库进行筛选。4轮筛选后,噬菌体回收率从6.25×10-9提高到了1.57×10-7,噬菌体得到富集。挑取噬菌体单克隆测序后发现,随机挑取的50个单克隆分别表达13个短肽,ELASA分析这13个短肽与Kringle5的亲和力,最终确定IGNSNTL为Kringle 5的高亲和短肽。以该短肽比对NCBI人源蛋白质数据库,共找到103种与该短肽同源性较高的蛋白。逐一比对分析这103种蛋白的氨基酸序列及功能,发现这些蛋白归属于28类。根据这28类蛋白的功能、作用以及它们在细胞内的作用途径和作用方式,初步认确定Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor等9种蛋白可能是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。根据Kringle 5在人体内的作用方式和作用途径推断,VDAC-1、Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12可能为Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。（3）同源建模和直接建模的方式构建了Kringle 5及初步筛选的9种蛋白的晶体结构。HEX软件分析了Kringle 5蛋白与这9种蛋白的作用,分子对接结果发现Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和Protein C-ets-2与Kringle 5具有相对较低的结合自由能,其结合自由能分别为-837.55 J/mol、-822.65 J/mol和-832.6 J/mol.蛋白活性位点分析发现,Kringle 5与Protein C-ets-2作用时并没有进入它形成的活性口袋,但进入了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2形成的活性口袋中。分析Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、 VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2蛋白活性中心参与与Kringle 5作用的氨基酸,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12活性中心参与对接的氨基酸多数出现在IGNSNTL筛选短肽中,说明IGNSNTL短肽较好地模拟了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白的活性中心。根据化学反应能量最低原则和化学反应空间匹配原则,推断Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和VDAC-1蛋白为Kringle 5蛋白的结合蛋白。（4）为了证明噬菌体展示技术筛选的9种蛋白能否与Kringle 5作用,明确分子对接技术在结合蛋白筛选中的作用,本部分构建了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白的原核表达载体,经诱导表达后,利用SPR技术分析了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白与Kringle 5蛋白的相互作用。SPR分析表明,除了VDAC-1蛋白,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12等8种蛋白均不能与Kringle 5发生作用,表明VDAC-1是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。（5）根据NCBI中VDAC-1的基因序列,以pCMV6-XL5-VDAC-1为模版克隆了VDAC-1基因,构建了VDAC-1蛋白的原核表达载体pET28b-VDAC-1,并在BL21细胞中诱导表达成功。SDS-PAGE电泳分析发现VDAC-1蛋白以包涵体的形式表达。经变性复性后分离和柱上复性分离两种分离方法的分离后,变性复性后分离的分离方法蛋白产率高于柱上复性分离方法蛋白的产率。研究VDAC-1蛋白复性条件发现,当复性条件为溶液pH值8.0、氧化型谷胱甘肽浓度0.2 mmol/L、还原型谷胱甘肽的浓度1 mmol/L时VDAC-1蛋白的复性产率最高,蛋白产率可达55.6%。（6）优化Kringle 5在CM5芯片上的固定条件后,以该优化条件固定Kringle 5于CM芯片上,分析了VDAC-1与Kringle 5相互作用的热力学参数,结果表明,VDAC-1与Kringle 5的结合常数为2.43×e3 L/mol、解离常数为4.12×e-4L/mol。前沿色谱法进一步分析了Kringle 5与VDAC-1的相互作用,结果表明VDAC-1能与固定化的Kringle 5发生相互作用,其结合常数为23.54 L/mol,解离常数为0.097 L/mol。因此VDAC-1为Kringle 5的体内结合蛋白。本研究通过噬菌体展示肽库技术结合分子模拟对接技术筛选Kringle 5的体内结合蛋白,SPR证明该法能有效缩小Kringle 5结合蛋白的筛选范围,通过该法筛选的Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白中的VDAC-1蛋白经SPR与前沿色谱证明能与Kringle 5发生作用。因此以噬菌体展示肽库技术为基础结合分子模拟对接技术和SPR技术筛选靶蛋白体内结合蛋白的方法是有效和可行的。
李本强[4]（2015）在《鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究》文中研究说明新城疫目前仍是大多数养禽国危害最严重的禽病之一,不仅对养禽业造成危害,还对哺乳动物和人类健康具有潜在的威胁。新城疫由于传染性强,传播速度快,给国家和地区的贸易限制和封锁造成了巨大的经济损失。我国将其列为一类动物疾病。病毒性传染病目前尚没有特异性药物治疗,只能依靠疫苗免疫等进行预防。因此,研究特异高效的抗病毒药物是防治病毒性疫病所面临的一项紧迫课题。近年来出现的反义RNA、RNAi等基因治疗技术,都试图在细胞内对感染的病毒在核酸水平上进行干预,从而达到抑制病毒合成的治疗目的。随着细胞生物学和抗体工程技术的发展,出现了一种新兴细胞内免疫及治疗技术——胞内抗体技术。胞内抗体技术是将小分子抗体导入细胞内引起细胞的一系列生物过程发生改变的技术,该技术通过特异性干扰或阻断细胞内特定生物大分子合成、加工和分泌过程而发挥作用。鉴于新城疫病毒转录复合体蛋白在病毒复制增殖过程中所处的关键环节,本研究拟研制能够与新城疫病毒转录复合体蛋白之一的磷蛋白结合的胞内抗体。通过胞内抗体与P蛋白在NDV感染的细胞内特异性结合,从而对病毒转录复合物形成进行干扰及对病毒增殖进行抑制,为新城疫病毒特效药物的研发以及病毒复制机制的研究提供一种新的思路。为此,本论文从以下几个方面开展研究。1、鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白的单链抗体（sc Fv）的筛选及鉴定（1）鸡源性单链抗体基因表达文库的建立单链抗体是将抗体的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）通过一段柔性的连接肽（linker）连接所形成的两个可变区首尾相连的单一肽链。通过用NDV VG/GA型疫苗免疫鸡,提取其脾脏总m RNA。设计鸡抗体编码基因特异性引物,采用RT-PCR和PCR技术扩增出抗NDV单链抗体的轻链可变区和重链可变区基因,利用重叠延伸PCR将VH和VL通过一条linker连接起来（VH-linker-VL）构建sc Fv。将sc Fv基因克隆于原核表达载体p OPE101-XP,该载体主要用于单链抗体的表达和筛选。将构建的重组质粒p OPE101-XP-sc Fv转化感受态细胞E.coli JM109,PCR鉴定为阳性的克隆送检测序。挑选测序正确的阳性克隆经IPTG诱导表达,提取周质腔可溶性sc Fv,SDS-PAGE检验表达结果证明成功构建了鸡源性单链抗体表达文库。经计算单链抗体库库容量为3.8×106,可用于下一步单链抗体的筛选。（2）抗新城疫病毒磷蛋白（P）单链抗体的筛选及鉴定根据Genbank中已经发表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列,设计了一对特异性引物,运用RT-PCR方法从基因组中扩增出P蛋白编码基因的c DNA。P蛋白编码基因全长1287 bp,编码429个氨基酸。同时将测序正确的P蛋白基因序列连接原核表达载体构建重组原核表达质粒p ET-28a-P,进而表达出P蛋白,为筛选针对磷蛋白的单链抗体提供抗原。以纯化后的新城疫病毒磷蛋白为抗原,建立并优化可用于筛选抗NDV磷蛋白sc Fv的间接ELISA方法。从上述构建的单链抗体库中进行筛选,获得两株亲和力较高的阳性克隆sc Fv ZL.17和sc Fv ZL.103。对鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的基因序列分析,结果表明高变区主要集中于CDR区,碱基变化很大。Western blot分析表明两株单链抗体都能够与病毒的磷蛋白特异性结合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在细胞中的表达及生物活性分析为获得针对NDV磷蛋白的细胞内抗体,本研究将上述两个单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pc DNA3.1（+）,成功构建了针对磷蛋白的胞浆型胞内抗体表达质粒pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17。采用脂质体分别将pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17导入细胞内,通过RT-PCR和Western blot分析证明,在细胞内,其编码胞内抗体的m RNA获得转录,胞内抗体成功表达,间接免疫荧光技术也进一步证实胞内抗体在细胞内获得表达。流式细胞证明重组胞内抗体对宿主细胞活性无显着影响;并且通过Western blot和免疫共沉淀实验评估了表达的胞内抗体在细胞内与新城疫病毒磷蛋白的结合能力,证明胞内抗体能够在细胞内与磷蛋白能够特异性结合。通过亚细胞定位实验发现胞内抗体主要分布于细胞质,与磷蛋白的分布区域正好重叠。抗磷蛋白胞内抗体与新城疫病毒相互作用后,血凝实验检测病毒滴度,结果表明转染细胞内的胞内抗体pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17能够阻断病毒对细胞的侵染,因而对NDV感染的细胞具有保护效果,依次是p CDNA3.1-sc Fv ZL103>p CDNA3.1-sc Fv ZL17>BHK21。通过荧光定量PCR证明,胞内抗体具有干扰c RNA、v RNA和m RNA合成的效果,具有抑制病毒产生的功能。3、可穿膜的重组胞内抗体融合蛋白的表达及生物活性研究上述抗体需要通过脂质体才能导入细胞,既繁琐,效率也不高。为了探索能顺利将抗体导入细胞的方法及构建穿膜型胞内抗体,本研究选择报道的融合穿膜肽HIV-TAT衍生片段CTP512,将其分别和上述筛选的两个单链抗体表达基因融合,导入原核表达载体p ET28a（+）,构建穿膜型胞内抗体表达质粒p ET28a-sc Fv ZL-CTP。进行了穿膜抗体生物学特性研究,设计不同穿膜抗体浓度进行穿膜实验,筛选出最佳的穿膜浓度为3μM;MTT法检测CTP融合穿膜抗体对细胞活性的影响,检测发现与对照组相比,穿膜抗体蛋白对细胞的增殖和活力无明显影响;间接免疫荧光实验分析显示,穿膜抗体定位于细胞浆,能与磷蛋白分布区域重叠;TCID50检测穿膜抗体对DNV感染细胞的保护效果,结果显示,穿膜抗体对细胞有明显保护效果,依次是p ET28a-sc Fv ZL103-CTP>p ET28a-sc Fv ZL17-CTP>Control,与空白对照相比差异显着（P≤0.05）;荧光定量PCR检测穿膜抗体对细胞内NDV复制及转录的影响,结果显示,穿膜抗体显着降低了NDV的c RNA、v RNA和m RNA的含量,表明其具有抑制NDV复制的功能。本研究结果不仅为跨膜型胞内抗体研究提供了一种新思路,也为研究外源蛋白导入细胞膜的转膜技术提供了有益借鉴。本研究利用基因重组技术,首先成功构建了库容量为3.8×106鸡源性单链抗体库,并从库中筛选到针对磷蛋白的两株单链抗体;根据胞内抗体构建策略,研制了针对新城疫病毒磷蛋白的胞内抗体,实验证实胞内抗体对细胞具有保护效果及干扰新城疫病毒基因在细胞内的复制及转录;成功构建跨膜型胞内抗体导入质粒,使胞内抗体与蛋白跨膜转运区域融合表达,实验证实穿膜抗体定位于细胞浆,且对细胞具有保护效果;荧光定量PCR鉴定穿膜抗体能够干扰新城疫病毒感染细胞后的复制及转录。本研究为研究NDV在细胞内复制增殖机制,筛选细胞内有效抗NDV抗体,进而探索细胞内治疗NDV等病毒感染新途径进行了有益探索。
侯玥[5]（2014）在《LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究》文中进行了进一步梳理灵芝自古便是中国传统医学中的珍贵药材，被认为具有滋补强身、扶正固本之效。近代科学研究也证实灵芝的粗提物具有抗肿瘤和增强免疫力之功能，然而多数研究认为灵芝主要活性成分为多醣体及三萜类化合物，直至1989年Kino等科学家自灵芝的菌丝体纯化出具有免疫调节功能的小分子蛋白质—灵芝免疫调节蛋白（LZ-8），确立另一种活性物质免疫调节蛋白的存在。二十多年以来，国内外数十家课题组对其进行了深入研究，利用多种基因工程表达系统获得了重组LZ-8，揭示了LZ-8的晶体结构和主要理化性质，最为重要的是发现了LZ-8具有多种达到临床治疗价值的免疫调节和抗肿瘤活性。虽然LZ-8具有药用价值，但其被开发成为新药仍不被看好，主要原因是分子量小，仅13kDa，极容易被机体代谢，体内稳定性差，难以发挥其生物学作用。此外，LZ-8来源于灵芝，属于异源蛋白，易引起机体免疫系统产生严重的排异反应。考虑到以上问题，在本研究中将LZ-8与人IgG Fc段融合（LZ8-Fc）在毕赤酵母中进行重组表达，建立了中试发酵和纯化工艺，初步研究了LZ8-Fc的体内稳定性和LZ-8的融合表达策略，本论文的实验数据为融合蛋白表达共性问题中的不稳定性因素提供了理论基础，将对其长效剂型的开发具有一定的参考意义。本研究中使用GGSS柔性肽段连接rLZ8和人IgG1中的Fc段，根据毕赤酵母密码子偏好性重新设计基因序列，两端设EcoRI（GAATTC）和KpnI（GGTACC）酶切位点，进行全基因合成。将目的基因片段连接至AOX1型启动子的甲醇诱导分泌型表达载体—pPICZɑ A，重组后的质粒命名为pPICZɑ A-LZ8-Fc。重组质粒电转化入毕赤酵母菌株X33，在摇瓶规模进行转化克隆的表达筛选，并初步优化了甲醇诱导表达条件。在40升中试发酵规模下，通过摸索发酵过程工艺参数，包括pH值、DO值、罐压、温度、通气量，优化LZ8-Fc重组蛋白的甲醇诱导发酵工艺；发酵液上清SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定结果均显示，从甲醇诱导表达阶段，开始有目的蛋白条带，至发酵后期出现了降解的LZ-8蛋白条带。LZ8-Fc融合蛋白发酵上清经过两步切向流过滤处理，将样品经MabSelect Sure亲和层析和Superdex75凝胶过滤层析进行纯化，确定其稳定的纯化工艺，获得了纯度较高的LZ8-Fc融合蛋白，电泳显示为单一条带，质谱分析结果与预期一致。但是Western Blot结果表明LZ8-Fc融合蛋白在纯化过程中发生了降解。经检测，LZ8-Fc融合蛋白浓度为248g/mL，高效液相色谱的分子筛鉴定，LZ8-Fc融合蛋白的纯度为98.33%。采用绵羊血红细胞凝集实验鉴定发现与相同摩尔质量的LZ-8蛋白比较，LZ8-Fc凝血活性降低。小鼠脾细胞的γ干扰素活性实验显示，LZ8-Fc未表现出LZ-8刺激脾细胞产生γ-干扰素的免疫调节活性。半衰期检测采用大鼠尾静脉给药的方法，按照5min，30min，1h，2h，4h，8h，24h，48h八个时间点取血，结果表明血清中LZ8在8h内明显下降，24h后超出检测范围，LZ8-Fc融合蛋白在4h后超出检测范围。根据SCOP网站的数据库中的信息表明，LZ-8和IgG Fc段的晶体结构均为球蛋白，因而我们利用分子筛为原理的HPLC分析LZ8-Fc在自然状态下的保留时间，进而推断出LZ8-Fc的分子组装方式，实验结果显示LZ8-Fc仍以二聚体形式进行组装的。本研究中还发现一个重要的实验现象，即将LZ8-Fc浓缩至浓度（2.5mg/mL）时，LZ8-Fc分子出现了断裂。本研究中采用分子动力学计算分析LZ8-Fc分子的稳定性，并结合圆二色光谱结构分析，发现融合表达后分子的二级结构出现了很大变化，这可能是影响LZ-8分子稳定性的主要原因。本研究为增强LZ-8的体内稳定性，降低其作为异源蛋白的免疫原性进行了初步探索。虽然LZ8-Fc分子仍不够稳定，但本论文的实验数据表明在融合蛋白表达后的应用中普遍存在的一个重要的问题，即位于N末端的蛋白可能会影响下游蛋白质的正确折叠。因此，融合表达中应尽量保留下游蛋白原有的N末端，为其他在融合蛋白表达的设计上提供了理论依据。
叶湘漓[6]（2013）在《组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究》文中研究指明心脏是机体最早形成并行使功能的器官,同时也是人体中最为辛苦的器官,其工作状态的好坏与人类的健康息息相关;心脏一旦出现疾患,将直接影响到人类的生活甚至危及生命。血管是构成机体循环系统的重要组成成分,机体通过血管系统将血液、氧气、CO2和营养物质等输送到各个组织和器官,血管对于维持机体的生命和健康是必须的,它几乎参与了所有的疾病过程。世界卫生组织的调查显示,心血管病已经成为人类健康的第一杀手,因此,心脏及血管一直是整个生物医学界共同关注的焦点。近些年来尽管对于心脏及血管的研究已取得了很大进展,但是其分子机制如心肌分化的机制、血管发生与形成的机制等仍远未得到阐明;通过研究心脏及血管发育的相关分子机制、以期为心血管病的治疗提供帮助成为目前基础研究和临床实践亟待解决的重大课题之一。组蛋白的修饰作用是表观遗传学研究的一个重要领域,包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化等,其修饰效应可因修饰方式的不同或者组蛋白修饰位点的不同而呈现差异性;不同组蛋白修饰之间相互关联,并可以动态地组合在一起形成“组蛋白密码”,在基因的时空表达调控、细胞命运决定、细胞生长等过程中发挥着重要的作用。作为一种重要的表观遗传学调控机制,组蛋白甲基化修饰在多种生命过程中发挥了重要的作用;细胞内有多种组蛋白甲基化酶和去甲基化酶共同调节组蛋白的修饰状态,在组蛋白甲基化状态确定后,多种效应分子特异的读取修饰信息,从而参与基因转录调控过程。既往研究表明SMYD1是心脏和肌肉特异表达的组蛋白甲基转移酶,在细胞特化、细胞分化和细胞成熟等过程中发挥着重要作用,尤其是在心肌细胞的分化、心脏的形态发生以及肌原纤维的形成等方面。Nkx2.5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一,也是影响心脏发育的关键性转录因子。本研究首次发现SMYD1与Nkx2.5存在相互作用:利用DMSO处理的P19细胞,RT-PCR发现SMYD1与Nkx2.5的表达水平在P19细胞分化的不同时期均呈现上升趋势,暗示SMYD1可能与P19细胞的分化有关,两者在P19细胞的分化中存在表达的相关性;过表达Nkx2.5同样会上调SMYD1基因的表达,表明Nkx2.5能够调节SMYD1基因的表达;通过对SMYD1的启动子序列进行分析,发现位于-632位的TCACTTGA位点可能是Nkx2.5的结合区域;运用EMSA实验证明Nkx2.5的HD结构域能够与SMYD1基因的启动子相结合,CHIP实验的结果也表明Nkx2.5蛋白能与SMYD1的启动子结合;为了进一步证明SMYD1与Nkx2.5存在相互作用,细胞定位分析显示Nkx2.5与SMYD1蛋白同样定位在细胞核中,Co-IP实验证明SMYD1与Nkx2.5有直接的相互作用,Pull-down实验也得到了相同的结果;利用荧光素酶活性分析实验,证明Nkx2.5与SMYD1的相互作用可以影响Nkx2.5下游基因的表达;推测SMYD1可能通过Nkx2.5参与心肌的分化过程。已有的研究表明SMYD1特异性表达于心脏和肌肉组织,目前还很少有SMYD1在其它组织细胞中表达的报道。本研究首次发现SMYD1可以在血管内皮细胞中表达,沉默SMYD1将影响内皮细胞的迁移和内皮细胞管状结构的形成,体内和体外实验证明了 SMYD1与SRF的相互作用,EMSA实验表明SMYD1可与SRF形成复合物,通过前反馈机制增强SRF的DNA结合活性;SMYD1作为SRF的相互作用蛋白,在内皮细胞的迁移和内皮细胞管状结构的形成中具有重要的作用。综上所述,SMYD1可能在心肌分化以及血管发生的过程中起着重要的作用。其它工作（1）:构建基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一,构建基因敲除打靶载体是基因敲除技术的关键一步。采用常规的分子克隆方法构建基因打靶载体往往存在一些难以克服的缺陷,对于某些难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建;而传统的基因敲除技术即完全基因敲除则无法避免某些具有重要功能基因的敲除后所带来的早期胚胎致死问题,也无法避免另外一些基因被敲除后,其表型特征可能随着表达组织的不同或者发育阶段的不同而出现差异的现象;条件性基因敲除技术通过加入具有位点特异性的重组系统,将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠特定发育时期或者特定类型的组织细胞中,使这种修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态。本研究通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点更加准确的插入到了目标位置,实现了条件性基因敲除打靶载体的快速构建。GPCRs几乎参与调控了所有已知的生理过程,具有极其重要的生理功能;GPCR粘附家族是GPCRs家族中第二大的亚家族,由30多个成员组成,在细胞粘附以及细胞内外信号的转导等方面具有重要的作用;不过,目前绝大多数的GPCR粘附家族成员的功能及其配体都还未知,因此又被称为孤儿受体。GPR126最初是从人脐静脉内皮细胞中分离出来的,已有的研究表明GPR126可能是胚胎发育以及心血管生成过程中的关键因子,并与神经髓鞘的形成以及神经细胞之间的信号传导等有关;为了进一步探索GPR126的作用机制,快速构建了 GPR126条件性基因敲除打靶载体,拟以此为基础构建GPR126基因敲除小鼠模型,为在动物体内研究GPR126的功能奠定了基础。其它工作（2）:神经突起生长导向因子Netrins是一个与层粘连蛋白相关的、高度保守的小分子分泌蛋白家族,在神经发育所需的轴突导向及细胞迁移中发挥着吸引或排斥的双重导向作用,其同源物在果蝇、斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠等多种模式动物中均已得到发现。Netrins分为两个亚家族:典型netrins和netrin-Gs;由于netrin-Gs亚家族各成员之间具有高度的相似性,而目前在人类中得到确证的只有netrin-G1,故推测在人类中应该还有netrin-Gs亚家族的其它成员及其编码基因的存在。从20周龄人胚中提取脑组织的总RNA,用PCRcDNA文库试剂盒制备脑组织cDNA文库,再用特异性引物进行PCR扩增,得到1条人netrin-G的全长cDNA,并将其命名为人netrin-G2;用Northern杂交研究其表达,用进化树分析其与netrins家族各成员间的关系,证实人netrin-G2确实为netrin-G亚家族的1个新成员;人netrin-G2基因位于染色体的9q34,大小为2428 bp,包含1个1593 bp的假定开放阅读框,起始密码子为86位的甲硫氨酸,终止密码子为1678位的TGA,可编码1个大小为530个氨基酸残基的蛋白质;Northern杂交显示,人netrin-G2在脑组织中特异性表达,而在其它组织中却很少发现,推测人netrin-G2可能在中枢神经系统的发育过程中具有重要的作用,可能与刺激性神经冲动的传递以及神经调节有关。
张泽华[7]（2011）在《用Calreticulin-Like蛋白治疗血管瘤的研究》文中认为血管瘤是毛细血管的异常增生,是儿童的常见病和多发病。当前,在治疗血管瘤上没有特效的药物。血管生成抑制因子是特异抑制血管内皮细胞增殖的蛋白质。本论文研究用Careticulin-like蛋白治疗血管瘤。应用套叠PCR合成careticulin-like序列,构建含careticulin-like基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-careticulin-like,通过电转法将表达载体转化毕赤酵母基因组,通过G418抗性筛选高基因拷贝重组子,获得工程菌GS115（pPIC9K-careticulin-like）。在发酵罐中进行高密度发酵GS115（pPIC9K-careticulin-like）表达重组蛋白。用离子交换法纯化重组Careticulin-like蛋白。纯化的目标蛋白具有抑制CAM血管生成的活性。Careticulin-like蛋白诱发血管瘤细胞凋亡,其主要表现是细胞固缩。公鸡的肉垂是天然的血管瘤模型。本研究以60日龄公鸡的肉垂为血管瘤模型,进行用Careticulin-like蛋白治疗血管瘤试验。在试验组右侧肉垂每天注射Careticulin-like蛋白20μ g,对照组左侧肉垂每天注射等体积的PBS。在用药14天后,治疗组的肉垂长度为平均1.90cm,对照组的肉垂长度为平均2.52cm,呈显着性差异（P<0.001）；试验组用药侧肉垂平均血管数量为个/100个视野,对照组的血管数量是为个/100个视野,两组之间的血管数量呈显着性差异（P<0.001）；对照组的用药部位组织细胞正常,而由于缺少血管供给营养的试验组,其用药局部出现明显组织凋亡。实验组鸡的体重平均增长275g/只,对照组鸡的体重平均增长325g/只,两组之间体重的变化没有显着性差异（0.1<P<0.25）。以上结果表明Careticulin-like蛋白能有效地抑制血管瘤细胞的增殖,有效地抑制血管瘤模型的血管的增殖和抑制血管瘤的发展。具有开发为治疗血管瘤药物的前景。
郝文丽[8]（2010）在《人LIGHT基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达研究》文中指出肿瘤坏死因子超家族成员可诱导多种生物学效应,包括细胞的生长、分化以及死亡。其家族成员在炎症反应的调节、对感染的免疫反应以及组织的自稳态中都起到了重要的作用。LIGHT是TNF家族具有特殊作用的成员之一,它不仅可以调节肿瘤细胞凋亡,还可以共刺激T细胞活化并调节T细胞免疫应答,有望用于肿瘤的免疫治疗和一些自身免疫性疾病的研究。由于LIGHT在体内含量低,提取和纯化困难。为了满足研究和临床治疗的需要,以基因工程方法制备重组的人LIGHT将是有效的手段。本论文就LIGHT在原核和真核系统的表达情况进行了系统的研究。首先,构建了人LIGHT胞外段融合蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中成功地表达了人LIGHT融合蛋白,并对表达条件进行了初步的优化。其次,在优化的条件下大量制备人LIGHT融合蛋白,通过亲和层析进行蛋白的分离纯化。将纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫小鼠,获得了具有较高效价（1：128000）和良好特异性的鼠抗人LIGHT融合蛋白多克隆抗体。最后,构建了含有人LIGHT胞外段基因和Fc基因的酵母表达载体,转化毕赤酵母受体菌GS115,经PCR和Western blot鉴定后获得能稳定分泌表达LIGHT-Fc融合蛋白酵母工程菌。本研究探索了人LIGHT在原核和真核系统中的表达情况,并制备了鼠抗人LIGHT多克隆抗体,其中,重组人LIGHT在毕赤酵母中的分泌表达属国内外首次报道。这为进一步研究人LIGHT的功能及探索肿瘤的免疫治疗新方法奠定了一定的实验基础。
李新新[9]（2009）在《抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域的原核表达及纯化研究》文中认为抑制性谷氨酸门控氯离子通道（Inhibitory glutamate-gated chloride ion channels, IGluCls）属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族（Cys-loop LGIC superfamily）中的阴离子通道,主要分布于无脊椎动物的中枢神经和神经肌肉的连接处,在控制吞咽、运动、感知等方面起关键作用。抑制性谷氨酸门控氯离子通道它是杀虫剂的作用靶标,仅存在于无脊椎动物中,鉴于该靶标的选择性及高效、安全等特点,建立该通道的体外筛选方法,在天然产物库中筛选具有选择毒性的杀虫剂具有广阔的应用前景。本文以黑腹果蝇抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域（Drosophila melanogaster inhibitory glutamate-gated chloride ion channels,DmIGluCl ECD）为研究对象,进行了DmIGluCl ECD的亚克隆及在大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统的表达研究,并对在大肠杆菌中表达的胞外域蛋白进行了纯化。主要结果如下:（1）DmIGluCl通道由胞外区（Extracellular domain,ECD）、4个跨膜区（transmembrane domain,TM）和胞内区（intracellular domain,ICD）三部分组成。考虑到毕赤酵母表达系统属于真核表达系统,具备翻译后加工等一系列修饰过程,首选其进行表达。首先从本实验室已经构建了的DmIGluClα全长重组质粒中克隆DmIGluClαTM2-TM3环之前的313个氨基酸残基基因片段,与穿梭质粒pPIC9K连接,成功构建了重组载体并成功转化毕赤酵母宿主GS115,利用毕赤酵母表达系统进行表达研究。（2）扩增了DmIGluClαECD基因片段,同时与真核表达载体pPIC9K和原核表达载体pET-28a-c（+）连接,限制性内切酶酶切鉴定及序列测定表明,得到了目标基因的真核及原核表达的阳性重组子,成功构建了重组质粒,并成功转化毕赤酵母GS115和大肠杆菌Rosetta。利用毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统进行表达研究。（3）进行基因工程菌培养,在大肠杆菌宿主Rosetta中,诱导外源蛋白DmIGluCl ECD的表达,SDS-PAGE分析发现外源蛋白以不可溶的包涵体形式存在于破菌沉淀中。对目标蛋白的诱导条件进行了优化实验。优化结果表明,当诱导剂IPTG添加浓度为0.1mM时, 25℃诱导5 h将获得占菌体总蛋白比例最高的的目标蛋白。经凝胶电泳光密度扫描分析可知,目标蛋白表达量占全菌蛋白的31.02%。（4）利用3M尿素对包涵体蛋白进行洗涤纯化后,在变性条件下利用Ni2+柱亲和层析方法对DmIGluCl ECD蛋白进行了纯化,获得了纯度为100%的目标蛋白。
刘春平[10]（2007）在《人血管内皮生长因子受体-2基因（KDR）在链霉菌和大肠杆菌的克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究》文中提出血管生成是毛细血管从已构建的毛细血管网中以出芽方式新生的过程,参与许多病理和生理过程如伤口愈合、组织再生、子宫内膜周期性增生以及肿瘤的转移和血管生成。尤其在实体瘤的恶性生长和转移中,肿瘤的血管生成起到重要的作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原,直接参与了血管形成这个过程,促进内皮细胞分裂增殖,促使新生血管形成,同时还可有效地提高血管的通透性。VEGF这一功能是通过和其特异性受体结合来发挥作用的。VEGF受体家族主要包括三个成员:VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）、VEGFR-3（Fit-4）,它们都属于受体酪氨酸激酶（RTK）Ⅲ型超家族。研究表明VEGFR-2（KDR/Flk-1）在调节内皮细胞增殖、分化反应中最为重要,是内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者,VEGF与KDR结合使受体二聚体化,进一步激发KDR酪氨酸发生磷酸化,导致自身酶活性和下游信号相关酶类的激活,从而调节血管内皮细胞相关反应。新生血管的形成对恶性肿瘤的生长是必不可少的因素,因而以KDR为靶点进行药物设计和筛选可成为抗肿瘤血管生成的重要方略。KDR基因全长5821bp,编码基因位于4q12,编码区为4068bp,编码1356个氨基酸。由胞外7个Ig样结构域,一个跨膜域和胞内域组成。胞外域由766个氨基酸组成,第2-3Ig样结构域是主要VEGF结合区。KDR胞内区有565个氨基酸组成,可分为激酶功能区、68个氨基酸的酪氨酸激酶插入区和羧基末端。本研究从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中提取总RNA,以其为模板,通过RT-PCR扩增获得编码KDR编码胞外区1-3Ig样结构域（KDR-ED）和胞内酪氨酸激酶催化区域（KDR-CD）的基因片段。测序结果同已知KDR基因编码序列进行比较,结果一致。以链霉菌为表达体系进行基因表达。利用本实验室自行构建的新型链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pSGLgpp作为KDR-ED和KDR-CD的基因表达载体。将KDR-ED和KDR-CD编码基因分别克隆至载体的gpp信号肽编码序列下游。重组质粒转化至S.lividans TK24原生质体,经再生得到转化子,重组菌分别命名为S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]和S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]。SDS-PAGE结果表明,S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]分泌表达44kD的特异蛋白条带。采用磷酸化的酪氨酸抗体在没有加入ATP的情况下对KDR-CD蛋白进行western blot检测,结果出现44kD的单一杂交带,表达的KDR-CD具有免疫学活性。S.lividans[pSGLgpp/KDR-ED]可能分泌表达37KD的重组KDR-ED。此外在大肠杆菌中也分别进行了KDR-ED和KDR-CD编码基因的克隆表达。将KDR-CD基因克隆至载体pET-30a,获得重组质粒pET-30a/KDR-CD并转化至大肠杆菌BL21（DE3）。SDS-PAGE分析显示在41kD处有特异性蛋白条带出现,大部分以包涵体的形式存在。采用磷酸化的酪氨酸抗体进行Western blot检测,全菌及超声破碎的上清和包涵体均在41kD处有单一杂交带,说明表达的KDR-CD重组蛋白具有免疫活性。将KDR-ED基因分别采用载体pET-30a和载体pBV220,在大肠杆菌中均未获表达。分别对链霉菌和大肠杆菌表达的重组KDR-CD蛋白进行纯化。S.lividans[pSGLgpp/KDR-CD]的培养上清液经70%饱和硫酸铵沉淀、SP SepharoseFF阳离子交换树脂层析和Q Sepharose FF阴离子交换树脂层析,获得KDR-CD纯品。E.coli[pET-30a/KDR-CD]产生的重组蛋白,经尿素溶解再进行复性处理后,进行Ni2+—螯合亲和层析得到具有免疫活性的纯化重组蛋白。两种宿主表达的重组的KDR-CD纯化后进行SDS-PAGE分析,HPLC检测纯度均达到95%,且具有免疫活性。采用ELISA方法研究纯化的KDR-CD蛋白的酪氨酸激酶活性,以poly（E4Y）为反应底物,对反应条件包括KDR-CD浓度、底物浓度、ATP及Mg2+和Mn2+的浓度进行了优化,结果表明两种体系表达的KDR-CD蛋白均具有酪氨酸激酶活性。以纯化的KDR-CD蛋白为靶位,建立了KDR酪氨酸激酶的抑制剂筛选模型,已筛选了600余株微生物产物,经复筛获得了13株产生抑制物质的菌株,阳性率为2.17%。本研究首次在链霉菌中成功分泌表达了KDR-CD的酪氨酸激酶催化域,并首次以原核系统表达的重组KDR蛋白构建了筛选酪氨酸激酶抑制剂的新型模型,具有较突出新颖性和可操作性,为从微生物来源获得抗肿瘤血管形成的新药奠定了基础。
二、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt-1 Extracellular Domain 1-3 Loop cDNA in Pichia pastoris, Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Activity（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt-1 Extracellular Domain 1-3 Loop cDNA in Pichia pastoris, Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Activity（论文提纲范文）
（1）靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 PD-1/PD-L1与肿瘤免疫逃逸 |
| 1.1.2 国内外PD-1/PD-L1研发现状 |
| 1.1.3 单域抗体 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 研究路线 |
| 第二章 抗PD-1配体结合界面区单域抗体的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 载体噬菌体 |
| 2.1.2 辅助噬菌体 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试验仪器主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与试液的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 抗原配体的获取 |
| 2.3.2 单域抗体的筛选 |
| 2.3.3 单域抗体噬菌体库的扩增 |
| 2.3.4 辅助噬菌体KM13的准备(扩增、纯化) |
| 2.3.5 单域抗体噬菌体库/重组噬菌体的扩增、纯化、淘洗 |
| 2.3.6 单克隆噬菌体ELISA检测阳性克隆 |
| 2.4 试验结果与分析 |
| 2.4.1 抗原配体的获取 |
| 2.4.2 单域抗体的筛选结果分析 |
| 2.4.3 ELISA检测阳性克隆 |
| 2.4.4 阳性克隆的测序结果 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 Nb:PD-1真核表达系统的构建与表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基与缓冲液配制 |
| 3.2.5 其他仪器与用具 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 靶向PD-1配体结合界面的单域抗体氨基酸序列优化 |
| 3.3.2 Nb:PD-1目的基因设计与合成 |
| 3.3.3 Nb:PD-1-pGAPZα-A的构建 |
| 3.3.4 毕赤酵母X-33-Nb:PD-1重组工程菌的构建 |
| 3.3.5 Nb:PD-1蛋白的纯化及糖基化验证 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 氨基酸序列优化结果 |
| 3.4.2 目的基因设计与合成结果 |
| 3.4.3 Nb:PD-1的毕赤酵母X-33工程菌的筛选与产物表达 |
| 3.4.4 Nb:PD-1的纯化与糖基化验证 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 Nb:PD-1原核表达系统的构建与表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要材料和试剂 |
| 4.2.3 试验仪器 |
| 4.2.4 培养基与缓冲液 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 Nb:PD-1目的基因的设计与合成 |
| 4.3.2 载体质粒pET21b-Nb:PD-1的构建 |
| 4.3.3 E.coliBL21(DE3)-Nb:PD-1工程菌的构建 |
| 4.3.4 E.coliBL21(DE3)-pET21b-Nb:PD-1的可溶性表达 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Nb:PD-1基因大肠杆菌偏爱密码子优化与扩增 |
| 4.4.2 目的基因与表达载体双酶切及其胶回收 |
| 4.4.3 重组质粒pET21b-hTGF-β1的构建与转化 |
| 4.4.4 高表达菌株的筛选 |
| 4.4.5 可溶性表达 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 亲和力常数测定与活性检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 亲和力常数测定 |
| 5.3.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析 |
| 5.4 试验结果 |
| 5.4.1 亲和力常数测定结果 |
| 5.4.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析结果 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）重组跨膜肽—人表皮生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 EGF研究进展 |
| 1.1.1 EGF概述 |
| 1.1.2 EGF的结构与功能关系 |
| 1.1.3 EGF与其受体作用机制 |
| 1.1.4 EGF的生物学效应及应用 |
| 1.1.5 重组表皮生长因子的分泌表达 |
| 1.2 CPPs |
| 1.2.1 CPPs的种类与结构特点 |
| 1.2.2 CPPs的机制 |
| 1.2.3 CPPs的应用 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pPICZαA-TAT-hEGF真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 pPICZαA-TAT-hEGF毕赤酵母X-33 表达工程菌的构建与筛选 |
| 2.2.3 融合蛋白 TAT-h EGF 在毕赤酵母 X-33 中的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.4 融合蛋白TAT-hEGF的纯化 |
| 2.2.5 生物活性检测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 目的基因片段的获取 |
| 3.1.1 pUCK-TAT-hEGF的提取 |
| 3.1.2 TAT-hEGF基因片段的获取 |
| 3.1.3 TAT-hEGF基因片段的切胶回收 |
| 3.2 目的基因与载体的连接与鉴定 |
| 3.2.1 连接产物质粒的提取 |
| 3.2.2 连接产物质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.3 连接产物质粒的测序图谱 |
| 3.3 重组酵母转化子的PCR鉴定 |
| 3.4 融合蛋白TAT-hEGF的表达 |
| 3.4.1 高表达菌株筛选及诱导最佳时间的确定 |
| 3.4.2 毕赤酵母X-33 表达TAT-h EGF最佳pH的确定 |
| 3.5 融合蛋白TAT-hEGF的纯化 |
| 3.5.1 盐析 |
| 3.5.2 凝胶过滤层析结果 |
| 3.5.3 离子交换层析结果 |
| 3.6 融合蛋白TAT-hEGF的生物活性检测 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤血管的生成与抑制 |
| 1.1.1 肿瘤血管生长因子 |
| 1.1.1.1 血管内皮细胞生长因子 |
| 1.1.1.2 基质金属蛋白酶 |
| 1.1.1.3 成纤维细胞生长因子 |
| 1.1.2 肿瘤血管生长抑制因子 |
| 1.1.2.1 肿瘤血管抑制因子的种类 |
| 1.1.2.2 管抑制因子的作用机理 |
| 1.1.2.3 管抑制因子Kringle 5 |
| 1.1.3 血管生长因子和血管生长抑制因子的关系 |
| 1.2 蛋白受体和配体的筛选及鉴定 |
| 1.2.1 酵母双杂交筛选体系 |
| 1.2.2 噬菌体展示技术筛选体系 |
| 1.2.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 本研究的创新点 |
| 1.5 本研究拟采用的技术路线 |
| 第二章 KRINGLE 5的原核表达及分离纯化 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1 Kringle 5原核表达载体的构建 |
| 2.1.4.2 Kringle 5重组蛋白的表达及分离纯化 |
| 2.1.4.3 表达产物的Tris-tricne-SDS-PAGE分析 |
| 2.1.4.4 蛋白浓度测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Kringle 5重组载体的构建 |
| 2.2.1.1 Kringle 5基因的PCR扩增 |
| 2.2.1.2 Kringle 5 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.1.3 Kringle 5 PCR产物和pET28b质粒载体的连接及双酶切鉴定 |
| 2.2.1.4 Kringle 5重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.2 重组菌种的诱导表达 |
| 2.2.2.1 重组菌E.Coli BL21(DE3)/ET28b-Kringle 5的表达 |
| 2.2.2.2 重组Kringle 5蛋白的初步分离纯化 |
| 2.2.2.3 重组Kringle 5蛋白的凝胶排阻色谱纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 噬菌体展示肽库筛选KRINGLE 5结合蛋白 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 ER2738菌体的复苏 |
| 3.1.5 噬菌体滴度测定 |
| 3.1.6 Kringle 5的包被及亲和短肽的筛选 |
| 3.1.6.1 第一轮筛选 |
| 3.1.6.2 第二轮筛选 |
| 3.1.6.3 第三轮筛选 |
| 3.1.6.4 第四轮筛选 |
| 3.1.7 淘选噬菌斑的扩增及噬菌体的提取 |
| 3.1.8 阳性噬菌体基因序列的测定 |
| 3.1.9 ELISA检测Kringle 5蛋白对筛选噬菌体的结合能力 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 噬菌体随机肽库的淘选和富集 |
| 3.2.2 筛选克隆的测序分析 |
| 3.2.3 ELISA分析筛选噬菌体单克隆与Kringle 5的亲和性 |
| 3.2.4 蛋白序列比对 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 分子对接研究KRINGLE 5蛋白与筛选蛋白的作用 |
| 引言 |
| 4.1 分子对接虚拟筛选药物的基本原理 |
| 4.2 蛋白晶体结构的构建 |
| 4.2.1 构建晶体模型结构的蛋白氨基酸序列 |
| 4.2.2 蛋白3D模型的构建 |
| 4.2.3 蛋白三维结构的评价 |
| 4.2.4 Kringle 5蛋白与蛋白的对接研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Kringle 5蛋白的晶体模型构建及评价 |
| 4.3.2 VDAC-1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.2.1 VDAC-1晶体结构模型的构建 |
| 4.3.2.2 VDAC-1与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性中心分析 |
| 4.3.3 Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.3.1 Laminin subunit alpha-3蛋白晶体结构模型的构建 |
| 4.3.3.2 Laminin subunit alpha-3蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.4 ATP-binding cassette sub-family A 12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.4.1 ATP-binding cassette sub-family(ABCA12)蛋白晶体结构的构建 |
| 4.3.4.2 ABCA12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.5 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.5.1 Cochlin precursor蛋白晶体模型的构建 |
| 4.3.5.2 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.6 Transmembrane channel-like protein 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.6.1 Transmembrane channel-like protein 2蛋白三维结构的构建 |
| 4.3.6.2 Transmembrane channel-like protein 2与Kringle 5的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.7 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.7.1 Endothelin B receptor isoform X2蛋白三维结构的构建 |
| 4.3.7.2 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接及活性位点分析 |
| 4.3.8 Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.8.1 Protein C-ets-2蛋白三维模型的构建 |
| 4.3.8.2 HEX软件研究Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.9 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.9.1 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白三维模型的构建 |
| 4.3.9.2 HEX软件研究Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.10 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.10.1 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白晶体模型的构建 |
| 4.3.10.2 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle |
| 4.3.11 筛选蛋白与Kringle 5蛋白分子对接的自由能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 VDAC-1蛋白的克隆、表达及纯化工艺研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂与菌种 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 试剂配制 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.1.4.1 VDAC-1原核表达载体的构建 |
| 5.1.4.2 VDAC-1重组蛋白的诱导表达及分离纯化 |
| 5.1.4.3 SDS-PAGE |
| 5.1.4.4 蛋白浓度测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 VDAC-1元和表达载体的构建 |
| 5.2.1.1 VDAC-1 cDNA的PCR扩增 |
| 5.2.1.2 VDAC-1 PCR产物的胶回收 |
| 5.2.1.3 VDAC-1 PCR产物和pET28b质粒载体的双酶切 |
| 5.2.1.4 pET28b-VDAC-1重组质粒的测序鉴定 |
| 5.2.2 重组E.Co1i BL21(DE3)/pET28b-VDAC-1菌种的诱导表达 |
| 5.2.3 重组VDAC-1蛋白的分离纯化 |
| 5.2.3.1 重组VDAC-1蛋白的复性后分离 |
| 5.2.3.2 重组VDAC-1蛋白的柱上复性 |
| 5.2.3.3 两种分离纯化条件对VDAC-1蛋白纯化效率的影响 |
| 5.2.4 不同复性条件对VDAC-1蛋白产率的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 SPR和前沿色谱法验证KRINGLE 5与VDAC-1相互作用 |
| 引言 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器及耗材 |
| 6.1.2.1 实验仪器 |
| 6.1.2.2 实验耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 SPR研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 |
| 6.2.1.1 Kringle 5蛋白固定化最佳条件的确定 |
| 6.2.1.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片上的偶联 |
| 6.2.1.3 Kringle 5与VDAC-1蛋白的结合实验 |
| 6.2.1.4 VDAC-1与Kringle 5蛋白亲和热力学分析 |
| 6.2.1.5 芯片的再生 |
| 6.2.2 前沿色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1互作 |
| 6.2.2.1 固定化Kringle 5蛋白的硅胶填料的制备 |
| 6.2.2.2 定向固定化Kringle 5蛋白与VDAC-1受体蛋白的相互作用 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 SPR研究Kringle 5蛋白与筛选蛋白的相互作用 |
| 6.3.2 SPR研究VDAC-1与Kringle 5的互作 |
| 6.3.2.1 Kringle 5蛋白在CM芯片表面偶联条件的优化 |
| 6.3.2.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片表面的偶联 |
| 6.3.2.3 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的结合分析 |
| 6.3.2.4 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的热力学分析 |
| 6.3.2.5 CM5芯片的再生及再生次数的研究 |
| 6.3.3 前沿色谱研究VDAC-1与Kringle 5的相互作用 |
| 6.3.3.1 前言色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 新城疫病毒磷蛋白相关研究概况 |
| 2 单链抗体的应用前景 |
| 3 胞内抗体及其应用研究进展 |
| 4 胞质转导肽当前研究现状 |
| 5 问题与展望 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 7 本研究的总体实验思路及技术路线 |
| 第二章 鸡源性抗新城疫病毒单链抗体库的构建 |
| 第一节NDV scFv基因表达文库的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 三黄鸡的免疫及阴性、阳性血清的制备 |
| 2.2 总RNA的提取 |
| 2.3 鸡源性单链抗体库基因的构建 |
| 2.4 单链抗体原核表达质粒的构建 |
| 2.5 单链抗体表达抗体库的构建 |
| 2.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv的诱导表达 |
| 2.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物可溶性分析 |
| 2.8 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 VH、VL基因的扩增 |
| 3.2 单链抗体基因的扩增 |
| 3.3 重组质粒pOPE101-XP-scFv的鉴定 |
| 3.4 鸡源性单链抗体库库容量与库多样性的评价 |
| 3.5 单链抗体阳性克隆的检测 |
| 3.6 重组质粒pOPE101-XP-scFv诱导表达条件的优化 |
| 3.7 重组质粒pOPE101-XP-scFv原核表达产物的纯化 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗新城疫病毒单链抗体的筛选及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株及鸡胚 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 NDV F48E9病毒的纯化 |
| 2.2 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.3 ELISA筛选条件的优化 |
| 2.4 单链抗体特异性实验 |
| 2.5 单链抗体阳性克隆序列分析比较 |
| 2.6 单链抗体的性质测定 |
| 2.7 单链抗体阳性克隆体外中和活性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 新城疫病毒抗原的纯化鉴定 |
| 3.2 筛选方法的建立与优化 |
| 3.3 抗新城疫病毒单链抗体的筛选 |
| 3.4 单链抗体阳性克隆序列分析 |
| 3.5 单链抗体的生物学特性分析 |
| 3.6 单链抗体阳性克隆对NDV感染细胞的保护效果 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体筛选 |
| 第一节 新城疫病毒磷蛋白的原核表达及纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 磷蛋白表达基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2 磷蛋白表达基因的克隆 |
| 2.3 pET-28a-P融合蛋白基因的构建 |
| 2.4 NDV磷蛋白的抗原表位预测 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-P诱导表达的鉴定 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-P诱导原核表达条件的优化 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-P原核表达产物的纯化及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV F48E9磷蛋白表达基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 NDV F48E9磷蛋白表达基因的克隆与酶切鉴定 |
| 3.3 NDV F48E9磷蛋白表达基因测序结果及核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 3.4 重组表达质粒pET-28a-P原核表达的鉴定 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达条件的优化 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-P原核表达产物诱导表达的纯化 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.2 单链抗体阳性克隆序列分析比较 |
| 2.3 单链抗体的亲和力测定分析 |
| 2.4 Western blot分析新城疫病毒磷蛋白与单链抗体的结合 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的获得 |
| 3.2 抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体阳性克隆的序列分析 |
| 3.3 单链抗体阳性克隆亲和力分析结果 |
| 3.4 单链抗体与新城疫病毒磷蛋白的结合能力 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体研制及生物活性分析 |
| 第一节 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体基因的扩增 |
| 2.2 胞内抗体重组质粒的转染 |
| 2.3 RT-PCR检测抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体mRNA的表达 |
| 2.4 重组质粒转染细胞的表达检测 |
| 2.5 流式细胞仪检测两种融合蛋白诱导BHK21细胞凋亡分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在BHK21细胞中的表达分析 |
| 3.3 Western blot检测胞内抗体的表达 |
| 3.4 流式细胞仪对两种融合蛋白的检测分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗磷蛋白胞内抗体生物活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 激光共聚焦观察胞内抗体在细胞定位 |
| 2.2 免疫共沉淀实验分析胞内抗体与磷蛋白的结合活性 |
| 2.3 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒的影响 |
| 2.4 实时定量荧光PCR检测胞内抗体对病毒的抑制效果 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组质粒pCDNA3.1-scFv-17和pCDNA3.1-scFv-103细胞内表达及定位分析 |
| 3.2 Western blot |
| 3.3 HA检测胞内抗体对NDV感染细胞的保护效果 |
| 3.4 抗鸡新城疫病毒磷蛋白胞内抗体对病毒复制及转录的影响 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 第五章 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白穿膜性胞内抗体研制及生物学活性研究 |
| 第一节 穿膜抗体的构建及在E.coli中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要生化试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 穿膜抗体基因的PCR扩增、纯化及回收 |
| 2.2 穿膜抗体基因的克隆 |
| 2.3 穿膜抗体重组质粒pET-28a-scFv-CTP的构建 |
| 2.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的诱导表达及鉴定 |
| 2.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达条件的优化 |
| 2.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的可溶性分析 |
| 2.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的纯化 |
| 2.8 穿膜抗体蛋白包涵体的复性 |
| 2.9 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物的表达分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pET-28a-scFv-CTP基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 pET-28a-scFv-CTP基因的克隆与酶切鉴定 |
| 3.3 pET-28a-scFv-CTP基因测序分析 |
| 3.4 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达的鉴定 |
| 3.5 重组质粒pET-28a-scFv-CTP原核表达产物诱导表达条件的优化 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达的可溶性分析 |
| 3.7 重组质粒pET-28a-scFv-CTP诱导表达蛋白的纯化 |
| 3.8 重组质粒pET-28a-scFv-CTP的表达分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 穿膜抗体融合蛋白穿膜活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 检测穿膜抗体融合蛋白进入细胞的最佳浓度 |
| 2.2 免疫荧光检测穿膜抗体融合蛋白在细胞中的定位 |
| 2.3 MTT法检测穿膜抗体融合蛋白对细胞活性影响 |
| 2.4 TCID50检测穿膜抗体融合蛋白对细胞的保护效果 |
| 2.5 荧光定量PCR实验检测穿膜抗体融合蛋白对新城疫病毒复制及转录的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 穿膜抗体穿透细胞膜最佳浓度的确定 |
| 3.2 检测穿膜抗体融合蛋白在细胞内的定位 |
| 3.3 穿膜抗体融合蛋白对细胞毒性的测定 |
| 3.4 穿膜抗体融合蛋白对细胞保护效果的测定 |
| 3.5 穿膜抗体融合蛋白对病毒复制及转录的影响 |
| 4 小结 |
| 第三节 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的论文及申请的专利 |
（5）LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 综述 |
| 第一节 芝免疫调节蛋白结构与功能的研究进展 |
| 1 灵芝免疫调节蛋白的生物学特征 |
| 1.1 灵芝及其免疫调节蛋白家族 |
| 1.2 LZ-8 的特征 |
| 2 LZ-8 蛋白的结构 |
| 2.1 一级结构—氨基酸序列 |
| 2.2 高级结构 |
| 3 LZ-8 的免疫调节功能 |
| 3.1 凝集红细胞功能 |
| 3.2 促进淋巴细胞的增殖与影响细胞因子的表达 |
| 3.3 抗肿瘤特性 |
| 4 小结 |
| 第二节 融合蛋白的基因工程重组表达技术研究进展 |
| 1 融合蛋白表达技术简述 |
| 2 融合蛋白的种类与应用 |
| 2.1 Ig 融合蛋白 |
| 2.2 人血清白蛋白融合蛋白 |
| 2.3 水蛭素融合蛋白 |
| 2.4 其他融合蛋白 |
| 3 小结 |
| 第二章 LZ8-Fc 融合蛋白的构建表达及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验器材及设备 |
| 2.1.2 实验试剂及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pPICZɑ-LZ8-Fc 表达载体的构建 |
| 2.2.2 pPICZɑA-LZ8-Fc 重组质粒的酵母转化及鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的片段的 PCR 扩增 |
| 2.3.2 目的片段和质粒的酶切连接 |
| 2.3.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 重组质粒的酵母电转化及表达筛选 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 LZ8-Fc 融合蛋白的中试发酵和纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验器材及设备 |
| 3.1.2 实验试剂及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 LZ8-Fc 融合蛋白的中试发酵 |
| 3.2.2 发酵液初处理 |
| 3.2.3 LZ8-Fc 融合蛋白的纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 中试发酵 LZ8-Fc 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.2 发酵上清纯化的鉴定 |
| 3.3.3 质谱分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第四章 LZ8-Fc 融合蛋白的活性实验和稳定性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验器材及设备 |
| 4.1.2 实验试剂及配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BCA 蛋白浓度测定试剂盒定量 |
| 4.2.2 LZ8-Fc 纯度鉴定 |
| 4.2.3 融合蛋白的绵羊血凝集实验 |
| 4.2.4 γ干扰素活性 |
| 4.2.5 半衰期实验 |
| 4.2.6 圆二色谱及分子动力学鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 BCA 蛋白定量 |
| 4.3.2 融合蛋白纯度及组装方式鉴定 |
| 4.3.3 LZ8-Fc 绵羊血凝集活性 |
| 4.3.4 γ干扰素活性 |
| 4.3.5 半衰期实验 |
| 4.3.6 融合蛋白的分子动力学研究 |
| 4.3.7 融合蛋白的分子组装 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 研究背景及文献综述 |
| 1.1 心脏的主要进化类型 |
| 1.1.1 管状心脏 |
| 1.1.2 环形心脏 |
| 1.1.3 两腔室心脏 |
| 1.1.4 三腔室心脏 |
| 1.1.5 四腔室心脏 |
| 1.2 血管形成的机制 |
| 1.2.1 血管形成的主要调节因子及其作用 |
| 1.2.2 血管壁基质在血管形成中的作用 |
| 1.2.3 蛋白水解酶系统在血管形成中的作用 |
| 1.3 人类心脏及血管的研究历史 |
| 1.3.1 人类心脏及血管研究的经验学时期 |
| 1.3.2 人类心脏及血管研究的生理学时期 |
| 1.3.3 人类心脏及血管研究的分子生物学时期 |
| 1.4 模式动物与人类心脏及血管发育的研究 |
| 1.4.1 心脏发育的先驱模型——果蝇 |
| 1.4.2 两腔室心脏的代表模型——斑马鱼 |
| 1.4.3 三腔室心脏的代表模型——爪蟾 |
| 1.4.4 经典遗传学研究中的重要模型——鸡 |
| 1.4.5 四腔室心脏的代表模型——小鼠 |
| 1.5 组蛋白与组蛋白修饰调节 |
| 1.5.1 组蛋白的甲基化修饰 |
| 1.5.2 组蛋白的乙酰化修饰 |
| 1.5.3 组蛋白的磷酸化修饰 |
| 1.5.4 组蛋白的泛素化修饰 |
| 1.5.5 组蛋白的SUMO化修饰 |
| 1.5.6 组蛋白的其它修饰方式 |
| 1.6 本研究的研究目的及意义 |
| 1.7 参考文献 |
| 第2章 SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究 |
| 2.1 SMYD蛋白家族概述 |
| 2.1.1 SMYD1--心脏和骨骼肌发育的调节因子 |
| 2.1.2 SMYD2--赖氨酸甲基化转移酶和肿瘤抑制因子的调控子 |
| 2.1.3 SMYD3--转录调控和肿瘤生成 |
| 2.1.4 SMYD4和SMYD5 |
| 2.1.5 关于SMYD1的前期研究基础 |
| 2.2 本研究的研究目的及意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SMYD1在血管内皮细胞中的表达 |
| 2.4.2 沉默SMYD1将影响血管内皮细胞的迁移和细胞管状结构的形成 |
| 2.4.3 SMYD1在体内和体外与SRF相互作用 |
| 2.4.4 SMYD1与SRF形成复合物、增强SRF的DNA结合活性 |
| 2.4.5 SMYD1在P19细胞分化过程中与Nkx2.5具有表达的相关性 |
| 2.4.6 SMYD1启动子上的Nkx2.5结合位点分析 |
| 2.4.7 Nkx2.5的共同作用因子可以调控SMYD1的表达 |
| 2.4.8 SMYD1与Nkx2.5相互作用 |
| 2.4.9 SMYD1与Nkx2.5协同调节Nkx2.5下游基因的表达 |
| 2.4.10 SMYD1蛋白不能与Nkx2.5和DNA形成三元复合体 |
| 2.4.11 转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第3章 其它工作(1):基因敲除打靶载体的快速构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 基因敲除技术概述 |
| 3.1.2 条件性基因敲除技术概述 |
| 3.1.3 G蛋白偶联受体概述 |
| 3.2 本研究的研究目的及意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GPR126条件性基因敲除打靶载体同源臂的设计 |
| 3.4.2 GPR126-BAC中Red重组系统的转入 |
| 3.4.3 亚克隆目的片段至pStart-K载体的鉴定 |
| 3.4.4 引入第一个LoxP位点 |
| 3.4.5 载体自连成功后的酶切鉴定 |
| 3.4.6 引入第二个LoxP位点 |
| 3.4.7 引入neo阳性选择标记基因 |
| 3.4.8 LoxP及FRT功能元件的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第4章 其它工作(2):神经轴突导向因子netrin-G2的克隆与研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 本研究的研究目的及意义 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 人netrin-G2的cDNA克隆及生物信息学分析 |
| 4.4.2 人netrin-G2与netrin家族其它成员的同源性分析 |
| 4.4.3 人netrin-G2的Northern杂交分析 |
| 4.4.4 人netrin-G2蛋白的末端信号肽分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 参考文献 |
| 第5章 结语 |
| 附录一 攻读博士学位期间发表的论文及主要科研课题 |
| 附录二 专业名词缩写词简表 |
| 致谢 |
（7）用Calreticulin-Like蛋白治疗血管瘤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 血管瘤的研究进展 |
| 1.1.1 血管瘤的分类 |
| 1.1.2 血管瘤发病机制及危害 |
| 1.1.3 目前主要的血管瘤治疗方法及优缺点 |
| 1.1.4 以鸡冠为模型的血管瘤动物研究 |
| 1.2 血管生成抑制素的研究 |
| 1.2.1 管生成抑制因子 |
| 1.2.2 钙网蛋白 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 |
| 1.3.2 发酵产物的影响因素 |
| 1.3.3 表达系统的缺陷及解决办法 |
| 1.4 本研究的意义、内容以及技术路线 |
| 1.4.1 本研究的意义 |
| 1.4.2 本研究的内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 CL基因的合成与表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 质粒及菌株 |
| 2.1.1.2 分子生物学常用酶和试剂(盒) |
| 2.1.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.1.4 主要试剂、培养基和缓冲液 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 CL基因的合成 |
| 2.1.2.2 质粒的提取 |
| 2.1.2.3 CL基因和载体的双酶切 |
| 2.1.2.4 酶切产物的回收 |
| 2.1.2.5 目的基因与载体的连接与转化 |
| 2.1.2.6 重组子的鉴定 |
| 2.1.2.7 酵母重组表达载体的构建 |
| 2.1.2.8 酵母重组表达载体的鉴定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 CL基因的合成 |
| 2.2.2 PPIC9K-CL重组表达载体的构建 |
| 2.2.3 PPIC9K-CL重组表达载体双酶切鉴定 |
| 2.2.4 PPIC9K-CL重组表达载体的测序分析 |
| 2.2.5 酵母重组表达载体的构建 |
| 2.2.6 酵母重组表达载体高拷贝转化子的筛选 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 CL蛋白的表达、纯化及活性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株 |
| 3.1.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.1.3 主要试剂、培养基 |
| 3.1.1.4 蛋白电泳主要试剂 |
| 3.1.1.5 蛋白纯化主要试剂 |
| 3.1.1.6 蛋白活性分析主要试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 重组酵母工程菌的摇瓶表达 |
| 3.1.2.2 表达产物的初步纯化及SDS-PAGE电泳 |
| 3.1.2.3 初步纯化产物的SDS-PAGE电泳 |
| 3.1.2.4 重组酵母工程菌的高密度发酵表达 |
| 3.1.2.5 重组目的蛋白的纯化 |
| 3.1.2.6 纯化后的目的蛋白的透析处理 |
| 3.1.2.7 重组蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制活性的测定 |
| 3.1.2.8 重组蛋白对细胞用药实验 |
| 3.1.2.9 细胞凋亡检测 |
| 3.1.2.10 重组蛋白对鸡冠血管生成抑制活性的测定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 重组酵母工程菌的摇瓶表达 |
| 3.2.2 表达蛋白纯化及透析处理 |
| 3.2.3 重组蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制活性的测定 |
| 3.2.4 重组酵母工程菌的高密度发酵 |
| 3.2.5 重组蛋白对细胞用药实验 |
| 3.2.6 重组蛋白对鸡冠血管生成抑制活性的测定 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 讨论及结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 Calreticulin-Like蛋白的开发前景 |
| 4.1.2 表达体系的选择 |
| 4.1.3 本研究中值得改进的部分和研究的下一步研究方向 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）人LIGHT基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验一 人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二 人LIGHT多克隆抗体的制备及检测 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 人LIGHT基因在毕赤酵母中的表达及鉴定 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 论着 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域的原核表达及纯化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 抑制性谷氨酸门控氯离子通道（IGluCls）的研究进展 |
| 1.1.1 IGluCls 的生理功能 |
| 1.1.2 黑腹果蝇IGluCls 的结构及理化性质研究 |
| 1.1.3 IGluCls 的分子特性 |
| 1.1.4 IGluCls 分子突变与功能变化 |
| 1.1.5 IGluCls 的门控机制 |
| 1.1.6 IGluCls 的表达研究 |
| 1.1.7 IGluCls 的药理学特性及应用价值 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 课题来源和研究内容 |
| 1.3.1 课题来源 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 实验材料和仪器 |
| 2.1 菌种和载体 |
| 2.1.1 大肠杆菌表达系统 |
| 2.1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 2.2 引物合成 |
| 2.3 主要化学试剂 |
| 2.4 培养基及溶液 |
| 2.5 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 DmIGluClαECD 在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1.1 DmIGluClαECD 基因的扩增 |
| 3.1.2 重组克隆载体的构建 |
| 3.1.3 重组克隆载体的筛选与鉴定 |
| 3.1.4 原核重组表达质粒的构建 |
| 3.1.5 重组表达载体转化Rosetta 及阳性克隆的筛选 |
| 3.1.6 DmIGluClαECD 亚基DNA 在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1.7 表达条件的优化 |
| 3.2 DmIGluClαECD 包涵体的纯化 |
| 3.2.1 包涵体的分离和洗涤 |
| 3.2.2 包涵体的溶解 |
| 3.2.3 包涵体的金属螯合层析 |
| 3.3 DmIGluClα（1-313）在毕赤酵母中的表达 |
| 3.3.1 真核表达载体的构建 |
| 3.3.2 线性化重组质粒的制备 |
| 3.3.3 DmIGluClα（1-313）DNA 转化毕赤酵母 |
| 3.3.4 DmIGluClα（1-313）在毕赤酵母中的表达 |
| 3.4 DmIGluClαECD 在毕赤酵母中的表达 |
| 3.4.1 真核表达载体的构建 |
| 3.4.2 线性化重组质粒的制备 |
| 3.4.3 DmIGluClαECD 亚基DNA 转化毕赤酵母 |
| 3.4.4 DmIGluClαECD 在毕赤酵母中的表达 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 DmIGluClαECD 的原核表达 |
| 4.1.1 大肠杆菌重组克隆载体的构建 |
| 4.1.2 大肠杆菌重组表达载体的构建 |
| 4.1.3 重组表达载体转化表达宿主Rosetta 及鉴定 |
| 4.1.4 DmIGluClαECD 亚基DNA 在大肠杆菌中的表达及条件优化 |
| 4.2 DmIGluClαECD 包涵体的纯化 |
| 4.2.1 包涵体的分离和洗涤 |
| 4.2.2 包涵体的变性及纯化 |
| 4.3 毕赤酵母重组表达载体的构建 |
| 4.3.1 DmIGluClα(1-313) 重组表达载体的构建 |
| 4.3.2 DmIGluClαECD 重组表达载体的构建 |
| 5 讨论 |
| 5.1 胞外域的选择 |
| 5.2 DmIGluClαECD 的原核表达 |
| 5.2.1 原核表达系统的特点 |
| 5.2.2 原核表达宿主、载体的选择及表达条件优化 |
| 5.3 包涵体及其纯化 |
| 5.3.1 包涵体的形成 |
| 5.3.2 包涵体的洗涤与纯化 |
| 5.4 DmIGluClα的真核表达 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
（10）人血管内皮生长因子受体-2基因（KDR）在链霉菌和大肠杆菌的克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究（论文提纲范文）
| 缩略语一览表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 一 KDR胞内酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)编码基因在链霉菌中的克隆和表达 |
| 二 KDR胞内酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)基因在大肠杆菌中的克隆和表达 |
| 三 重组KDR-CD蛋白的纯化研究 |
| 四 KDR-CD蛋白酪氨酸激酶活性测定及其抑制剂筛选模型的建立 |
| 五 KDR胞外区卫1-3Ig样结构域(KDR-ED)基因在链霉菌中的克隆和表达 |
| 六 KDR胞外1-3Ig样结构域(KDR-ED)基因在大肠杆菌中的克隆和表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:血管内皮生长因子受体-2生物学及信号传导的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt-1 Extracellular Domain 1-3 Loop cDNA in Pichia pastoris, Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Activity（论文参考文献）
- [1]靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制[D]. 刘国强. 广东药科大学, 2018(01)
- [2]重组跨膜肽—人表皮生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达[D]. 孔晶瑶. 吉林大学, 2017(04)
- [3]血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究[D]. 梁引库. 西北大学, 2016(04)
- [4]鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究[D]. 李本强. 上海交通大学, 2015(02)
- [5]LZ8-Fc融合蛋白重组表达及其稳定性研究[D]. 侯玥. 吉林大学, 2014(10)
- [6]组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究[D]. 叶湘漓. 湖南师范大学, 2013(03)
- [7]用Calreticulin-Like蛋白治疗血管瘤的研究[D]. 张泽华. 海南大学, 2011(04)
- [8]人LIGHT基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达研究[D]. 郝文丽. 华东师范大学, 2010(03)
- [9]抑制性谷氨酸门控氯离子通道胞外域的原核表达及纯化研究[D]. 李新新. 东北农业大学, 2009(02)
- [10]人血管内皮生长因子受体-2基因（KDR）在链霉菌和大肠杆菌的克隆表达及其抑制剂筛选模型的构建研究[D]. 刘春平. 中国协和医科大学, 2007(07)
标签：抗体论文; 血管内皮生长因子论文; pd-1论文; 融合蛋白论文; 重组蛋白论文;