一、干扰素对肿瘤细胞Fas表达的上调作用及与细胞凋亡的关系（论文文献综述）
岳原亦[1]（2020）在《IL-6ST在结直肠癌中的表达及对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移影响的研究》文中认为目的:结直肠癌colorectal cancer（CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。CRC发病常隐匿,且易出现早期转移,其预后与疾病分期关系密切。因此,如何早期诊断及提高CRC患者生存率是目前研究的热点。信号传导和转录激活因子（signal transduction and activator of transcription,STAT）蛋白,存在于细胞浆内蛋白,经酪氨酸磷酸化激活后形成二聚体,入核后结合在靶基因启动子区域,调控基因表达。STAT既是细胞信号转导蛋白,也是核转录因子,可调控多种基因转录,包括与肿瘤增殖、迁移有关的基因。Janus激酶（Janus kinase,JAK）-STAT信号通路可参与免疫功能,及细胞增殖和分化过程。持续活化的JAK-STAT信号通路与肿瘤的发生发展有关,可调控肿瘤的恶性转化过程。目前研究发现,JAK-STAT信号通路在血液系统恶性肿瘤及实体瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌及CRC的发生发展中发挥作用。在CRC中,JAK-STAT信号通路的调控机制仍需进一步探讨。JAK-STAT信号通路可调控50多种细胞因子转录。研究发现细胞因子可影响肿瘤细胞免疫微环境,导致肿瘤增殖、迁移,目前研究人员主要探讨JAK-STAT信号通路与细胞因子的相互作用和关系,JAK-STAT信号通路可能作为肿瘤的治疗靶点,提高患者生存质量。有研究发现肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα）、白介素-6（interleukins-6,IL-6）和干扰素γ（interferons,IFN-γ）可使STAT表达上调。IFNs和IL-6作用于细胞,促使JAK1和JAK2与受体亚基γ链（γc）和IL6ST结合,介导细胞信号转导,促进STATs表达。有研究表明,IL6ST与胃癌、肝细胞癌、骨肉瘤、乳腺癌发病密切相关,可能作为部分实体瘤的生物标记物;CXCL9在胃癌、乳腺癌、肝细胞癌、子宫颈腺癌的发生发展中具有重要作用。本研究采用RT2Profiler PCR Array的方法,评估CRC中JAK-STAT信号通路蛋白及通路相关细胞因子基因表达情况,筛选差异表达的基因,以期寻找CRC新的生物标志物,为进一步探究JAK-STAT信号通路在CRC发生发展中的调控机制。研究方法:收集CRC患者的肿瘤和正常新鲜组织标本,进行RT2Profiler PCR Array实验分析JAK-STAT信号通路中84个目的基因（GOI）,得到14个差异基因。通过GO分析,KEGG分析及TCGA数据库对筛选出的差异基因进行生物信息学分析。利用CRC患者组织,通过实时荧光定量PCR（Realtime-PCR,RT-PCR）法检测筛选出5个差异基因:CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS。通过Western blot检测了IL6ST和CXCL9在CRC和正常结肠组织中的表达,然后收集组织切片,进行H&E染色和免疫组化检测,评估了患者的病理学特征和临床特征。根据患者随访信息绘制IL6ST和CXCL9单因素生存分析曲线。构建IL6ST过表达的CRC细胞系,使用Western blot检测STAT3和p-STAT3的表达水平,同时检测其对细胞周期、增殖、迁移、侵袭、粘附率及凋亡的影响。结果:1、本研究利用RT2Profiler PCR Array,检测3对CRC患者组织中JAK-STAT信号通路蛋白变化情况,筛选出14个差异基因,其中CXCL9表达上调;GHR、FCER2、NR3C1、IL6ST、A2M、FAS、PIAS2、SMAD2、PTPRC、STAT4、INSR、SMAD4和B2M表达均下调。2、本研究通过GO分析,KEGG分析及TCGA数据库对筛选出的14个差异基因进行生物信息学分析,结果显示CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS与RT2Profiler PCR Array结果一致。3、本研究通过RT-PCR检测CRC患者组织,结果显示CXCL9、IL6ST、A2M、GHR、FAS与RT2Profiler PCR Array的结果一致。Western blot结果显示CRC组织中IL6ST表达显着下调,而CXCL9表达显着上调,与之前的结果一致。4、本研究对90例CRC和30例正常组织样本进行了H&E染色和免疫组化检测。结果显示:1)在CRC组织中,IL6ST表达量较正常组织低,且随着分化程度降低,IL6ST的高表达相对减少;2)在CRC组织中,CXCL9表达量较正常组织高;且随着分化程度降低,CXCL9的高表达相对增加;3)IL6ST和CXCL9的表达呈负相关关系。4)IL6ST和CXCL9与患者的生存情况相关。5、Western blot结果显示过表达IL6ST的HT29细胞中,STAT3的表达无明显差异;与对照组相比,p-STAT3的表达明显升高。6、细胞学结果显示1)过表达IL6ST使HT29细胞增殖能力增强,但细胞周期并无明显改变;2)过表达IL6ST的HT29细胞凋亡显着减少;3)过表达IL6ST可提高HT29细胞迁移和侵袭能力。4)过表达IL6ST的HT29细胞粘附率明显降低。结论:1、在CRC组织中,CXCL9表达上调,GHR,IL6ST,A2M和FAS表达下调,差异具有统计学意义。2、IL6ST和CXCL9的表达呈负相关关系,均与CRC的临床特征密切相关,高表达IL6ST患者预后差,而高表达CXCL9患者预后较好。3、在HT29细胞中,过表达IL6ST上调p-STAT3的表达。4、过表达IL6ST增强HT29细胞增殖、迁移、侵袭能力,降低粘附率,减少细胞凋亡。
成佳楠[2]（2019）在《放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究》文中研究指明第一部分:放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究背景:近年来的研究发现,肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于肿瘤内CD8+T细胞的浸润程度和肿瘤微环境（TME）的状态。放疗可促进肿瘤免疫微环境的炎症反应从而增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤反应,因此其可能作为免疫治疗的重要的辅助手段。已有大量证据证实放疗可诱导肿瘤局部I型干扰素介导的免疫微环境改变,然而其诱导的全身性的免疫调节作用仍有待探索。因此,进一步深入阐明放疗对肿瘤免疫微环境的影响,对探索放疗与免疫治疗的联合具有重要意义。在多种动物模型中,我们观察到放疗（RT）通过重塑肿瘤微环境使其利于嗜酸性粒细胞招募,而这种招募作用与CD8+T细胞浸润增强密切相关。当用抗体清除嗜酸性粒细胞后放疗诱导的CD8+T细胞浸润减少,而对肿瘤的控制也被明显削弱,说明放疗诱导的嗜酸性粒细胞增多对于T细胞介导的抗肿瘤作用不可或缺。在对接受过放疗的肿瘤患者进行回顾性分析时我们也发现了嗜酸性粒细胞和CD8+T细胞之间的相关性。利用动物模型我们证实放疗分别增强了回输的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的瘤内浸润。这一现象与临床实践不谋而合,在一例淋巴瘤患者接受CD19CAR-T细胞治疗的过程中我们发现放疗促进了CAR-T细胞浸润,并缩短了治疗起效时间,延长了患者受益持续时间。综上所述,基于我们的动物和临床发现,放疗引起的嗜酸性粒细胞增多可作为参考预测患者的治疗疗效,甚至提供增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的新策略。方法:1.放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤荷瘤模型（B16-F10）,并对肿瘤进行局部放疗（20Gy）,放疗后第7天取肿瘤组织进行RNA-Seq检测及GSEA分析。检测内容包括:炎症信号,粒细胞活性,粒细胞免疫信号。（2）取放疗后第7天的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤内免疫细胞亚群变化。检测内容包括:CD45阳性淋巴细胞,DC细胞,NK细胞,嗜酸性粒细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞,单核细胞,中性粒细胞,Ly6Chi细胞。（3）建立小鼠B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,一侧肿瘤接受局部20Gy放疗,另一侧不做处理。之后将CFSE标记的活化的嗜酸性粒细胞回输到受辐射小鼠体内,48小时后取肿瘤组织,进行流式细胞术检测双侧肿瘤中CFSE阳性嗜酸性粒细胞。（4）利用Transwell方法检测经放射的肿瘤组织对嗜酸性粒细胞的趋化作用。（5）PCR检测经放射肿瘤组织中与嗜酸性粒细胞趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。2.细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。（1）在B16-F10黑色素瘤动物模型中,对肿瘤进行局部放疗（20Gy）或不处理,PCR检测两组肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关的因子的mRNA表达水平。流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的相关性。（2）建立4T1乳腺癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。（3）建立MC38结肠癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）统计嗜酸性淋巴肉芽肿患者外周血中嗜酸性粒细胞数量,免疫组化检测手术标本中嗜酸性粒细胞的数量,分析外周血与组织浸润嗜酸性粒细胞数量的一致性。（2）收集整理既往接受过放疗的非小细胞肺癌患者（NSCLC）234例,统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作相关分析。（3）收集整理既往接受过放疗的鼻咽癌患者（NPC）249例。统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作分析。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）采用anti-Siglec-F抗体清除荷瘤小鼠体内的嗜酸性粒细胞,流式细胞术检测清除效果。（2）流式细胞术检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内的CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例,并与嗜酸性粒细胞做相关性分析。（3）PCR检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内小鼠肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA信号。（4）嗜酸性粒细胞清除后测量小鼠的肿瘤体积变化情况。5.嗜酸性粒细胞浸润可促进过继免疫治疗的疗效。（1）利用B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,通过尾静脉回输Pmel活化的CD8+T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中Pmel阳性CD8+T浸润情况。（2）建立NPG小鼠双侧荷瘤模型,尾静脉回输CAR-T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中CAR-T浸润情况。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）监测入组临床试验的患者疾病进展。（2）整理患者血常规信息。（3）肿瘤局部穿刺样本检测。结果:1.放疗可促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）RNA-Seq结果提示,放疗后肿瘤组织内活性氧通路、I型干扰素信号、γ干扰素信号及炎症反应信号通路明显增强。其中,关于粒细胞趋化、迁移及活化的基因富集程度明显升高。（2）放疗后肿瘤浸润多种免疫细胞比例增多,其中CD8+T细胞及嗜酸性粒细胞增加明显。（3）双侧荷瘤模型中,与未处理侧肿瘤相比,经放射侧肿瘤内CFSE阳性嗜酸性粒细胞浸润明显增加。（4）体外实验发现,与对照组相比,放射处理的肿瘤组织招募嗜酸性粒细胞的能力更强。（5）PCR检测发现放疗后嗜酸性粒细胞趋化和生存相关的因子表达明显升高。2.嗜酸性粒细胞的浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关。（1）PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关分子的mRNA表达明显增高。流式细胞术检测发现小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞及效应CD8+T细胞的比例均高度相关。（2）在4T1乳腺癌动物模型中,流式细胞术检测也发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。（3）在MC38结肠癌动物模型中,流式细胞术检测也同样发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）非小细胞肺癌患者中,外周血中的嗜酸性粒细胞数量与肺癌组织免疫组化染色计数高度相关,提示外周血中嗜酸性粒细胞的数量可用来预测肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的浸润程度。（2）非小细胞肺癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高,且升高倍数为1.67倍或者2倍以上的患者无进展生存期更长。（3）在鼻咽癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量也明显升高,且升高倍数为2倍或者2.20倍以上的患者无进展生存期更长。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）流式细胞术检测证明anti-Siglec-F抗体有效的清除了小鼠体内的嗜酸性粒细胞。（2）嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤浸润CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例都明显降低,且与嗜酸性粒细胞的比例高度相关。（3）PCR检测发现嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA表达明显降低。（4）嗜酸性粒细胞清除削弱了放疗对小鼠肿瘤生长的控制。5.嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效。（1）B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的Pmel CD8+T细胞的比例和数量明显增多。（2）Raji淋巴瘤NPG小鼠双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的CAR-T细胞明显增多,且CAR-T细胞与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）一例恶性淋巴瘤患者中,放疗联合CAR-T回输治疗延缓肿瘤复发。（2）放疗后该患者外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高。（3）PCR检测肿瘤穿刺样本发现,放疗侧肿瘤内CAR-T细胞浸润明显高于非放疗侧。结论:放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。放疗可促进过继免疫治疗的疗效。放疗可增强恶性淋巴瘤患者CAR-T细胞免疫治疗的疗效。第二部分:肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性背景:肿瘤是一种遗传性疾病,肿瘤细胞的生长是由激活致癌因子的突变引发的。这一过程也涉及到遗传性或非遗传性促癌基因的激活或抑癌基因的失活。在多种癌症中,肿瘤的发生伴随着突变的积累,突变的积累可以通过增加肿瘤细胞的遗传多样性程度,加速肿瘤细胞的进化适应性,从而为肿瘤细胞群提供选择性优势。然而,这种遗传多样性是有代价的:肿瘤细胞相较于正常细胞分化程度越高,越容易被免疫系统识别为异体细胞。虽然长期以来人们一直认同这种可能性的存在,但直到最近几年才证实肿瘤的总突变负荷（TMB）有助于癌症的免疫识别,而且它可能在一定程度上决定个体对抗肿瘤免疫治疗的反应。结合全外显子组测序、转录组分析和T细胞库分析,我们选取了15例非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术切除肿块的多位点组织进行空间特征分析。结果表明肿瘤组织的免疫微环境具有高度的空间异质性,瘤内区域差异与个体间差异一样大。虽然局部总突变量与局部T细胞克隆扩增有关,但局部抗肿瘤细胞毒性与新抗原丰度没有直接关系。综上所述,这些发现提醒我们,免疫学特征不应该仅通过TMB或单位点活检的微环境分析来预测。方法:我们招募了15名新诊断的非小细胞肺癌患者,对于每个从原发肿瘤肿块中采集的多个活检样本,我们进行了多种基因组和免疫原性的基因组分析,包括全外显子组测序（WES）、转录组分析（RNA-seq）和T细胞库测序。为了进一步提高肿瘤免疫微环境评估的准确性,我们开发了一种机器学习方法,将多维免疫相关变量集成起来进行数据挖掘。通过使用一种随机森林算法,输入278个变量将肿瘤位点的免疫微环境分类为“热”肿瘤区域和“冷”肿瘤区域。结果:1.突变负荷与T细胞扩增相关2.突变负荷与细胞毒性不相关3.肿瘤微环境存在空间异质性4.突变异质性与免疫异质性相关结论:瘤内区域间的免疫微环境存在高度的空间异质性,需要综合全面地评价TME免疫表型。
王静林[3]（2019）在《香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究》文中研究说明香菇（Lentinus edodes）是着名的药食两用菌,既味道鲜美、营养丰富,又具有多种药理活性。香菇多糖（Lentinan）是从香菇子实体中提取得到的最有效生物活性成分,作为一种典型的β-（1-3）-D-葡聚糖,它具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种药理活性。早在1980年代香菇多糖既作为抗癌药物上市,在临床上作为免疫增强剂用于癌症的辅助治疗。然而,其抗肿瘤作用的分子机制尚不明确,在一定程度上限制了其临床应用。目前普遍认为香菇多糖仅能通过激活免疫系统发挥间接抗肿瘤作用,而不能直接杀伤肿瘤细胞;且主要表现为T淋巴细胞免疫系统依赖。然而,本课题组在前期研究中发现,香菇多糖能显着抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,即发挥了非免疫途径的抗肿瘤作用。因此,本论文旨在探究香菇多糖是否具有非免疫途径的直接抗肿瘤作用及其内在分子机制,为拓宽香菇多糖的临床应用、充分发挥其药用价值及开发肿瘤治疗新制剂提供理论及实验基础。本论文以房县小香菇子实体为原料,沿用课题组已建立的工艺,提取、分离、纯化得到精制香菇多糖（SLNT）并通过一系列手段进行质量评价。通过体外实验探究了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞的非免疫途径抗肿瘤作用;并建立T细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型及T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型,探讨香菇多糖能否在不同程度免疫系统缺陷的小鼠体内发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤活性;并着重从Ⅰ型程序性死亡（细胞凋亡）及Ⅱ型程序性死亡（自噬性细胞死亡）两个角度探索了其可能的分子机制。本课题研究不仅补充了香菇多糖抗肿瘤分子机制的理论基础,且有助于其作为功能性食品及抗肿瘤临床用药的开发应用。第一部分香菇多糖SLNT的制备香菇多糖的制备沿用本课题组已建立并优化的工艺技术:采用水提醇沉法从房县小香菇子实体中提取香菇粗多糖,再经H2O2脱色法除去色素及部分杂质得到脱色后多糖,最后通过超滤法分离纯化得到精制香菇多糖,经冷冻干燥后为白色絮状物,性状稳定。对提取的香菇多糖进行纯度及分子量鉴定:苯酚‐硫酸法检测精制香菇多糖的糖含量约为98.54%;高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测得精制香菇多糖的重均分子量约为6.23×105 Da,且分子量均一;紫外扫描结果显示其几乎不含蛋白质和核酸。本部分实验结果表明,香菇多糖的提取工艺成熟可靠、易于控制、结果稳定;提取得到的精制香菇多糖（SLNT）分子量均一、纯度高、几乎不含其它杂质,满足后续实验要求。第二部分香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究结肠癌是全球癌症致死数量排名第二的癌症,每年约有100多万新增病例和约50多万死亡病例。目前临床上主要通过手术切除病灶并通过化学疗法进行治疗。尽管化学治疗有助于缓解症状、延长病患的生命,但是其不可避免的副作用（如腹泻、恶心、呕吐、急性心肌梗死、脑血管伤害等）极大地降低了病患的生活质量,严重的甚至可能威胁生命。因此,寻找筛选具有低毒、高效抗肿瘤活性的天然产物变得十分重要。本论文选用了来源为人结肠癌原发灶、属于TNMⅠ期结肠癌、在裸鼠及NOD/SCID小鼠体内成瘤性极好、且多种癌基因表达呈阳性的人结肠癌HT-29细胞系作为研究载体,探究了天然产物香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径直接抗肿瘤作用。通过MTT比色法考察了香菇多糖（SLNT）对人结肠癌HT-29细胞体外增殖的抑制作用。结果显示,将不同浓度香菇多糖（12.5-1600μg/mL）与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的增殖均被显着抑制,且随着香菇多糖浓度增加,抑制率增加,具有一定剂量依赖性。当香菇多糖浓度为1600μg/mL时,抑制率达到66.84%,抗肿瘤作用显着,仅次于阳性对照组氟尿嘧啶（800μg/mL）的抑制率74.24%。通过光学显微镜观察细胞形态,发现香菇多糖组中大量细胞体积变小、贴壁不紧密、与周围细胞连接消失、细胞质浓缩;而正常细胞贴壁紧密,成团生长,细胞质未出现浓缩。建立T淋巴细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型,探究香菇多糖是否能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。采用皮下注射HT-29细胞植瘤建立荷瘤裸鼠模型,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）,阳性对照组（5-FU,20 mg/kg氟尿嘧啶）,香菇多糖低、中、高剂量组（0.2、1.0、5.0 mg/kg SLNT）;每组6只,采取尾静脉注射方式,隔天给药,共给药10次,同时记录裸鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织及脾脏称重,计算脾指数、抑瘤率,并检测裸鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。结果显示,香菇多糖各剂量组裸鼠体重在正常范围内,而氟尿嘧啶组体重严重低于正常水平;低、中、高剂量香菇多糖对HT-29荷瘤裸鼠移植瘤的抑制率分别为17.88%、48.87%和57.90%,具有一定剂量依赖性;氟尿嘧啶的抑制率为67.23%,表明香菇多糖能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。且与阴性对照组相比,香菇多糖各剂量对裸鼠的脾指数及血清中IL-6的水平无明显影响,没有统计学差异,表明香菇多糖未提高其他免疫系统功能;而结果又显示,香菇多糖显着增加了血清中TNF-α的水平,我们猜测香菇多糖的抗肿瘤作用可能与肿瘤坏死因子有一定关联。为了进一步排除香菇多糖免疫调节作用对其直接抗肿瘤作用的影响,我们采用了T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠作为动物模型,并选用与裸鼠实验中相同的给药方式及剂量进行实验。随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、香菇多糖低剂量组（1.0 mg/kg SLNT）及香菇多糖高剂量组（5.0 mg/kg SLNT）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,计算脾指数、抑瘤率、评估香菇多糖的毒副作用,并检测NOD/SCID小鼠血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ及TNF-α水平。结果显示,香菇多糖治疗对小鼠未产生毒副作用;香菇多糖（1 mg/kg and 5mg/kg）各剂量对HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤的生长均有明显抑制作用,抑瘤率分别为45.05%和50.61%;且香菇多糖给药未刺激小鼠脾指数及其血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ水平的上调,证明香菇多糖在免疫系统功能缺失的情况下抑制了HT-29移植瘤的生长,即发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。而与裸鼠实验结果相似的,香菇多糖高剂量组显着上调了小鼠血清中TNF-α的水平,提示TNF-α可能参与了香菇多糖的直接抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞发挥了非免疫途径的直接抗肿瘤作用,且其抑瘤效果显着。并且通过两种免疫缺陷动物模型,证实了香菇多糖同样能在体内实验中发挥其T淋巴细胞免疫系统非依赖性的,甚至免疫系统非依赖的直接抗肿瘤作用。为后文香菇多糖非免疫途径抗肿瘤作用的分子机制研究奠定了基础。第三部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡作用的研究由于细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）被公认为是最主要的导致细胞死亡的分子机制,于是本部分我们通过多种手段及技术探究了香菇多糖是否能诱导HT-29细胞凋亡而发挥其直接抗肿瘤活性。首先,通过流式细胞仪检测发现400、800、1600μg/mL SLNT与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的凋亡率分别达到20.26%、31.80%、48.50%,均明显高于阴性对照组（NC,7.31%）,且具有一定剂量依赖性。为了进一步验证其结果,我们通过DAPI染色法、AO/EB及Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察了SLNT对HT-29细胞凋亡形态学的影响。DAPI染色法可见SLNT组细胞出现不同程度的核固缩（呈致密浓染蓝色荧光）及核碎裂,可见半球状、新月牙状细胞核,呈典型凋亡细胞核形态,而NC组细胞核完整,染色均匀一致;AO/EB染色法可见SLNT组细胞核被染成绿色、黄绿色或橘红色且呈固缩状或圆珠状,细胞核碎裂,而NC组细胞核结构完整,着绿色且均匀一致;Annexin V-FITC/PI染色可见SLNT组出现绿色或红色的早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞,且随着剂量增加,凋亡细胞增多。最后,我们检测了线粒体凋亡发生早期的标志性事件—线粒体膜电位下降。结果显示,香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位。以上研究结果证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其直接抗肿瘤作用。随后,我们通过对裸鼠及NOD/SCID小鼠HT-29肿瘤组织进行H&E染色,初步考察了肿瘤组织中细胞凋亡的情况。形态学观察发现SLNT组肿瘤组织中可见散布凋亡细胞（细胞体积缩小,胞质致密、核固缩或碎裂等）,且随着剂量增加,凋亡区域面积加大,而NC组细胞排列紧密,细胞核完整呈圆形和椭圆形。表明在体内实验中,香菇多糖也可能诱导了细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证明了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用,也为下一部分的机制研究奠定了基础。第四部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡的机制研究细胞凋亡主要由两种途径诱导:内源性途径（线粒体凋亡通路）和外源性途径（死亡受体凋亡通路）。由于上一部分结果发现香菇多糖显着降低了HT-29细胞线粒体膜电位,提示香菇多糖激活了线粒体凋亡通路。因此,我们首先通过免疫印迹实验及免疫组化实验检测了香菇多糖对HT-29细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。结果发现,香菇多糖给药显着激活了凋亡效应酶Caspase-3及凋亡起始酶Caspase-9,并上调了胞浆中细胞色素C（Cytochrome c）的水平及Bax/Bcl-2的比值,表现为线粒体凋亡通路激活。随后,我们评估了线粒体凋亡通络上游刺激因子活性氧（ROS）的水平及其与凋亡的关系。流式细胞仪及荧光显微镜观测发现,香菇多糖显着升高了HT-29细胞中ROS的水平,且具有剂量依赖性;而经过活性氧抑制剂NAC预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至21.49±1.62%(***p<0.001);且抑制活性氧上升后,香菇多糖诱导的胞浆中Cytochrome c及Bax/Bcl-2比值的上调被阻断了,上述结果表明活性氧的升高有利于香菇多糖诱导HT-29细胞线粒体凋亡。但同时结果显示,与NAC组相比（6.94±0.57%）,NAC+SLNT组的凋亡率（21.49±1.62%）仍显着增高,提示香菇多糖可能同时通过死亡受体途径诱导HT-29细胞凋亡。死亡受体凋亡通路可由肿瘤坏死因子受体（TNFR1）、凋亡相关因子（Fas）等与相应配体（TNF-α、FasL等）结合而诱导,从而激活下游凋亡起始酶Caspase-8,继而活化凋亡效应酶Caspase-3,引发细胞凋亡。我们运用多种方法（免疫印迹、免疫组化、免疫荧光法）检测了HT-29细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的水平。结果发现,SLNT显着激活了凋亡效应酶Caspase-8并抑制了NF-κB的活化。结合第二部分实验结果,香菇多糖明显上调了裸鼠及NOD/SCID小鼠血清中TNF-α的水平,提示香菇多糖可能通过TNF-α/TNFR1途径诱导死亡受体凋亡。因此,我们进一步检测了HT-29细胞分泌TNF-α的水平。结果显示细胞经香菇多糖刺激后,其分泌的TNF-α水平显着增高,表明表明香菇多糖有可能通过TNF-α/TNFR1途径激活了死亡受体凋亡通路。前期结果已发现SLNT激活了HT-29细胞及肿瘤组织中的Caspase-3,但为了进一步验证SLNT诱导的HT-29细胞凋亡是否通过Caspase-3激活介导,我们使用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行了实验。流式细胞仪结果显示,经过Ac-DEVD-CHO预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显着降低至15.88±1.58%(***p<0.001),表明香菇多糖诱导的HT-29细胞凋亡极大程度上通过Caspase-3激活介导。而抑制了Caspase-3的激活后,Ac-DEVD-CHO+SLNT组的凋亡率（15.88±1.58%）仍比Ac-DEVD-CHO组（7.77±0.79%）高,提示香菇多糖较小程度上可能通过非Caspase-3激活的途径介导细胞凋亡,有待进一步探究。本部分研究证明香菇多糖同时激活了线粒体及死亡受体凋亡通路,并因此诱导了HT-29细胞及肿瘤组织的凋亡。其分子机制总结如下图:（1）内源性线粒体途径—活性氧急剧增加,线粒体膜电位下降,Bax/Bcl-2比值增大促进细胞色素C由线粒体释放入胞浆,导致凋亡起始酶Caspase-9活化从而激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。（2）死亡受体途径—上调TNF-α水平,激活TNF-α/TNFR1通路,抑制NF-κB炎症反应,从而活化凋亡起始酶Caspase-8,激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。第五部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究自噬（Autophagy）即“自食（self-eating）”,是除细胞凋亡（apoptosis）即“自杀（self-killing）”以外的另一种细胞自我“毁灭”的过程。自噬性细胞死亡也被归Ⅱ型程序性死亡,也是导致细胞死亡的一种分子机制。因此,本部分我们进一步探讨了香菇多糖是否诱导HT-29细胞的自噬作用及其可能的分子机制。LC3是目前被广泛认可的自噬标志蛋白,常被用于自噬的监测。当自噬发生时,弥散性分布于细胞胞浆中的LC3-I会被修饰加工,形成LC3-II并定位于自噬体,从而指示自噬体生成。通过免疫印迹实验发现,与阴性对照组相比,香菇多糖组的HT-29细胞及肿瘤组织中LC3-II显着增加;且LC3免疫荧光实验结果显示,香菇多糖组细胞中绿色斑点（自噬体）较正常细胞明显增多,表明香菇多糖显着刺激了HT-29细胞内自噬体的形成。同时免疫印迹实验显示,香菇多糖显着刺激了自噬体形成关键蛋白Beclin 1的上调,再一次佐证了香菇多糖发挥了促进HT-29细胞自噬体形成的作用。而自噬体的增加并不一定意味着自噬作用增强,也有可能是由于自噬体与溶酶体融合受阻导致。因此,我们通过以下三个实验检测香菇多糖对HT-29细胞自噬流的影响:（1）检测自噬降解过程的标志蛋白p62,其含量降低表明自噬降解过程通畅;（2）mCherry-GFP-LC3B双荧光标记法,同时反映自噬体及自噬溶酶体的数量;（3）透射电镜观察自噬形态。上述实验结果显示,香菇多糖能促进HT-29细胞中自噬流增强,即激活了HT-29细胞自噬。通过免疫印迹实验检测细胞及肿瘤组织中自噬相关蛋白的含量,结果显示香菇多糖显着降低了p-mTOR、PI3K、p-AKT的含量,而显着增加了p-JNK及细胞中p-AMPK的含量。因此,推测香菇多糖可能通过以下途径诱导了HT-29细胞自噬:（1）抑制PI3K/Akt通路并激活了AMPK通路,共同直接或间接地抑制了下游自噬负调控蛋白mTOR的活性,激活自噬。（2）激活了JNK蛋白,促进其磷酸化Bcl-2/Bcl-XL,使自噬关键蛋白Beclin 1与其解离,激活自噬。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖能显着诱导HT-29细胞自噬,并对其内在的分子机制做了初步的探索,更详细全面的机制研究有待进一步探索。第六部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响自噬作用不同于凋亡作用（Ⅰ型细胞程序性死亡）,凋亡作用的最终结果是杀死细胞,而自噬作用对细胞生存的影响却具有双重性—既可保护又可杀伤肿瘤细胞。本部分研究承接第五部分,进一步探讨香菇多糖诱导的HT-29细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响。我们选用了两种公认的自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）及氯喹（CQ）用于实验。MTT实验结果显示,自噬抑制剂氯喹及3-MA组对HT-29细胞的增殖基本无影响;而HT-29细胞经过CQ或3-MA预培养后,香菇多糖对HT-29细胞增殖的抑制率由56.04%（SLNT）分别显着降低至34.89%（SLNT+CQ）、37.63%（SLNT+3-MA）,表明香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接抗肿瘤作用。为了进一步探究自噬激活对香菇多糖体内发挥直接抗肿瘤作用的影响,我们建立了自噬抑制的HT-29荷瘤NOD/SCID小鼠模型。采取皮下注射HT-29细胞植瘤,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、自噬抑制剂氯喹组（5.0 mg/kg CQ）、香菇多糖组（5.0 mg/kg SLNT）、香菇多糖+氯喹组（5.0 mg/kg SLNT+5.0 mg/kg CQ）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织称重,计算抑瘤率并评估氯喹用药的毒副作用。结果显示,香菇多糖组对移植瘤的抑制率为50.61%,而当其与氯喹联用时,抑瘤率显着降低（*p<0.05）至35.23%。本部分研究证明了香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接杀伤作用,即表现为自噬性细胞死亡（Ⅱ型细胞程序性死亡）。总的来讲,香菇多糖能够通过激活人结肠癌HT-29细胞凋亡及自噬性死亡,而发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。本论文的研究为香菇多糖作为新型抗肿瘤药物应用于临床提供了充足的理论依据及实验基础。
李珊[4]（2019）在《组蛋白去乙酰化酶在特发性间质性肺炎发病机制中的初步探索》文中提出背景和目的:隐源性机化性肺炎（COP）和特发性肺纤维化（IPF）均属于特发性间质性肺炎（IIP）,二者的肺组织病理中均可见肺成纤维细胞与肌成纤维细胞,但糖皮质激素疗效却相差甚远,具体机制不明。组蛋白乙酰化与去乙酰化修饰可以改变组蛋白与DNA的亲和状态,来调控下游基因的表达,参与脏器纤维化发生发展过程。糖皮质激素发挥抗炎作用也需要组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的参与。本研究拟通过比较IPF和COP患者外周血及肺组织中HDAC的水平,并对外周血HDAC总体活性与患者临床参数进行相关性分析,初步探索HDAC在IPF、COP发病机制中的可能作用,为IPF这一难治性疾病的治疗提供新的思路。研究方法:（1）采集IPF组（n=15）、COP组（n=15）及对照组（n=15）外周血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,进行核浆分离,采用荧光法测定各组HDAC总体活性,并分析其与各组临床参数的相关性,进一步为肺组织实验提供提示。（2）采集石蜡包埋的IPF肺组织（n=5）、COP肺组织（n=5）及正常肺组织（n=5）,正常肺组织为距病灶5cm以上的肺组织,经HE染色选取成纤维细胞灶肺组织提取RNA,并进行Real time-PCR,检测各组肺组织中I类HDAC基因表达水平,同时检测各组成纤维细胞功能相关基因（FAS和Thy-1）及糖皮质激素受体β（GRβ）基因表达水平。取各组肺组织进行免疫组织化学染色,检测各组成纤维细胞及炎细胞中HDAC1、HDAC2的表达水平。结果:（1）外周血实验:1)IPF组及COP组PBMC胞质蛋白HDAC活性分别为（724±216）nmol/L、（718±245）nmol/L,高于健康对照（409±105）nmol/L（均P<0.01）。2)IPF组及COP组PBMC核蛋白HDAC活性分别为（2309±708）nmol/L、（3310±1005）nmol/L,高于健康对照（1572±611）nmol/L（均P<0.01）。3)COP患者PBMC核蛋白HDAC活性高于IPF患者（Z=-2.840,P=0.005）。4)PBMC核蛋白HDAC活性与IPF患者FEV1、DLCO呈负相关（r=-0.574,P=0.025;r=-0.583,P=0.029）,与 COP 患者 FVC、TLC 呈负相关（r=-0.846,P=0.016;r=-0.900,P=0.015）。（2）肺组织实验:1)IPF 与 COP 肺组织的I类HDAC基因表达水平存在差异:IPF患者肺组织HDAC2 mRNA表达高于COP及正常肺组织（P=0.044;P=0.018）;IPF及COP患者肺组织HDAC3 mRNA表达均低于正常肺组织（P=0.043;P=0.001）;IPF、COP及正常肺组织HDAC1、8mRNA表达水平无统计学差异（F=0.115,P=0.892;x2=4.34,P=0.114）。2)IPF及COP成纤维细胞灶肺组织Thy-1、FAS基因mRNA表达水平均低于正常肺组织（均P<0.05）,IPF及COP组间无统计学差异（均P>0.05）。3)IPF、COP及正常肺组织GRβ基因mRNA表达水平无统计学差异（F=3.243,P=0.075）。4)免疫组化显示:正常肺组织成纤维细胞HDAC1、2呈阴性表达,IPF、COP肺组织成纤维细胞HDAC1、2均呈阳性表达;IPF成纤维细胞HDAC2表达高于COP、HDAC1表达低于COP,但IPF炎细胞中HDAC1、2表达均低于COP,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。结论:IPF和COP患者外周血HDAC总体活性升高、肺组织HDAC1及HDAC2表达上调,其PBMC核蛋白HDAC总体活性可能与患者肺纤维化程度相关。IPF与COP肺组织成纤维细胞HDAC1、2上调可能与二者肺组织Thy-1、FAS表达下降有关,导致二者均发生成纤维细胞异常聚集。IPF肺组织未见GRβ表达上调,虽然其肺组织成纤维细胞灶HDAC2表达高于COP,但炎细胞HDAC1、2表达均低于COP,这可能与糖皮质激素对IPF疗效不佳有关。
王正华[5]（2008）在《细胞因子LIGHT和IFN-γ联合转染HepG2细胞及对其凋亡影响的实验研究》文中指出目的:观察脂质体介导的LIGHT和IFN-γ配比转染HepG2细胞后对其凋亡及Fas和FasL表达的影响。方法:用本实验室已成功制备的LIGHT和IFN-γ的质粒DNA转化E.coliJM-109感受态大肠杆菌,提取质粒;将HepG2细胞分为LIGHT基因单独转染组、LIGHT和IFN-γ基因联合转染组及空白对照组,处理后分别于12h,24h,48h收集HepG2细胞,用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡及Fas和FasL的表达情况。结果:转染后,Fas和FasL在HepG2细胞高表达,但FasL不如Fas升高程度显着。Fas在LIGHT基因单独转染组表达率高于空白对照组,而LIGHT和IFN-γ联合转染组又高于LIGHT基因单独转染组（P＜0.01）;LIGHT和IFN-γ联合转染组在12h和24h FasL的表达明显高于LIGHT基因单独转染组（P＜0.01）,在48h低于LIGHT基因单独转染组（P＜0.01）。转染后HepG2细胞随时间的延长凋亡率增高,且LIGHT基因单独转染组细胞凋亡率高于空白对照组,而LIGHT基因和IFN-γ联合转染又高于LIGHT基因单独转染组（P＜0.01）。结论:利用脂质体成功将LIGHT和IFN-γ的质粒DNA转染HepG2细胞,转染后HepG2细胞Fas和FasL表达上调,细胞凋亡率增高,且LIGHT基因和IFN-γ基因联合转染效果优于LIGHT基因单独转染。
范晓东[6]（2007）在《重组hIFN-α-2b-BCG菌苗对膀胱肿瘤免疫治疗的实验研究》文中指出膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，近年来的小剂量BCG和干扰素-α联合灌注的方案在治疗膀胱浅表肿瘤、预防肿瘤复发方面显示出了较好的耐受性和较高的完全反应率，在鼠的膀胱癌模型试验中也显示，BCG和干扰素-α联合应用的疗效均优于二者单独应用。BCG与干扰素-α联合应用时，由于降低了BCG用量，从而减轻了其毒副作用又保持了其抗肿瘤活性，同时，降低了干扰素-α大剂量反复灌注产生的高昂费用。虽然到目前为止干扰素-α提高BCG抗肿瘤作用的确切机制尚未清楚，但最近研究结果显示，干扰素-α可在以下几方面提高BCG的免疫活性：①协同免疫细胞诱导IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α等细胞因子产生；②活化T细胞增殖；③提高对膀胱肿瘤的直接作用，如直接抑制生长等。为了解决联合灌注中干扰素半衰期短、用量大的缺点，自身能分泌细胞因子的重组BCG成为了新的研究热点。随着基因重组与分子克隆技术发展与进步，一种能够在Escherichia-coli和BCG共同复制外源基因的载体，以及载体上HSP（heat-shock protein，热休克蛋白）启动子和SS（信号序列）的发现，开始使重组BCG能够有效的表达不同的细胞因子、标志蛋白和抗原，重组BCG进入了一个新的时代。重组BCG以野生型BCG作为工程菌，利用基因工程技术将外源基因导人野生型BCG中，依靠BCG在宿主内复制，表达多种外源抗原，以诱导对多种疾病的特异性体液和细胞免疫。这种基因工程BCG疫苗与分枝杆菌佐剂加病原体抗原配制的混合疫苗相比，重组BCG集佐剂和载体于一身，兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种可获得强而持久的多种特异性免疫。重组BCG的成功构建也引发了新的课题，就是其体外生物学行为、细胞因子表达的稳定性、菌苗体外的抗肿瘤细胞增殖作用及活化诱导效应细胞的抗肿瘤活性、体内对肿瘤的治疗作用及全身和局部的免疫效应等等问题，本课题的目的就是分别采用体内外实验，探讨重组hIFN-α-2b-BCG菌苗的抗肿瘤效果及其作用机制，主要研究内容和结果如下：1、重组hIFN-α-2b-BCG对外周血淋巴细胞的免疫调节（1）测定重组BCG上清液中hIFN-α-2b的含量，与外源性hIFN-α-2b比较，结果发现重组BCG上清液IFN-α-2b浓度相当于5000IU／ml。（2）分离人外周血中的单个核细胞（Peripheral blood monocytes，PBMC），将其和0.01 OD终浓度的重组BCG、野生型BCG以及野生型BCG联合干扰素-α共同培养，用MTT法测定PBMC增殖，并用ELISA法检测培养液中TH1型细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α分泌水平。比较重组BCG与野生型BCG对PBMC诱导活化的不同效果；与野生型BCG联合干扰素组对比，比较一次性外源性干扰素的加入和重组BCG持续表达IFN-α-2b的作用效果。结果表明，重组BCG自身持续分泌IFN-α-2b对PBMC活化效果明显，PBMC增殖在72小时达峰值，增殖比例为4.96倍，高于野生BCG的2.5倍和野生型BCG联合干扰素组的3.6倍。TH1型细胞因子测定结果也得到同样的结论，测定PBMC活化表达IFN-γ的量峰值达到2977pg／ml、IL-12为292pg／ml、TNF-α为7914pg／ml，高于野生型BCG测定结果，且重组BCG活化PBMC效果强而持久，明显优于一次性干扰素的加入效果。（3）对重组BCG上清液IFN-α-2b与等量外源性干扰素诱导TH1型细胞因子的生成水平进行比较，实验结果显示，上清液IFN-α-2b与等量的外源性干扰素生物学活性相近。2、重组hIFN-α-2b-BCG抗膀胱肿瘤细胞效应的体外研究（1）不同浓度重组BCG活化PBMC生成rBAK（Recombinant bacillus Calmette-Guerin activated killer）细胞，与人膀胱肿瘤细胞EJ共同培养，采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测rBAK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，结果显示，未经诱导的淋巴细胞杀伤活性明显低下（7.6％），不同浓度的野生型BCG活化的BAK（bacillus Calmette-Guerin activated killer）细胞杀伤活性为12.38～20.89％；野生BCG与干扰素联合组活化效应细胞杀伤活性为15.78～34.72％；重组BCG活化的rBAK细胞杀伤效果达到实验组最高，为20.31～51.22％，与野生型BCG组相比有统计学差异。（2）重组BCG与膀胱肿瘤细胞（EJ、MB49）共同培养，光镜下可见肿瘤细胞变圆，增殖速度明显减缓，部分细胞脱壁，胞浆可见大量空泡和颗粒状物质，细胞周围有菌群包绕，；透射电镜下可见肿瘤细胞表面微绒毛脱落，染色质溶解，细胞质坏死，出现大量空泡，细胞表面有出泡现象；吖啶橙染色可见肿瘤细胞聚集成团状细胞球体，胞突消失，细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体出现；Hoechst33258染色后荧光显微镜下可见大量肿瘤细胞出现明亮的蓝色荧光，表明重组BCG成功诱导肿瘤细胞凋亡。（3）重组BCG与EJ细胞共同培养后48小时DNA电泳出现DNA Ladder，表明EJ细胞出现凋亡。（4） MTT法测定重组BCG对膀胱肿瘤细胞（EJ、MB49）的抑制效应，结果表明肿瘤细胞的生长随着共同培养时间的延长不同程度的被重组BCG所抑制，且抑制率高于野生型BCG。（5）重组BCG诱导MB49细胞凋亡的流式测定，24小时检测，野生型BCG诱导凋亡率为10.81％，而重组BCG诱导凋亡率达19.71％；48小时检测，野生型BCG为20.94％，重组BCG为46.58％，二者比较有显着性差异（P＜0.05）。（6）流式细胞检测表明，重组BCG与小鼠膀胱肿瘤细胞共同培养后，上调MB49细胞MHC-Ⅰ抗原的表达，具有时间依赖性，且上调比例明显高于野生型BCG，表明重组BCG有效提高肿瘤细胞的免疫原性，诱导免疫攻击。3、重组hIFN-α-2b-BCG对原位膀胱肿瘤小鼠模型治疗效应的研究（1）成功构建了C57BL／6原位膀胱肿瘤小鼠模型，重组BCG灌注治疗组的小鼠平均膀胱重量显着低于PBS对照组，与野生型BCG治疗组、野生BCG+IFN治疗组相比虽无统计学差异，但重组BCG治疗组的小鼠生存率高于野生型BCG治疗组，提示重组BCG对膀胱肿瘤的预后有一定的关系。（2）采用流式细胞仪对小鼠膀胱灌注治疗后的淋巴细胞亚群进行分析，并测定小鼠血清中mTNF-α和mIL-12的水平，了解小鼠全身免疫状况。结果显示重组BCG灌注治疗后小鼠外周血CD4+T细胞的比例明显增高，而CD8+T细胞的比例则无明显变化，CD4+／CD8+比例大幅提高，纠正了荷瘤小鼠治疗前普遍存在的比例失调；荷瘤小鼠的外周血中TH1型细胞因子mTNF-α和mIL-12水平灌注治疗后大幅提高，表明重组BCG灌注具有增强荷瘤小鼠细胞免疫的作用。（3）肿瘤组织冰冻切片进行T细胞亚群的免疫组织化学分析，了解重组BCG灌注治疗后膀胱局部免疫反应。重组BCG组的瘤组织内CD3+、CD4+、CD8+检测强阳性，说明有大量淋巴细胞浸润，局部免疫反应明显。（4）免疫组化检测P53和Fas在小鼠膀胱肿瘤中的表达。荷瘤小鼠膀胱肿瘤表达Fas为弱阳性，而重组BCG灌注后Fas呈明显的阳性表达，表明重组BCG可以显着提高Fas在膀胱肿瘤细胞的表达，增强了肿瘤细胞的免疫原性；荷瘤小鼠膀胱肿瘤P53表达强阳性，肿瘤浸润迅速，恶性度高，重组BCG灌注治疗后，P53表达显着下降，提示重组BCG与防止肿瘤恶性度增高有一定的关系。通过以上研究，我们认为，重组hIFN-α-2b-BCG具有调节人外周血淋巴细胞增殖、活化TH1型细胞因子表达的能力，诱导杀伤膀胱肿瘤细胞；自身可抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡，上调肿瘤细胞MHC-Ⅰ抗原的表达；在小鼠体内具有调节系统及局部免疫能力的作用，纠正荷瘤小鼠淋巴细胞亚群的比例失调，增强局部淋巴细胞浸润，抑制肿瘤生长，上调荷瘤小鼠Fas的表达，诱导对肿瘤细胞的免疫攻击，下调P53的表达，影响肿瘤预后。
王萍[7]（2007）在《人参总皂苷和小檗碱对肿瘤主动性免疫逃逸机制的影响》文中研究指明免疫逃逸（immune escape）在肿瘤的发生、发展过程中有着重要的作用,其机制复杂,涉及肿瘤和宿主两方面。从肿瘤角度来说,一方面,肿瘤抗原的缺失、MHC分子的改变、共刺激分子的缺乏等可以使肿瘤免受宿主免疫细胞的识别,从而逃脱抗肿瘤免疫反应;另一方面,肿瘤也可以通过“Fas反击机制”、免疫抑制性分子的分泌等机制主动影响抗肿瘤免疫细胞的增殖活化或功能。人参总皂苷（Gs）、小檗碱（Ber）分别是补益药人参和清热解毒药黄连等的组分,抗肿瘤作用明显。Gs和Ber的抗肿瘤作用机制主要是抑制增殖、诱导凋亡,抑制侵袭和转移,诱导分化等方面,在肿瘤免疫逃逸机制方面的研究尚未见报道。本研究观察了Gs和Ber对人肺癌PG细胞抑制Jurkat T淋巴细胞增殖和促进其凋亡的影响,以及对PG细胞FasL、Fas分子的表达及其TGF-β1、PGE2分泌的作用,以探讨Gs和Ber对肿瘤细胞主动性免疫逃逸机制的影响,为Gs和Ber的抗肿瘤作用机制扩展新的研究内容,并为药物的合理运用提供实验依据。本研究运用人参总皂苷和小檗碱处理肺癌PG细胞24h后进行实验,分组如下:Control组（PG细胞未经药物处理）,Gs组（PG细胞经100μg/ml人参总皂苷处理）和Ber组（PG细胞经10μg/ml小檗碱处理）。1.首先建立PG细胞与Jurkat T细胞的共培养体系,观察Jurkat T细胞的生长状况和增殖情况。（1）倒置显微镜下直接观察到,Jurkat T细胞在单独培养情况下成团生长,而Jurkat T细胞与PG细胞共培养24h后呈散在生长;Jurkat T细胞与Gs组和Ber组PG细胞共培养后数目均较Control组明显减少。（2）台盼兰拒染实验结果显示,共培养6h、24h后,Jurkat T细胞活细胞数目明显减少,与单独培养组（Jurkat T组）有统计学差异（P<0.05）;而Jurkat T细胞与Gs组PG细胞共培养6h、24h后其生长抑制均较Control组明显,Jurkat T细胞与Ber组PG细胞共培养24h后其生长抑制也与Control组有统计学差异（P<0.01）;（3）PG细胞培养上清液与Jurkat T细胞孵育实验结果表明,各组PG细胞培养上清液与T细胞悬液（细胞数不变）的体积比为2:1、1:1、0.5:1时,Jurkat T细胞的生长均受到抑制,大部分组与阴性对照组（Jurkat T组）比较有统计学差异,且呈体积依赖性;各不同体积比组中,Gs组、Ber组与Control组比较均无差异。结果提示,PG细胞对Jurkat T细胞的生长有抑制作用,此作用在人参总皂苷和小檗碱处理PG细胞后更为显着。2.分别用形态学方法和流式细胞术观察和检测了共培养体系中Jurkat T细胞的凋亡。（1）Giemsa染色结果显示,单独培养的Jurkat T细胞形态均一,呈球形,核大,几乎占据整个胞浆,呈均匀的紫黑色;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,不规则细胞增多,核可见裂纹及固缩现象;（2）在荧光显微镜下,吖啶橙染色显示:单独培养组Jurkat T细胞的细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光,圆形,形态均一,胞浆呈橘红色或荧光不明显;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,可见细胞核绿色荧光呈半月型等固缩形态,并可见呈现弱荧光的细胞。（3）流式细胞术检测结果表明,Jurkat T细胞在单独培养条件下的自然凋亡率较低（早期凋亡率为:5.57%,中晚凋亡率为:4.67%）,而各共培养组均表现出较高的凋亡率（早期凋亡率>10%,而中晚期凋亡率为50%左右）,两者不管在早期或中晚期差异均有极显着性;而共培养Gs组的Jurkat T细胞早期凋亡率为15.79%,与Control组比较（11.40%）有统计学差异（P<0.05）,Ber组凋亡率与对照组无差异;而Gs组、Ber组Jurkat T细胞的中晚期凋亡率与Control组比较差异不明显,但Gs组与Ber组的总凋亡率,即各期凋亡率总和,与Control组比较均有差异（P<0.01,P<0.05）。结果提示,PG细胞可以诱导Jurkat T细胞的凋亡,Gs和Ber均可以促进PG细胞诱导Jurkat T细胞的凋亡。3.免疫细胞化学法检测PG细胞FasL、Fas分子的表达。结果如下（1）肺癌PG细胞有FasL分子的表达,主要分布在胞浆;Gs和Ber均可使PG细胞FasL分子的阳性表达增强。（2）Fas分子在PG细胞也有表达,主要分布在胞浆,胞膜亦有表达;Gs和Ber对Fas分子表达无明显影响。（3）FasL、Fas分子表达的图像分析结果表明,Gs和Ber对FasL分子的表达有上调作用,与对照组比较差异有显着性（P<0.05, P<0.01）;Gs对Fas的表达亦有上调作用,而Ber无影响。结果提示,PG细胞有FasL、Fas分子的表达;Gs和Ber能促进FasL和/或Fas的表达。4.运用ELISA法和放射性免疫法分别检测PG细胞培养上清液中转化生长因子β1（TGF-β1）和前列腺素E2（PGE2）的含量。结果显示,PG细胞可分泌TGF-β1和PGE2,100μg/mlGs和5μg/ml、2.5μg/ml Ber均可以促进TGF-β1的分泌;但Gs和Ber各浓度组均对PGE2的分泌无影响。结果提示,PG细胞能分泌TGF-β1和PGE2,Gs和Ber可以促进TGF-β1的分泌,而对PGE2无影响。上述结果表明,肺癌PG细胞能抑制共培养的Jurkat T细胞的增殖并诱导其凋亡,而Gs和Ber能增强肿瘤PG细胞的这种作用,其机制可能与Gs和Ber上调PG细胞凋亡相关分子FasL、Fas的表达以及增加免疫抑制性细胞因子TGF-β1的分泌有关。因此推断,人参总皂苷和小檗碱在抗肿瘤的同时也有可能促进肿瘤的免疫逃逸。
徐彤[8]（2006）在《细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究》文中提出大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,大肠癌肝转移是影响其长期生存的重要因素。进行大肠癌根治性切除术后的病人近一半由于疾病复发在5年内死亡,绝大多数发生肝转移。大肠癌以肝转移最为常见,发生肝转移率为50%左右。大肠癌肝转移的患者仅5%～10%可得到肝切除的机会,肝转移切除术后患者5年存活率达20%～40%。绝大多数的肝转移由于肿瘤的数目、大小、位置及病人的全身状况不允许被切除。肝转移是大肠癌晚期患者死亡的主要原因。大肠癌肝转移包括多个步骤,癌细胞从原发部位侵入血管,与肝血管内皮细胞附着,穿透进入肝实质并定居。众所周知,肿瘤细胞的侵袭及其逃避机体免疫监控是肿瘤转移的要素。肿瘤转移的结果依赖于恶性细胞与宿主环境复杂的相互作用。通过改变肿瘤细胞增殖与死亡的平衡,恶性细胞与宿主环境的相互作用可影响原发癌的生长及转移。 凋亡或程序化细胞死亡在正常细胞调控中起重要作用,同时被细胞内外的各种信号所调控。Fas抗原（APO-1/CD95）与Fas配体（FasL）组成的Fas系统,在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。效应细胞FasL结合靶细胞Fas抗原后,在数小时内通过细胞凋亡途径使靶细胞死亡。近年来很多研究发现,Fas在多种细胞表面均有表达,而FasL表达只限于少量细胞类型,诸如淋巴细胞、免疫特权器官的细胞和多种恶性肿瘤细胞,同时已证实表达FasL的肿瘤周围激活的Fas阳性淋巴细胞凋亡异常增加。另一方面,肿瘤的发生在很大程度上是因为转化的细胞不能正常凋亡所致。根据早期的文献,通过表达Fas配体及对
王心明[9]（2006）在《Fas/FasL系统在乳腺疾病中的作用以及sFas作为乳腺癌转移标志物的研究》文中研究指明近年来,肿瘤转移研究最重要的进展在于,首先,基本确定新生血管形成在原发肿瘤生长和肿瘤转移过程中的关键作用。其次,对于肿瘤与宿主以及肿瘤细胞与相临基质微环境之间的相互影响、相互作用更为重视。VEGF（血管内皮生长因子）是一种重要的血管生成因子,它通过刺激血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生成,在肿瘤的生长扩散过程中起到重要作用。现已证实VEGF的表达与乳腺癌的侵袭和转移能力有关。在肿瘤和宿主方面,近年来研究的热点是MMPs（基质金属蛋白酶）,它的大量表达可以重新塑造微环境,和降解细胞外基质侵袭周围组织、降解血管基底膜,促成了肿瘤细胞进入血管,向远处转移。MMPs的活性形态可以被人体内部的TIMPs（基质金属蛋白酶抑制剂）通过活性结合的方式而抑制。隐藏于肿瘤细胞基质及基底膜中的血管生成因子如VEGF是通过MMPs的蛋白水解而释放出来的。近几年来,已基于Fas/ FasL系统的研究已成为分子生物学领域中重要进展之一,从对Fas/ FasL系统的分离、鉴定、表达及功能上的研究,发现Fas/ FasL系统在多种肿瘤免疫性疾病和肿瘤的发生、发展有关系。sFas（可溶性sFas）是由MMPs水解Fas胞外区产生的可溶性细胞因子。肿瘤细胞在进入循环系统时产生和释放的sFas不仅可以诱导循环系统中激活的T细胞凋亡,使肿瘤细胞更易增殖并发生转移;同时它与现已明确的和转移相关的标志物及细胞因子密切相关,我们有理由相信sFas不但是肿瘤发生的早期信号而是参与了肿瘤发展转移的全过程。但国内外对其与转移的关系还鲜有报道。正是基于sFas与MMPs、VEGF这种关系的特殊性,我们才猜测:sFas在血清中在乳腺癌发展中浓度的变化,是否会反映肿瘤转移的情况?虽然现已确定的肿瘤标志物很多,但血液的标志物很少,且由于其自身的不完善,临床上尚未应用,如果可以通过大量病例,找到sFas
张娇[10]（2006）在《人肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸机制及其反义寡核苷酸、细胞因子的逆转作用》文中研究指明目的：肿瘤的发生和发展与细胞凋亡及机体免疫功能的异常关系密切，通过Fas／FasL系统抵抗Fas介导的凋亡以及反击免疫细胞使T细胞凋亡，是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。本课题通过对肝癌细胞株HepG2．2．15的Fas、FasL及其功能的检测，探讨肝癌细胞通过Fas／FasL途径的免疫逃逸机制；并通过分析肝癌组织细胞Fas-670位点基因多态性，探究肝癌细胞Fas表达低下的原因；通过将FasL反义寡脱氧核苷酸（ASODN）转染入肝癌细胞及将Fas ASODN转染T细胞，研究Fas、FasL ASODN抑制肝癌细胞诱导的T细胞凋亡，逆转肝癌细胞免疫逃逸的作用机制；通过干扰素-α上调肝癌细胞Fas表达，研究细胞因子对肿瘤细胞凋亡的促进作用。 方法：（1）流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞HepG2．2．15表面Fas及FasL的表达；（2）用激活性Fas单抗CH11诱导细胞凋亡的方法研究肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗；（3）用HepG2．2．15细胞与Jurkat细胞共培养法研究肝癌细胞表面FasL诱导T细胞凋亡的机制。（4）用PCR-RFLP法分析肝癌组织细胞Fas-670位点的基因多态性。（5）根据Fas及FasL基因序列设计合成特异的互补于mRNA起始密码区的Fas及FasL ASODN，并设同长度的与mRNA起始密码区序列相同的正义寡脱氧核苷酸（SODN）做对照，均经硫代磷酸化修饰。根据预实验结果，选择120nmol／L、200nmol／L、280nmol／L为转染液的终浓度，通过脂质体介导法转导
二、干扰素对肿瘤细胞Fas表达的上调作用及与细胞凋亡的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、干扰素对肿瘤细胞Fas表达的上调作用及与细胞凋亡的关系（论文提纲范文）
（1）IL-6ST在结直肠癌中的表达及对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :筛选结直肠癌中JAK-STAT信号通路相关差异基因的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验试剂及仪器 |
| 2.1.1 试剂耗材 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 用于RT2Profiler PCR Array的患者组织标本收集 |
| 2.2.2 组织RT2Profiler PCR Array |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 筛选CRC中 JAK-STAT信号通路差异基因 |
| 3.2 生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :IL6ST和 CXCL9 对结直肠癌进展影响的研究 |
| 6 前言 |
| 7 材料和方法 |
| 7.1 实验试剂及仪器 |
| 7.1.1 试剂耗材 |
| 7.1.2 主要实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 用于RT-PCR测定的患者和组织标本 |
| 7.2.2 用于H&E和免疫组化的患者和组织标本 |
| 7.2.3 RT-PCR方法分别检测CXCL9、IL6ST、A2M、FAS、GHR的mRNA表达变化 |
| 7.2.4 应用Western blot技术检测蛋白表达情况 |
| 7.2.5 H&E染色和免疫组化 |
| 7.3 统计学分析 |
| 8 实验结果 |
| 8.1 差异基因的mRNA表达水平 |
| 8.2 IL6ST在 CRC组织中表达下调,CXCL9在CRC组织中表达上调 |
| 8.3 IL6ST和 CXCL9 表达水平与CRC患者病理学特征的关系 |
| 8.4 IL6ST和CXCL9 表达水平与CRC患者生存率的关系 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分 :过表达IL6ST对细胞功能影响的研究 |
| 11 前言 |
| 12 材料和方法 |
| 12.1 实验试剂及仪器 |
| 12.1.1 实验细胞系 |
| 12.1.2 试剂耗材 |
| 12.1.3 主要实验仪器 |
| 12.2 实验方法 |
| 12.2.1 实验细胞系 |
| 12.2.2 细胞培养 |
| 12.2.3 细胞转染造模 |
| 12.2.4 RT-PCR分析 |
| 12.2.5 CCK-8检测 |
| 12.2.6 流式细胞仪进行细胞周期检测 |
| 12.2.7 细胞迁移实验 |
| 12.2.8 细胞侵袭实验 |
| 12.2.9 细胞粘附实验 |
| 12.2.10 流式细胞仪进行细胞凋亡实验检测 |
| 12.3 统计学分析 |
| 13 实验结果 |
| 13.1 IL6ST和 CXCL9 在细胞系中的表达 |
| 13.2 IL6ST调控STAT3 的活化 |
| 13.3 过表达IL6ST对细胞增殖能力的影响 |
| 13.4 过表达IL6ST对细胞凋亡的影响 |
| 13.5 过表达IL6ST对细胞迁移的影响 |
| 13.6 过表达IL6ST对细胞侵袭功能的影响 |
| 13.7 过表达IL6ST对细胞粘附功能的影响 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 :放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8~+T细胞浸润的作用及机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嗜酸性粒细胞浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 嗜酸性粒细胞在CD8~+T 细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果及分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 放疗可使CAR-T治疗患者受益更多 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 结果及分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第二部分 :肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放疗对肿瘤微环境的影响研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及撰写的文章 |
| 致谢 |
（3）香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 香菇多糖SLNT的制备 |
| 1.香菇多糖SLNT的提取、分离、纯化 |
| 2.香菇多糖SLNT的纯度及分子量测定 |
| 3.结果与讨论 |
| 第二部分 香菇多糖对人HT-29 结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞体外增殖的抑制作用 |
| 2.香菇多糖对HT-29 荷瘤免疫缺陷裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.香菇多糖对HT-29 荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 4.结果与讨论 |
| 第三部分 香菇多糖体内外诱导人HT-29 结肠癌细胞凋亡作用 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞凋亡作用的研究 |
| 3.结果与讨论 |
| 第四部分 香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡的机制研究 |
| 1.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 2.活性氧对香菇多糖诱导HT-29 细胞线粒体凋亡的影响 |
| 3.香菇多糖对HT-29 细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的影响 |
| 4.Caspase-3 在香菇多糖诱导HT-29 细胞凋亡中发挥的作用 |
| 5.结果与讨论 |
| 第五部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究 |
| 1.香菇多糖体外诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 2.香菇多糖体内诱导HT-29 细胞自噬作用的研究 |
| 3.香菇多糖诱导HT-29 细胞自噬的初步机制研究 |
| 4.结果与讨论 |
| 第六部分 香菇多糖诱导人HT-29 结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 1.MTT法检测体外香菇多糖诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 2.建立自噬抑制HT-29 荷瘤NOD/SCID小鼠模型观察香菇多糖体内诱导自噬对其直接抗肿瘤作用的影响 |
| 3.结果与讨论 |
| 研究总结 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 中英文缩略词对照表 |
| 附录2 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录3 实验动物合格证 |
（4）组蛋白去乙酰化酶在特发性间质性肺炎发病机制中的初步探索（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 特发性肺纤维化与隐源性机化性肺炎外周血组蛋白去乙酰化酶总体活性的比较 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 特发性肺纤维化和隐源性机化性肺炎肺组织中Ⅰ类组蛋白乙酰化酶的表达水平的比较 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组蛋白乙酰化与去乙酰化平衡与呼吸系统疾病 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）细胞因子LIGHT和IFN-γ联合转染HepG2细胞及对其凋亡影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1.材料 |
| 1.2.实验方法 |
| 第二章 结果 |
| 2.1.人肝癌细胞的培养 |
| 2.2.转染后HepG2细胞的凋亡 |
| 2.3.转染后Fas在HepG2细胞的表达 |
| 2.4.转染后FasL在HepG2细胞的表达 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1.以阳离子脂质体为载体的基因转染 |
| 3.2.LIGHT与肿瘤免疫 |
| 3.3.IFN-γ与肿瘤免疫 |
| 3.4.Fas/FasL系统与肿瘤免疫 |
| 3.5.LIGHT与IFN-γ的联合抗肿瘤作用 |
| 3.6.展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）重组hIFN-α-2b-BCG菌苗对膀胱肿瘤免疫治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 重组hIFN-α-2b-BCG对人PBMC免疫调节效应的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 重组hIFN-α-2b-BCG对膀胱肿瘤细胞抑制效应的体外研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 重组hIFN-α-2b-BCG对小鼠原位膀胱肿瘤治疗效应的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 综述 原位膀胱肿瘤实验动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
（7）人参总皂苷和小檗碱对肿瘤主动性免疫逃逸机制的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 肿瘤主动性免疫逃逸机制的研究进展 |
| 综述二 中医药调节肿瘤免疫逃逸机制的研究进展 |
| 综述三 人参皂苷和小檗碱抗肿瘤作用的研究进展 |
| (一) 人参皂苷的抗肿瘤作用研究进展 |
| (二) 小檗碱抗肿瘤作用的研究进展 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG 细胞抑制T 细胞增殖和诱导T 细胞凋亡的影响 |
| 实验一人参总皂苷和小檗碱处理的肺癌PG 细胞及培养上清液对T 细胞增殖的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二人参总皂苷和小檗碱处理的肺癌PG 细胞对T 细胞凋亡的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG 细胞主动性免疫逃逸机制的影响 |
| 实验一 人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG 细胞FasL、Fas 分子表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG 细胞分泌TGF-β1、PGE2 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附图 |
（8）细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 细胞因子促进表达Fas配体人结肠癌细胞免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 大肠癌肝转移中Fas／FasL的相互作用与细胞因子关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述1：大肠癌肝转移的研究进展 |
| 综述2：Fas／FasL与肿瘤关系研究的进展 |
| 致谢 |
（9）Fas/FasL系统在乳腺疾病中的作用以及sFas作为乳腺癌转移标志物的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 Fas 系统与肿瘤 |
| 1. Fas 系统的结构 |
| 2. Fas 系统介导调亡信号的传导途径 |
| 3. Fas 系统的分布及其生物学特性 |
| 4. Fas 系统在肿瘤细胞中的表达及其在肿瘤细胞发生发展中的影响 |
| 4.1 Fas 和FasL 对肿瘤免疫逃避和发生、发展中的影响 |
| 4.2 可溶性Fas(sFas)对肿瘤免疫逃避和发生、发展中的影响 |
| 5. Fas 系统在肿瘤诊断、治疗方面的研究进展及意义 |
| 5.1 Fas 系统在肿瘤诊断方面的研究进展及意义 |
| 5.2 Fas 系统在肿瘤治疗方面的研究进展及意义 |
| 第二节 乳腺癌的浸润转移与细胞外基质及血管生成因子(VEGF)的相关性 |
| 1. 细胞外基质与恶性肿瘤的浸润转移 |
| 2. 基质金属蛋白酶在乳腺癌浸润转移中的作用 |
| 2.1 MMPs 及其成员 |
| 2.2 MMPs 的生成与调控 |
| 2.3 MMPs 的活化与组织抑制剂(TIMPs) |
| 2.4 MMPs 在乳腺癌中的表达及相关性 |
| 3. 血管内皮生长因子(VEGF)对肿瘤浸润转移的影响 |
| 3.1 VEGF 的理化特性及生物学功能 |
| 3.2 VEGF 在正常乳腺组织及乳腺癌中的表达 |
| 3.3 乳腺癌中基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的相关性 |
| 第三节 肿瘤侵袭转移发展和乳腺癌分泌型转移标志物的研究进展 |
| 1. 肿瘤侵袭转移的发展历程 |
| 1.1 肿瘤转移发生机制学说 |
| 1.2 肿瘤细胞侵袭实验研究 |
| 1.2.1 体外肿瘤细胞侵袭研究进展 |
| 1.2.2 体内肿瘤细胞侵袭研究进展 |
| 1.3 肿瘤细胞转移实验研究进展 |
| 2. 乳腺癌转移复发肿瘤标志物研究进展 |
| 第四节 立题依据、研究思路和目标 |
| 1. 立题依据 |
| 2. 研究思路和目标 |
| 第二章 Fas/FasL 在乳腺疾病发生发展过程中作用的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 可溶性Fas(sFas)对乳腺癌发生发展中的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四章 基质金属蛋白酶和sFas 在乳腺癌转移中相关性分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第五章 sFas、VEGF、TIMP-1 在乳腺癌淋巴结转移中表达的相互关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表论文及其它成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
（10）人肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸机制及其反义寡核苷酸、细胞因子的逆转作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分：人肝癌细胞株HepG2.2.15的Fas／FasL功能与免疫逃逸机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分：肝癌组织Fas启动区-670位点基因多态性分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分：FasL、Fas反义寡核苷酸转导对肝癌细胞诱导T细胞凋亡的抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分：细胞因子INF-α对肝癌细胞Fas表达及凋亡的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、干扰素对肿瘤细胞Fas表达的上调作用及与细胞凋亡的关系（论文参考文献）
- [1]IL-6ST在结直肠癌中的表达及对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移影响的研究[D]. 岳原亦. 中国医科大学, 2020(01)
- [2]放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究[D]. 成佳楠. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]香菇多糖对人HT-29结肠癌的非免疫途径抗肿瘤作用及机制研究[D]. 王静林. 华中科技大学, 2019(03)
- [4]组蛋白去乙酰化酶在特发性间质性肺炎发病机制中的初步探索[D]. 李珊. 北京协和医学院, 2019(02)
- [5]细胞因子LIGHT和IFN-γ联合转染HepG2细胞及对其凋亡影响的实验研究[D]. 王正华. 青岛大学, 2008(07)
- [6]重组hIFN-α-2b-BCG菌苗对膀胱肿瘤免疫治疗的实验研究[D]. 范晓东. 天津医科大学, 2007(06)
- [7]人参总皂苷和小檗碱对肿瘤主动性免疫逃逸机制的影响[D]. 王萍. 北京中医药大学, 2007(02)
- [8]细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究[D]. 徐彤. 天津医科大学, 2006(09)
- [9]Fas/FasL系统在乳腺疾病中的作用以及sFas作为乳腺癌转移标志物的研究[D]. 王心明. 吉林大学, 2006(10)
- [10]人肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸机制及其反义寡核苷酸、细胞因子的逆转作用[D]. 张娇. 山东大学, 2006(12)