一、哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定（论文文献综述）
朱涵雪[1]（2020）在《闭合蛋白Claudin-2在家蚕质型多角体病毒感染细胞中的作用》文中进行了进一步梳理闭合蛋白Claudins、咬合蛋白occlaudins以及连接黏附分子（junction adhesion molecule,JAM）等蛋白组成了细胞的紧密连接结构,广泛存在于上皮细胞上,此结构是细胞之间的连接方式。其中Claudin-2蛋白是Claudins蛋白家族中重要的一员,它的结构包括四个跨膜结构域以及两个胞外大小不一的环状结构。相邻细胞间的环状结构可以互相结合形成细胞间开放性或封闭性通道,同时可与其他紧密连接成分组成复合体维持细胞的紧密连接以及形成细胞旁通道的功能。研究表明Claudin-2与肿瘤细胞的转移与增殖、炎症的发生、病毒细菌的侵染有关。已有的研究表明一些病毒感染会改变了 Claudin-2的表达,从而破坏了细胞紧密连接结构,进而影响病毒对细胞的侵染,而目前有关Claudin-2的研究主要集中在哺乳动物病毒的细胞感染方面。家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosisvirus,BmCPV）主要特异性地侵染家蚕中肠上皮细胞,引起家蚕中肠型脓病。已有研究表明紧密连接蛋白Zo-1（Zonula occludens-1）参与BmCPV的细胞感染,为了进一步探讨细胞的紧密连接结构在BmCPV感染细胞中的作用,本研究以家蚕 Claudin-2（家蚕跨膜蛋白 47,Bombyx mori transmembrane protein 47,LOC101736066）为对象,探讨其在BmCPV感染细胞中功能,期望在探明家蚕Claudin-2蛋白功能的基础上,进一步丰富对BmCPV入侵细胞机制的理解,为家蚕中肠型脓病的防治提供了新的分子治疗靶点。Claudin-2 的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为 615 bp,编码 204 个氨基酸残基,它具有Claudins家族蛋白的典型的4个跨膜结构域。Claudin-2在家蚕不同组织的表达水平存在明显差异,以气管丛中的相对表达丰度最高,次之为卵巢,接着为中肠、头、表皮、丝腺,在脂肪体、马氏管、精巢中相对表达丰度最低;Claudin-2在中肠组织中的表达水平因发育时期不同而不同,说明BmCPV对于家蚕中肠组织的特异性侵染与Claudin-2的表达无关联;细胞免疫荧光结果显示,在BmCPV感染细胞过程中Claudin-2与BmCPV存在互作;Co-IP和酵母双杂结果显示,Claudin-2可与BmCPV的VP7蛋白存在互作,但没有检测到Claudin-2与病毒蛋白VP3的互作,推测Claudin-2可能通过与BmCPV VP7的互作参与细胞侵染过程。连接黏附因子A(（junction aladhesion molecule-A,JAM-A）是哺乳动物呼肠孤病毒侵染细胞的受体,在侵染过程中病毒蛋白δ1与JAM-1蛋白结合,由Integrinβ1通过网格蛋白介导的内吞途径内化进入细胞;呼肠孤病毒可以与Claudin-2互作,通过冗余途径侵染细胞,那么为了明确家蚕中Claudin-2在BmCPV感染中的功能,研究了调节Claudin-2水平、抗体封闭Claudin-2对BmCPV感染细胞的影响,结果显示增加细胞Claudin-2的表达水平可以增加细胞对BmCPV的感染性,反之通过RNAi敲降Claudin-2的表达,细胞对BmCPV的感染性随之下降;同样用抗体封闭Claudin-2后,细胞对BmCPV的感染性呈现下降。这些结果表明Claudin-2对BmCPV感染细胞有促进作用,BmCPV侵染细胞可能也存在冗余途径。
张丽萌[2]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中指出FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
王曼[3]（2019）在《H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究》文中认为原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）作为精子和卵子的祖细胞,对物种的延续和繁衍具有重要作用,并且PGCs为发育生物学研究、移植治疗、转基因动物生产等方面提供了巨大的便利。然而,如何迅速有效地获取大量PGCs来满足研究和生产实际的需要,是突显在人们面前的问题。为此,研究者们致力于体外诱导分化为PGCs的研究,试图使得PGCs能源源不断地通过体外分化产生,但由于PGCs诱导分化效率低,诱导细胞技术体系不成熟,难以获得大量PGCs,其关键在于不完全清楚哪些因素能影响PGCs的形成,所以亟需建立健全PGCs发生的具体机制。长期以来,人们对PGCs形成的具体调控机制的研究主要局限于遗传学因素包括信号通路和关键基因的研究上,然而随着理论发展和技术手段的不断深入,研究人员更加清晰地认识到生殖干细胞发育过程是一个极其精密而复杂的调控过程,除了遗传学因素,研究者们还发现PGCs的形成离不开细胞特异性的组蛋白甲基化修饰。所以,从表观遗传修饰的角度探索组蛋白甲基化如何联系遗传学参与PGCs命运决定过程,将有助于人们更加全面地揭示PGCs的发生。为此,本研究基于本课题组前期对鸡胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）、PGCs和精原干细胞（Spermatogonial stem cel1s,SSCs）三种细胞进行的全基因组RNA-seq和H3K4me2的ChIP-seq结果,以调控PGCs形成的关键信号通路和组蛋白H3K4me2修饰为切入点,对RNA-seq筛选的候选信号通路和ChIP-seq富集的关键信号通路进行联合分析,从中筛选出参与PGCs形成的关键信号通路—Wnt信号。利用分子生物学方法探索组蛋白甲基化修饰如何协同信号通路调节PGCs形成相关基因表达进而影响PGCs形成。该研究为弄清PGCs形成的机制提供理论依据,并为后续深入研究其表观遗传调控机制奠定基础。研究结果如下:（1）H3K4me2 通过 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2 信号链调控 PGCs 形成的研究对 ESCs、PGCs和SSCs三种细胞的RNA-seq和ChIP-seq结果进行联合分析,确认PGCs发生过程中受H3K4me2调控的关键信号通路—Wnt信号通路及其关键信号分子Wnt5A、β-Catenin和TCF7L2。通过体内外实验在RNA水平和蛋白水平上验证PGCs形成过程中Wnt5a介导Wnt5a/β-Catenin/Tcf712信号链的激活,并成功构建了 Myc标记的Tcf712融合表达载体,通过免疫共沉淀实验验证了鸡β-Catenin和TCF7L2蛋白之间的互作关系,从而确定了鸡PGCs形成过程中Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链的存在,为后续探究具体调控PGCs形成的机制做铺垫。通过ChIP-qPCR在ESCs和PGCs两种细胞中验证了 H3K4me2在Wnt5A启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.072±0.513 和 17.3±1.924；P2:2.40±0.094 和 9.97±0.625）、在β-Catenin 启动子区存在 4 个富集位点（P1:7.41±0.413 和 12.23±1.952;P2:2.23±0.155 和11.54±1.602;P3:4.19±0.516 和 7.75±0.619;P4:5.61±0.641 和 9.68±0.547）、在 TCF7L2 启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.02±0.032 和 15.8±1.63;P2:5.9±0.413 和 8.59±0.31）,且 H3K4me2修饰在PGCs上的富集水平显着高于ESCs（P<00.5）,进一步研究发现LSD1和MLL2能够介导Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区发生差异性H3K4me2富集。以上结果在RNA水平和蛋白水平上验证了 H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导,为深入探究组蛋白如何介导信号通路参与PGCs的调控研究奠定基础。（2）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28A/B促进PGCs形成通过生物信息学分析对Wnt信号下游TCF7L2转录因子的靶基因进行预测,并根据GO功能注释筛选其中参与生殖细胞发育及干细胞分化的高度保守的靶基因Lin28A和Lin28B;体内外实验证实Wnt5A/β-Catenin信号和组蛋白H3K4me2能够正向促进Lin28A和Lin28B的转录。成功构建了重组表达载体pEGFP-Lin28A/B,以此确定长片段具有启动活性;同时成功构建缺失载体PGL3-Lin28A/B,并确定Lin28A启动子核心调控区域为-584+100bp和Lin28B启动子核心区域为-1431bp-1034bp;进一步分析发现,Lin28A/B核心启动子核心区存在TCF7L2结合位点,将结合位点突变发现Lin28A/B启动子核心区域的活性几乎完全丧失。接下来,通过双荧光素报告基因检测系统证实Lin28A和Lin28B核心启动子区能够响应Wnt信号;通过ChIP-qPCR在PGCs中验证了 β-Catenin在Lin28A启动子区存在2个富集位点（P1:26.52±2.14;P2:8.32土 1.20）,在 Lin28B 启动子区存在 3 个富集位点（P1:9.33土0.88；P2:4.90±0.53;P3:1.20土0.23）,且β-Catenin水平变化能够差异性富集Lin28A/B启动子区,以上实验确定Lin28A/B是Wnt信号的直接靶基因。成功构建Lin28A/B过表达载体和干扰载体,并通过体内外实验探究Lin28A/B对PGCs形成的影响,结果发现:在过表达组诱导第4d出现类胚体,第6d类胚体数量变多,并且同时过表达Lin28A和Lin28B诱导第2天便开始出现较大的EB,第4d类胚体数量变大变多,第6d类胚体出现大量的细胞分裂,与 0d（1±0）相比,第 6d PGCs 标记基因 Cvh、C-kit 和 Blimp1 显着上升至 1.61±0.07、2.21±0.07和3.08±0.09（P<0.05）,干扰组在同样的条件下则不能。体内对经Lin28A/B不同处理孵化至4.5d的鸡胚生殖嵴进行qRT-PCR检测发现相同的结果。流式细胞分析发现相较BMP4和BMP4+NC（3.31%±0.37和4.21%±0.21）组,体外同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH阳性率（5.86%±0.35）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（1.91%±0.02）极显着下调（P<0.01）;体内流式细胞分析结果出现类似表达趋势:与Blank和NC（54.7%±3.12和52.6%±2.18）组相比,同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH 阳性率（66.7%±4.31）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（37.1%±1.97）极显着下调（P<0.01）。以上结果表明Lin28是受H3K4me2和Wnt信号调控的直接靶基因,且Lin28能正向调控PGCs的形成。（3）β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录通过ChIP-qPCR验证H3K4me2在Lin28A核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:14.96±1.41;P2:11.74±1.41）,在Lin28B核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:3.08±0.041;P2:6.39±0.522）,且 MLL2 和 LSD1 能够介导 Lin28A/B 启动子区 H3K4me2的差异富集;双荧光素报告基因检测发现H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应,而H3K4me2去甲基化则降低Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应。成功构建LSD1-flag融合表达载体,并将LSD 1分别与TCF7L2和β-Catenin进行共转染DF1细胞,COIP验证发现LSD1能够与TCF7L2蛋白结合而不是β-Catenin蛋白,进一步将LSD1、TCF7L2和β-Catenin以不同组合形式转染DF1细胞,COIP检测发现β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2。以上实验结果表明β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录,解除LSD1对靶基因Lin28启动子区的H3K4me2去甲基化作用,激活Lin28表达。（4）Lin28A/B通过抑制gga-let7a-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录在线软件预测筛选了 micRNA-let7 家族 17 个鸡的 micRNA-let7s 成熟体（gga-let7s）,在 ESCs、PGCs和DF1三种细胞中进行同时干扰或过表达Lin28A/B处理,通过qRT-PCR筛选处关键候选的micRNA,即gga-let-7a-2-3p。进一步预测发现gga-let7a-3p共有558个靶基因,根据Target Score由高到低对靶基因进行筛选,发现调控PGCs形成的关键标记基因Blimp1。对Blimpl 3’UTR区域的gga-let7a-3p三个结合位点进行全部缺失,成功构建了 Blimp1 3’UTR野生型和突变型载体,即Blimp1-3’UTR-WT和Blimp1-3’UTR-Mut;通过双荧光素酶报告基因检测验证gga-let-7a能够结合到Blimp1的3’UTR区域抑制其表达。以上结果表明Lin28A/B可能通过抑制gga-let7a-3p促进Blimp1的转录进而调控PGCs形成。
陶华[4]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中研究指明背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
王中亮[5]（2019）在《鸡VNN1基因在肝脏脂代谢中的功能及其调控机制的研究》文中认为Vanin-1（VNN1）是一种泛酰巯基乙胺酶,它能催化泛酰巯基乙胺水解产生泛酸（维生素B5）和巯基乙胺（高效抗氧化剂）。在哺乳动物中的研究表明,VNN1基因在糖脂代谢、免疫、肿瘤形成等生命过程中发挥十分重要的作用。本课题组前期研究发现,该基因在鸡肝脏中特异性表达,且受到肝脏脂质代谢关键调控因子microRNA-122的负性调控。然而迄今为止,对鸡VNN1基因的研究报道较少,因此有必要对鸡VNN1基因的表达调控及其在肝脏脂类代谢中的功能进行深入研究。本研究以鸡的VNN1基因为研究对象,旨在弄清鸡VNN1的表达调控的具体机制以及在肝脏脂类代谢过程中发挥的作用。首先,本研究利用CRISPR/Cas9基因敲除技术对鸡肝细胞LMH中的VNN1基因进行敲除,用转录组测序分析由于VNN1基因的缺失而导致的脂质代谢相关基因的差异表达,从而探究VNN1基因在鸡肝脏脂质代谢中的功能。其次,利用生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、定点突变技术以及转录因子PPARα和HNF4α功能获得和缺失实验来论证VNN1基因的转录调控机制。最后,通过研究VNN1基因3’-UTR区与microRNA的配对情况,筛选能与VNN1基因配对的microRNA,并用双荧光素酶报告基因进行验证以研究VNN1基因的转录后调控机制。本文将从以下五个部分进行阐述:（1）为了探究CRISPR/Cas9系统在鸡源肝细胞的应用,本研究以LMH为靶向细胞,将构建的pX330-VNN1-sgRNA1/2/3三个敲除质粒转染至LMH细胞,经嘌呤霉素初步筛选后提取细胞基因组DNA,利用T7E1酶酶切和TA克隆检测靶向敲除效率。结果表明,CRISPR/sgRNA3系统可有效地实现鸡LMH细胞中VNN1基因的靶向突变,TA克隆初步测定其敲除效率可达38.7%。接下来,本研究对pX330-VNN1-sgRNA3转染的LMH细胞进行多轮嘌呤霉素筛选富集,提取富集的细胞RNA进行荧光定量PCR分析。结果显示,与野生型LMH细胞相比,LMH-VNN1-/-细胞中VNN1 mRNA的表达水平下降了约80%（P<0.0001）。上述结果表明,本实验已成功建立一种可有效实现鸡LMH细胞中基因靶向修饰的CRISPR/Cas9系统。（2）为了研究VNN1在鸡脂代谢中的具体功能,本研究将LMH细胞中VNN1基因靶向敲除后利用Illumina HiSeq测序平台进行双末端测序。测序结果表明,由于VNN1基因的缺陷导致了 1335个基因发生差异性表达,其中有431个基因发生了上调,904个基因发生了下调。对差异基因GO富集分析表明,相关脂质代谢途径如调节脂肪酸生物合成与脂肪酸代谢过程,长链脂肪酸生物合成过程等被富集;KEGG代谢通路富集分析也表明泛酸和CoA生物合成;甘油脂代谢;不饱和脂肪酸的生物合成;脂肪酸生物合成等途径被富集。对上述富集途径的脂质代谢相关DEGs进行筛选,发现总共有76个基因发生了显着性的差异变化,其中上调基因有29个,下调基因有47个,这表明VNN1在协调鸡肝脂代谢过程中起着重要作用。（3）本研究首先采用鸡饥饿-补饲模型探讨营养状态改变的情况下鸡VNN1基因和相关糖脂代谢基因的表达。结果表明,VNN1基因同FASN/ATGL/ACOX1等基因一样受到营养状态的调控,且转录因子PPARα和VNN1基因的表达具有强的一致性;利用PPARα激动剂GW7647和PPARα干扰siRNA处理肝细胞,显示PPARα对VNN1基因的表达具有正向调控作用;之后的生物信息学分析,荧光素酶报告基因分析和位点突变分析揭示了 PPARα可通过与VNN1基因启动子-49/-31区域的PPARα结合位点结合上调VNN1的转录活性。本部分初步表明了鸡VNN1基因受到转录因子PPARα的正调控,为进一步研究PPARα-VNN1轴对鸡肝脏脂代谢的具体机制提供了理论基础。（4）本研究根据大肠杆菌密码子偏好性,对HNF4α基因密码子进行优化进而成功构建了HNF4α的原核表达载体pET-30a（+）-HNF4α。经IPTG诱导重组蛋白表达,利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析进行纯化,得到了纯度较高的HNF4α蛋白。利用纯化后的HNF4α蛋白作免疫原成功制备了高效价且特异性较好的兔抗鸡HNF4α多克隆抗体,且该抗体可以对HNF4α过表达和干扰的蛋白水平进行较好地表征。HNF4α的功能的获得和缺失显着影响VNN1基因的表达,这一结果表明HNF4α对VNN1基因的表达起着重要作用,这也为进一步了解鸡HNF4α-VNN1轴的功能提供了基础资料。（5）利用miRNA预测软件miRanda对靶向VNN1基因的microRNAs进行预测,在候选microRNAs中,选取分值>160和自由能<-15 kCal/Mol四个microRNAs进行体外细胞验证。通过上述的生物信息学和双荧光素酶试验表明,gga-miR-181a-5p可以靶向调控鸡VNN1基因。这也在一定程度表明,VNN1基因在调节鸡脂质代谢的过程中受到上游gga-miR-181a-5p的调控,丰富了鸡VNN1基因在转录后水平调控的具体机制。
李昊[6]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究说明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
刘欣超[7]（2018）在《刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究》文中提出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种严格的细胞内寄生虫,在弓形虫的生活史中,速殖子可引起中间宿主的急性感染,在这一感染性阶段,无性生殖是其主要的繁殖方式。若没有宿主免疫应答对虫体繁殖的抑制,弓形虫速殖子可以进行不断的繁殖。原癌基因是一些可以影响细胞生长和繁殖的正常细胞基因,一旦他们的表达发生改变,则会促进癌症的发生。那么弓形虫速殖子的不断繁殖与癌细胞的不可控生长有没有关联,目前暂无相关的报道。组蛋白是一种小分子的保守蛋白质,它占染色质总重量的50%,并可以通过修饰调节DNA中所含信息。因而目前弓形虫组蛋白的研究也主要集中于表观遗传学方向,而未见针对组蛋白其他功能研究的报道。在本研究中通过对弓形虫的基因组序列进行分析,分别选取弓形虫酪氨酸激酶样蛋白（Tyrosine kinase-like protein,TKL）,Ras 家族蛋白（Ras family protein,Ras）,Rab小 GTPase（Rab 18/RabC-family small GTPase,Rab18）,Rab43,真核起始因子（Eukaryotic Initiation Factor,eIF-5A）来研究原癌基因对弓形虫繁殖等功能的影响。运用CRISPR/Cas9技术对上述基因进行缺失后,无虫体存活,从而证明上述原癌基因是弓形虫速殖子生长所必须的基因。在后续试验中,我们对Rab18,Rab43和eIF-5A进行进一步功能研究。此外,我们还对弓形虫组蛋白H3和H4对小鼠巨噬细胞的功能影响进行了分析。本项研究对弓形虫速殖子繁殖机制的阐明具有重要意义,可以为虫体与宿主之间的相互作用研究提供参考。1刚地弓形虫原癌基因缺失株的构建本章研究中,通过定点突变试剂盒将弓形虫TKL,Ras,Rab18,Rab43,eIF-5A和对照基因钙依赖蛋白激酶3（Calcium-dependent protein kinase,CDPK3）的特异性sgRNA替换CRISPR/Cas9载体内的sgRNA,用多片段快速克隆试剂盒构建具有Pyrimethamine抗性片段DHFR的同源重组替换载体。经过PCR和酶切等方法鉴定,所有载体均得到大小正确的目的条带。并通过测序验证,证实载体构建成功。用电转染方法将CRISPR/Cas9载体和DHFR抗性同源替代载体共转染RH株弓形虫速殖子。经1μM Pyrimethamine药物筛选后,提取虫体基因组进行PCR验证,结果发现在CDPK3对照基因的的虫体基因组中获得目的大小一致的条带,且经测序验证,弓形虫CDPK3基因被成功替换。而其他原癌基因均无缺失虫体。独立实验进行五次,均无法获得基因缺失株。因而表明,弓形虫肿瘤原癌基因TKL,Ras,Rab18,Rab43和eIF-5A是虫体生长所必需的基因。2刚地弓形虫eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能及虫体繁殖的影响本章研究中,获得了刚地弓形虫eIF-5A（TgeIF-5A）的重组蛋白,通过重组蛋白与小鼠巨噬细胞的共孵育,分析其对巨噬细胞功能的影响。结果显示eIF-5A蛋白能够促进巨噬细胞的增殖,吞噬和凋亡,并能够促进巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）,白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。但对细胞趋化性和其表面的Toll样受体4（TLR4）表达水平起到抑制作用。我们又选择RNA干扰技术对eIF-5A的功能进行分析,噬斑实验和繁殖实验结果表明在体外条件下,eIF-5A能够调控弓形虫的繁殖过程。粘附实验和侵入实验进一步表明eIF-5A能够减少弓形虫对宿主细胞的粘附,降低侵入细胞的速度。最后通过小鼠毒力实验,表明虫体eIF-5A被干扰后,小鼠的存活时间被延长,弓形虫的毒力明显降低。综上所述,eIF-5A在体外条件下可以影响巨噬细胞的功能,并参与弓形虫侵入宿主细胞和繁殖过程。3刚地弓形虫eIF-5A对虫体蛋白组的影响本章实验的目的是鉴定刚地弓形虫eIF-5A基因所调控的基因的表达情况。将eIF-5A特异性siRNA电转染RH株弓形虫速殖子,孵育24小时后,收集虫体,提取虫体蛋白。用同重同位素相对与绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,ITRAQ）技术进行蛋白组分析。结果显示,一共有1391条肽段和581个蛋白被鉴定到。将鉴定到的581个蛋白进行表达量差异分析,eIF-5A干扰后,共有359个蛋白表达量发生改变,其中表达量下调的有223个,上调的有136个。通过对结果的分析发现,eIF-5A能够调控多种基因的表达,参与调控重要的信号通路过程。并且在表达量下调的蛋白中包括与弓形虫体侵入和毒力相关的微线体（Microneme）,棒状体（Rhoptry）和致密颗粒（Dense granule）,三个特殊的分泌细胞器分泌的多种蛋白。因而,可以进一步的解释前期实验结论,eIF-5A是弓形虫的必需基因,参与到虫体的侵入与繁殖过程。4刚地弓形虫Rab43对虫体繁殖能力的影响由于Rab43在弓形虫生长繁殖过程中是必需的。为了继续研究Rab43的功能,我们设计合成Rab43特异性小干扰RNA（siRNA）干扰虫体Rab43基因。结果发现,Rab43被干扰之后,弓形虫体对细胞的粘附性和侵入能力均明显下降。噬斑实验表明,Rab43被干扰后,噬斑形成变慢,虫体繁殖速度变慢。对纳虫泡内速殖子个数进行计数,结果发现Rab43干扰后的虫体形成的纳虫泡内含1个速殖子的个数明显高于对照组。最后通过小鼠毒力实验证实Rab43被干扰后,小鼠的存活时间明显延长。综上所述,Rab43是弓形虫的必需基因,在体内和体外条件下,均对弓形虫的繁殖起到重要的作用。5刚地弓形虫CDPK3对虫体繁殖能力的影响本章研究中,对前期试验中获得的CDPK3基因缺失株进行进一步验证。并用体内和体外的方法研究CDPK3对弓形虫体繁殖功能的影响。通过噬斑实验和对含1,2,4,8,16个速殖子的纳虫空泡进行统计,发现在体外条件下CDPK3基因缺失对弓形虫的繁殖作用影响不大。继而我们又通过小鼠体内实验分析CDPK3的作用,结果发现,CDPK3缺失后感染小鼠,能够延长小鼠的存活时间。粘附实验和侵入实验结果表明,CDPK3缺失后,虫体粘附和侵入宿主细胞的能力降低。综上所述,CDPK3缺失能够通过对粘附和侵入的影响,减缓弓形虫的繁殖。6刚地弓形虫Rab18的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用本章试验通过将重组弓形虫Rabl8（TgRab18）蛋白与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育,探究其对巨噬细胞功能的影响。采用免疫荧光技术验证rTgRab18在体外环境下与Ana-1细胞的结合情况。利用流式细胞仪检测rTgRab18对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgRab18可以与小鼠巨噬细胞发生结合,从而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达水平。另外实验结果表明,rTgRab 18可以显着促进巨噬细胞的凋亡与吞噬能力。rTgRab 18与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌TNF-α,IL-6和NO水平明显上调。以上结果显示,弓形虫组蛋白Rab18在体外条件下影响小鼠巨噬细胞的功能。7刚地弓形虫H3的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用通过构建弓形虫组蛋白3（H3）原核表达质粒pET-32a（+）-TgH3,经IPTG诱导和镍柱纯化获得rTgH3蛋白。对TgH3序列进行分析显示其高度保守。Western blotting结果显示抗TgH3多克隆抗体和人工感染的抗弓形虫血清能分别识别弓形虫全部可溶性抗原和rTgH3蛋白。免疫荧光实验结果显示TgH3可以结合到小鼠巨噬细胞表面。与rTgH3共孵育后,,巨噬细胞的TLR4表达水平降低。此外,巨噬细胞的趋化性和增殖作用被抑制。然而rTgH3能够增强巨噬细胞的吞噬能力,促进细胞的凋亡及细胞分泌NO、IL-6和TNF-α。综上所述,rTgH3在体外条件下能够调节小鼠巨噬细胞的功能。8刚地弓形虫H4的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用在本部分研究中,通过将重组弓形虫组蛋白H4（TgH4）与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育后,观察巨噬细胞免疫功能的改变。将重组TgH4与Ana-1细胞共孵育,用免疫荧光技术检测rTgH4与Ana-1细胞的结合情况。用流式细胞术检测rTgH4对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgH4能够与小鼠巨噬细胞结合,进而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达。但rTgH4对巨噬细胞的凋亡和吞噬作用起到明显的促进作用。rTgH4与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌细胞因子TNF-α,IL-6和NO的水平明显上调。上述结果显示,弓形虫组蛋白H4在体外条件下可以调节小鼠巨噬细胞的功能。
郁建锋[8]（2019）在《Sirt1基因对鸡肝脏中脂类代谢的调控及其机制研究》文中研究指明肝脏是动物营养物质和能量代谢的重要场所,负责糖原合成、糖异生、脂肪酸与胆固醇的合成以及脂蛋白的生成和分泌等,并能对营养状态和激素信号作出响应,调节机体内的物质与能量平衡,尤其在糖脂类代谢方面发挥着重要的作用。当机体摄入过多的能量物质时,肝脏能将这些过量的能量物质转化为脂肪,并转运到脂肪组织贮存起来。长期摄入过多的能量最终会导致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相关的代谢性疾病。在家禽生产中,脂肪沉积过多不仅影响动物的健康,还会引起饲料利用率和产蛋率下降等问题。沉积的脂肪除来自饲料中的少量脂肪外,主要来自肝脏重新合成的脂肪。因此,研究肝脏的脂肪代谢及其调控机制对于控制家禽的脂肪沉积极为重要。SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶,通过去乙酰化调节组蛋白和非组蛋白的活性,从而影响基因的表达,在众多的生物学过程中扮演重要角色。相对于哺乳动物,禽类肝脏中的糖脂代谢存在一些独特性。SIRT1在家禽肝脏中对糖脂代谢的调节作用及相关机制至今尚不十分清楚。本研究以广西三黄鸡为研究对象,探究营养状态对鸡肝脏中Sirt1及其他代谢相关基因表达的影响;分析Sirt1的表达变化对鸡原代肝细胞中脂代谢的影响;高糖、高脂对Sirt1基因表达和肝脏细胞代谢的影响以及Sirt1基因在肝脏内转录调控机制等方面进行研究,希望通过以上工作,揭示Sirt1基因在鸡肝脏糖脂代谢特别是脂类代谢中的重要作用和机制,从而为控制肉鸡体脂过多沉积提供有用的信息。主要研究方法和结果如下:（1）鸡Sirt1基因的时空表达规律利用荧光定量对4周龄鸡不同组织和鸡不同生长期肝脏中Sirt1基因的mRNA表达水平进行检测,以揭示Sirt1基因的时空表达规律。结果显示,Srt1基因在大多数的组织中表达,在肾脏中的表达相对较高,而不同生长期的肝脏中Sirt1的表达水平基本不变。（2）饥饿对鸡肝脏中Sirt1和相关基因表达的影响本研究通过饥饿试验阐述营养状况对鸡肝脏中Srt1基因和相关基因表达的影响,数据显示,相对于非禁食的正常饲喂组,鸡在禁食24h后的血糖有一定程度的下降（p<0.01）,而血脂的浓度则显着地降低（p<0.01）,胆固醇无明显变化。禁食组肝内Sirt1的mRNA较对照组表达量增加1.27倍（p<0.01）,蛋白水平也明显增加;Pgc-1a、Ppara、Foxo1、Hnf1a、Vnn1、Mt3、和Atgl等基因的mRNA相对表达水平分别增加了 7倍（p<0.01）,1.46倍（p<0.01）、0.5 倍（p<0.01）、0.36 倍（p<0.01）、0.5 倍（p<0.01）、25.8 倍（p<0.01）和 2.26倍（p<0.01）,而Fasn基因则下降至对照组（正常饲喂组）的1/13左右（p<0.01）;与禁食组相比,短时间（2 h）重喂饲导致血糖略有上升（p<0.01）,血脂则明显上升（p<0.01）,但仍低于正常喂饲组,而肝中Sirt1基因的mRNA水平则迅速减少（p<0.01）,甚至低于正常喂饲组,Pgc-1a、Ppara、Foxo1、Hnfla、Vnn1、Mf3、和Atgl等基因的 mRNA 水平也迅速降至正常喂饲组的水平,Fasn回升至对照组的1/4（p<0.01）。以上结果说明肝脏中Sirt1基因和其他与能量代谢、脂肪代谢相关的基因能够对鸡的营养状态作出迅速而有效的响应,这些基因可能在能量和脂肪代谢中发挥重要作用。（3）鸡肝脏中受Sirt1调控的基因和信号通路为进一步阐述鸡肝脏中Sirt1基因在能量和物质代谢中的作用,本研究利用siRNA干扰鸡原代肝脏细胞中Sirt1基因的表达,并通过RNA-seq分析Sirt1基因表达减少后对细胞转录组的影响。结果显示,Sirt1表达减少导致86个基因产生差异性表达,其中63个基因表达减少,23个基因表达增加。GO分析显示,70个差异表达基因与生物过程有关,58个差异表达基因与细胞组成相关,77个差异表达基因与分子功能相关。KEGG通路分析结果显示,差异表达基因分别涉及代谢、遗传复制表达、细胞功能、外界信号转导和疾病等通路,其中Adh6、H6pd、Hexab和Glms与碳水化合物代谢有关,Adh6、Acsl4、Lipa、Gnpat与脂类代谢有关。此外,Vnn1、Mt3（表达减少）和Frzb（表达增加）的表达受到Sirt1干扰的影响,这3个基因分别与肝脏的糖脂类代谢和肝细胞的发育有关。在随后的LMH细胞中Sirt1的瞬时过表达试验也部分证实了 Sirt1基因对Lipa、Frzb、Adh6、Acsl4、Vnn1和Mt3的表达调控。这些结果说明Sirt1基因通过调控多个信号通路影响肝脏的代谢和功能。（4）Sirt1基因低表达LMH细胞系的建立为进一步阐述Sirt1基因在鸡肝脏应答糖脂代谢时的作用,本研究依据鸡Sirt1基因的3UTR序列设计针对不同位点的3个miRNAs,构建了能稳定过表达miRNA且干扰效果好的LMH细胞系,该细胞系中Sirt1基因的低表达持续且稳定。数据表明,3个的miRNAs均能高效地抑制含有对应靶位点Sirt1基因3’UTR序列报告载体荧光素酶的活性,在LMH细胞瞬时过表达这3个miRNAs 48 h后,Sirt1的mRNA水平分别被抑制了 30%左右,说明这3个miRNAs能从mRNA水平干扰Sirt1基因的表达。以gSmiR30包装的病毒颗粒成功感染了 LMH细胞,通过G418抗性筛选,细胞内的GFP表达率达99%以上,Sirt1基因mRNA水平的抑制率达到75%左右,蛋白质表达水平也明显下降,这些数据表明Sirt1基因稳定低表达的细胞系已成功构建,该细胞系被命名为LMH-gSmiR30细胞系。（5）高糖、高脂通过Sirt1调控糖脂代谢关键基因的表达为探究Sir1基因在肝细胞糖脂应答反应中的作用,本研究用高糖、高脂处理构建的LMH-gSmiR30细胞和LMH-pmirG（对照组细胞）,并检测细胞中脂滴积累情况及相关基因的表达量。结果显示,在LMH-gSmiR30细胞中Sirt1的mRNA表达水平不随葡萄糖的浓度增加而变化,Sirt1基因的低表达改变了H6pd、G6pc和Vnn1基因在LMH细胞中的表达,影响了 LMH细胞对葡萄糖应答反应。在LMH-pmirG和LMH-gSmiR30细胞中,高糖高脂抑制了Sirt1、H6pd、Fasn、Ppara基因的mRNA水平,但两种细胞之间的变化差异不明显,而G6pc、Atgl在LMH-gSmiR30细胞中的表达要明显低于LMH-pmirG中的表达,说明Sirt1基因表达的低表达降低了 LMH细胞中G6pc、Agl对高糖高脂的应答,抑制了糖酵解和脂肪的降解,促使细胞内的脂肪滴的形成,这一推测得到了油红染色结果的验证。（6）鸡Sirt1基因的启动子结构与功能研究为分析鸡Sirt1基因在肝脏内转录水平的调控机制,本研究通过5’RACE技术扩增获得14 bp长的5’UTR序列,通过生物信息学分析预测该基因的启动子结构和功能片段,并利用序列删除技术证实了影响转录活性的关键区域位于起始密码子上游106-129 bp之间,可能是TATA box元件所在区域,研究还发现,129～165 bp之间存在对Sirt1基因转录具有促进作用的元件。（7）甲基化对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的影响为研究甲基化对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的影响,本研究利用Methyl Primer Express V1.0预测到Sirt1基因的第一个外显子和5’UTR及其上游序列中存在一个约1600 bp长的“CpG”岛（包含Sirt1基因的第一个外显子和上游1200bp左右的序列）。LMH细胞经5-氮杂胞嘧啶核苷处理6天后,检测发现Sirt1基因mRNA水平在LMH细胞中得到了显着提高,1.0μmol/L的5-AZA处理后提高60%以上（p<0.01）,这些说明甲基化抑制了鸡Sit1基因在肝脏细胞中的表达。（8）鸡肝细胞中miRNAs对Srt1基因表达的调控为探讨miRNAs对鸡肝细胞中Sirt1基因表达的调控,本研究通过3’RACE技术扩增获得Sirt1基因1710 bp长的3’UTR序列,利用miRanda和TargetScan软件进行分析,发现136个miRNAs对Sirt1的表达具有潜在的调节作用。根据miRNA和靶位点作用的评分高低和自由能高低,挑选了 12个miRNAs评分较好的miRNAs进一步验证。结果显示,gga-miR-204和gga-miR-302b-3p能有效地抑制含靶位点的荧光素酶活性,而靶位点突变会使抑制效果消失,说明Srt1可能是gga-miR-204和gga-miR-302b-3p的靶基因。由于在肝脏中并未检测到gga-miR-302b-3p的表达,本研究在LMH细胞和鸡原代肝细胞中进一步验证了gga-miR-204对Sirt1基因表达的影响。数据显示,gga-miR-204抑制了 LMH细胞和鸡原代肝细胞中Sirt1基因mRNA的表达水平以及LMH细胞中SIRT1蛋白表达水平,这证实了在肝细胞中Sirt1基因的表达受gga-miR-204调控。
王琳[9]（2018）在《J亚群禽白血病病毒与宿主细胞相互作用机制研究》文中研究指明J亚群禽白血病毒（Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J）属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,其感染后能够在易感宿主体内引发禽白血病,造成髓细胞瘤、血管瘤、平滑肌瘤等症状。该病与禽马立克氏病、禽网状内皮增生病一样,既属于禽致肿瘤性疾病也属于禽免疫抑制性疾病,给养禽业带来巨大经济损失。对ALV-J致病机制的研究是防制该病的重要部分。病毒是如何入侵宿主细胞?如何突破宿主的天然免疫屏障?相关研究报道较少。本研究将围绕病毒的进入和与宿主的相互作用开展研究,旨在深入研究禽类免疫抑制机理,寻找潜在药物靶点,进一步丰富禽类反转录病毒研究的分子生物学信息资料,为后续的研究工作奠定基础。1、膜蛋白GRP78参与ALV-J入侵宿主细胞本实验室于2015年成功发现一个ALV-J的新型受体chANXA2,于此同时,也发现了另一个能够与ALV-J囊膜蛋白结合的宿主蛋白chGRP78。GRP78蛋白作为热休克蛋白家族成员被人们所熟知,且已经被报道在多种病毒复制中起到了关键作用。前期试验数据显示,用针对chGRP78的多克隆抗体封闭DF1细胞膜表面的chGRP78能够有效抑制ALV-J的复制。为进一步探究chGRP78功能,本研究应用siRNA干扰技术,通过对DF1细胞转染针对chGRP78蛋白的siRNA,成功将DF1细胞中chGRP78的基因表达水平抑制了 65%。在此基础上,进行ALV-J感染,TCID50和Western-blot结果显示,在降低宿主细胞chGRP78蛋白的表达后,ALV-J的感染显着抑制。进一步研究发现,在ALV-J非易感细胞293T中转染不同浓度chGRP78真核表达质粒（0.5μg、1.5μg、3.0μg和4.5μg）,结果显示,随着转染chGRP78浓度的不断增高,ALV-J入侵293T细胞的能力逐渐增强,成明显的正相关。为进一步证明该结果的正确性,本研究选择另一 ALV-J非易感的禽类细胞——鹅胚成纤维细胞（Goose embryo fibroblast,GEF）,结果显示,在GEF中转染chGRP78后,能够成功将非易感细胞转变为易感细胞。综上所述,chGRP78蛋白在ALV-J感染DF1细胞中发挥了重要的作用,该蛋白能够帮助ALV-J进入宿主细胞。2、Toll样受体在ALV-J感染中的作用除chGRP78外,本研究特别对先天性免疫相关受体在ALV-J感染过程中发挥的作用进行了探究。在ALV-J感染CEF细胞前16h、感染同时、感染后第12h、24h、48h和72h分别用6种禽类Toll样受体（TLR2-5、TLR7和TLR21）对应的配体刺激宿主细胞。同时用Real-time PCR、IFA、Westem-blot和上清中ALV-J病毒滴度进行检测,以了解CEF细胞中ALV-J复制情况。结果显示TLR2、TLR3和TLR4相对应配体不管在ALV-J感染前还是感染后对CEF进行刺激,均能够抑制ALV-J在CEF中的复制;TLR7和TLR21配体在ALV-J感染前及感染后24h内刺激能抑制ALV-J的复制;而TLR5配体在ALV-J感染前刺激并未影响ALV-J的复制,但在ALV-J感染同时加入TLR5配体对ALV-J复制有一定影响。综上所述,CEF细胞的Toll样受体被激活后,均能抑制ALV-J病毒的复制,只是刺激时间不同有所差别。这提示,从宿主细胞的角度来看,天然免疫的激活能够抑制ALV-J的感染。而从病毒的角度来看,其在细胞中成功建立感染的过程,很可能抑制了上述某些受体信号通路。3、ALV-J感染宿主细胞CEF激活了非MyD88依赖途径为弄清ALV-J通过抑制哪条TLR介导的先天免疫通路以建立感染。本研究首先用PEG-it试剂浓缩ALV-J病毒（以排除收集的病毒上清中存在某些细胞因子对试验产生影响）,ALV-J 感染宿主细胞 CEF 后,通过 Real-time PCR 方法检测TLR2、TLR TLR4、TLR7和TLR21在ALV-J感染后不同时间点被激活的情况。结果显示,ALV-J在感染宿主细胞CEF时,于感染后第72h和96h激活TLR3通路（MyD88非依赖途径）,而其余Toll样受体（均为MyD88依赖途径）的基因水平表达并未出现明显变化。为进一步检验ALV-J感染CEF激活非MyD88途径这一现象,本研究用Real-timePCR方法检测MDA5（RIG-I通路,MyD88非依赖途径）的表达情况,结果观察到ALV-J感染CEF同样能激活MDA5的上调。这一结果证明,ALV-J在感染宿主细胞CEF时主要激活MyD88非依赖途径。同时Real-time PCR试验结果显示,ALV-J在感染CEF过程中能够激活TLR3通路,同时也能够引起IRF3/7的上调。IRF3/7作为转录因子处于TLR3通路的下游,说明ALV-J并未对该通路的中间环节造成抑制,然而我们发现ALV-J感染细胞后即使1IRF3/7基因高水平表达,但并不引起TLR3信号通路下游IFN-β 和IFN-α上调,也并未抑制ALV-J的复制。提示虽然宿主细胞天然免疫机制能够识别ALV-J,但ALV-J的复制很可能通过破坏或阻碍信号通路中的某个环节（如IRF3/7功能的干扰）而发挥抗天然免疫功能。4、鸡IRF3/7在抗ALV-J天然免疫中的作用IRF3/7是介导细胞表达I型干扰素最关键的转录因子,其转录活性与生物学功能直接影响细胞的抗病毒的能力,而目前市面上并无鸡IRF3/7抗体的销售,给禽类天然免疫学的研究带来巨大瓶颈,故本研究成功构建原核表达质粒pCold-TF-chIRF3/7,将原核表达蛋白作为免疫原免疫5周龄Balb/c雄性小鼠,每隔10天免疫一次,共免疫4次,通过IFA和Westem-blot鉴定,成功制备了鸡IRF3/7的多克隆抗体,为禽类天然免疫研究突破瓶颈,奠定基础。同时,本研究成功构建pcDNA3.1-chIRF3/7真核表达质粒,ALV-J感染已过表达chIRF3/7的DF1细胞,用Real-time PCR检测ALV-J基因水平复制情况,结果显示,chIRF3/7的过量表达可以有效抑制ALV-J的复制,且Western-blot结果、和TCID50结果均与Real-time PCR结果一致。同时chIRF3/7的过量表达也能够明显上调IFN-β 的上调。这一结果提示,ALV-J在感染宿主细胞的过程中有可能通过干扰chIRF3/7的功能以逃逸宿主的天然免疫。5、ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中作用初探ALV-J与其他亚群禽白血病毒相比,其最独特之处就是ALV-J的Env基因,该基因其他亚群之间的同源性极低。且有学者提出ALV-J Env蛋白致病致瘤理论。由此推测,ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中是否也发挥一定的作用。本研究成功构建pcDNA3.1-Env真核表达质粒以研究Env蛋白的功能。Real-time PCR结果与双荧光报告素酶结果显示,Env蛋白能够在poly（I:C）刺激后lh、6h和12h抑制IFN-β的表达。Real-timePCR结果显示,在poly（I:C）刺激12h时,TLR3基因表达水平上调,但是IRF3/7和IFN-β3都是处于下调的状态。提示Env蛋白在ALV-J抗天然免疫中可能发挥作用,且Env蛋白发挥作用可能与IRF3/7功能被干扰相关。
杜星[10]（2017）在《TGF-β/SMAD信号通路与非编码RNAs互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制》文中提出TGF-β/SMAD信号通路是动物体内胞外信号入核的重要信号通路之一,广泛参与多种细胞过程,如细胞生长、增殖、分化、自噬与凋亡等的调控。自非编码RNAs（主要是miRNAs和lncRNAs）发现以来,其通过TGF-β/SMAD信号通路调控各种细胞过程的研究一直是生物学相关领域的研究热点,但TGF-β/SMAD信号通路调控miRNAs和lncRNAs的研究却很少。实验室前期研究证实TGF-β/SMAD信号通路是调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的关键通路,并发现其受部分miRNAs（如miR-26b和let-7g）的直接调控。本文拟在前期体外培养猪卵泡颗粒细胞中敲减SMAD4后转录组测序工作的基础上,继续以猪卵泡颗粒细胞和TGF-β/SMAD信号通路为研究对象,分析miRNAs和lncRNAs调控TGF-β/SMAD信号通路的机制,以及TGF-β/SMAD信号通路通过miRNAs和lncRNAs调控颗粒细胞凋亡的机制,为揭示非编码RNAs与TGF-β/SMAD信号通路互作机制、TGF-β/SMAD信号通路调控颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁机制,以及提高母猪繁殖力提供理论依据。本文的主要研究结果包含以下4个方面:1、miR-425介导SMAD4对TGF-β/SMAD信号通路的反馈调控利用转录组测序数据和qRT-PCR技术鉴定14个SMAD4敲减后猪卵泡颗粒细胞中差异表达的miRNAs（7个显着上调,7个显着下调）。通过构建的差异表达mRNA-miRNA互作网络图、双荧光素酶活性分析和qRT-PCR方法等发现和证实TGFBR2 基因是其中 4 个 SMAD4 抑制 miRNAs（miR-130a、miR-1306、miR-143 与miR-425）的共同靶基因,其中miR-425的靶向抑制效率最高。启动子区活性分析和染色质免疫沉淀试验（ChIP）发现SMAD4能够直接与miR-425基因启动子区上SBE（SMAD4 binding element）位点结合从而抑制miR-425基因的表达。进一步分析发现,SMAD4可通过miR-425正反馈调控TGFBR2、β-SMAD3水平,说明在猪卵泡颗粒细胞中,miR-425能够介导SMAD4对TGF-β/SMAD信号通路的反馈调控。细胞凋亡分析发现,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,过表达miR-425可促进细胞凋亡,而过表达TGFBR2可挽救miR-425诱导的细胞凋亡;敲减miR-425能够显着抑制细胞凋亡,而敲减TGFBR2可上调miR-425敲减抑制的细胞凋亡,说明miR-425作为促凋亡因子,通过与TGF-β/SMAD信号通路互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡过程。2、TGF-β/SMAD信号通路通过miR-143/FSHR轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡实验室前期发现FSHR与猪卵泡闭锁相关。我们利用RNAi和FACS等技术证实敲减FSHR可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡,抑制FSH诱导的细胞内信号（如PKA与AKT）。生物信息学预测发现猪FSHR基因是miR-143的潜在靶基因,荧光素酶报告基因系统和western blot等方法证实miR-143通过与猪FSHR基因3’-UTR结合抑制猪卵泡颗粒细胞中FSHR及其介导的细胞内信号的表达。进一步分析发现miR-143可通过靶向抑制FSHR促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。序列分析发现在猪miR-143基因启动子区上存在2个SBE位点。荧光素酶活性和ChIP分析发现SMAD4可作为转录因子,直接与猪miR-143基因启动子上SBE位点结合,抑制其表达。敲减SMAD4后猪卵泡颗粒细胞中FSHR表达水平显着下调,而过表达SMAD4后FSHR表达水平显着上调,但过表达miR-143可抑制SMAD4过表达诱导的FSHR及其介到的细胞内信号。另外,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,利用TGF-β1激活TGF-β/SMAD信号通路,可抑制miR-143表达。总之,以上结果充分说明在猪卵泡颗粒细胞中TGF-β/SMAD信号通路通过miR-143/FSHR轴抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。3、LincRNA-NORFA通过TGF-β/SMAD信号通路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡目前关于调控哺乳动物卵泡闭锁的lncRNAs还未见报道。实验室前期发现了一个在猪卵泡颗粒细胞中表达水平较高的未知转录本,利用RACE技术获得其全序列,生物信息学分析发现该转录本是一个基因间lncRNA（lincRNA）。FISH和qRT-PCR分析发现该lincRNA主要在猪卵泡颗粒细胞中表达,且在卵泡闭锁过程中表达下调,表明该lncRNA与卵泡闭锁相关,因此命名为linc-NORFA（Noncoding RNA involved in the Follicular Atresia）。功能分析发现linc-NORFA可抑制猪卵泡颗粒细胞调亡。影响邻近基因的表达是lncRNAs发挥功能的主要方式之一,qRT-PCR分析发现linc-NORFA可影响其邻近基因特别是miR-126的表达。生物信息学分析发现linc-NORFA上含有miR-126的结合靶点,荧光素酶活性分析发现linc-NORFA作为竞争内源性RNA（ceRNA）吸附成熟的miR-126。FACS结果表明miR-126作为促凋亡因子显着上调猪卵泡颗粒细胞凋亡率,介导linc-NORFA对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控。进一步研究发现TGFBR2是miR-126的一个功能靶基因,linc-NORFA/miR-126轴可通过TGFBR2调控猪卵泡颗粒细胞调亡和TGF-β/SMAD信号通路。相关性分析发现在猪卵泡中linc-NOR FA、miR-126和TGFBR2三者表达水平显着相关。总之,上述研究结果表明linc-NORFA可通过影响TGF-β/SMAD信号通路来调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。4、TGF-β/SMAD信号通路通过lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞的凋亡转录组测序数据分析发现SMAD4敲减后猪卵泡颗粒细胞中9号染色体上750Kb基因组内6个基因差异表达。qRT-PCR分析发现敲减和过表达SMAD4后,猪卵泡颗粒细胞中5个基因差异表达,包括2个相邻的lncRNAs基因（lnc-066和lnc-236）。研究发现lnc-066和lnc-236在猪卵泡闭锁过程中表达下调,敲减lnc-066和lnc-236可促进猪卵泡颗粒细胞调亡。进一步分析发现敲减lnc-066和lnc-236,可下调猪卵泡颗粒细胞中其邻近基因FZD4的表达,及其下游蛋白β-catenin的表达,说明lnc-066/236簇可正调控猪卵泡颗粒细胞中FZD4/β-catenin通路。敲减FZD4抑制FZD4/β-catenin通路,猪卵泡颗粒细胞调亡率显着上调。生物信息学分析发现在猪lnc-066和lnc-236基因启动子区分别发现2个和3个SBE位点。荧光素酶活性和ChIP-qPCR分析发现SMAD4能够作为转录因子,分别与lnc-066和lnc-236基因启动子区上相应的SBE位点结合,进而促进其转录。总之,TGF-β/SMAD信号通路可通过lnc-066/236簇调控FZD4/β-catenin通路介导的猪卵泡颗粒细胞凋亡。综上所述,本文证实miR-425通过TGF-β/SMAD信号通路、TGF-Jβ/SMAD信号通路通过miR-143调控猪卵泡颗粒细胞调亡。同时,本文还证实linc-NORFA通过TGF-β/SMAD信号通路、TGF-β/SMAD信号通路通过lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。
二、哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定（论文提纲范文）
（1）闭合蛋白Claudin-2在家蚕质型多角体病毒感染细胞中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 家蚕病毒BmCPV的研究进展 |
| 1.1 家蚕 |
| 1.2 家蚕病毒BmCPV |
| 2 紧密连接蛋白研究进展 |
| 2.1 紧密连接蛋白家族分类 |
| 2.2 紧密连接蛋白的功能 |
| 2.3 紧密连接蛋白Cludin-2 |
| 3 研究目的与研究内容 |
| 3.1 研究目的及意义 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 家蚕Claudin-2的表达模式及其与BmCPV的互作 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 常用仪器见附录二 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Claudin-2的信息学分析 |
| 3.2 Claudin-2的原核表达及抗体制备 |
| 3.3 Claudin-2在家蚕组织中的表达模式 |
| 3.4 Claudin-2与BmCPV在BmN细胞中的共定位 |
| 3.5 家蚕细胞中Claudin-2表达载体的构建及鉴定 |
| 3.6 Claudin-2与病毒蛋白VP7的互作 |
| 3.7 Claudin-2与与病毒蛋白VP3的互作 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Claudin-2对BmCPV感染家蚕BmN细胞的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 常用仪器见附录二 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 过表达claudin-2稳转BmN细胞的筛选及鉴定 |
| 3.2 过表达Claudin-2对BmCPV感染的影响 |
| 3.3 瞬时转染不同剂量Claudin-2表达载体对BmCPV感染的影响 |
| 3.4 siRNA在BmN细胞中对Claudin-2基因的沉默效果 |
| 3.5 siRNA沉默Claudin-2基因对BmCPV感染家蚕的影响 |
| 3.6 抗体封闭Claudin-2蛋白对BmCPV感染BmN细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 载体图谱 |
| 附录二 常用实验仪器 |
| 附录三 测序原始序列 |
| 附录四 RT-qPCR原始数据 |
| 致谢 |
（2）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.1.2 卵泡发育的调控 |
| 1.1.3 颗粒细胞的功能 |
| 1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
| 1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
| 1.2 FHL2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FHL2基因的结构 |
| 1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
| 1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
| 1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
| 1.3 蛋白质互作研究进展 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
| 1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.3 免疫组化分析 |
| 2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
| 2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
| 2.2.6 细胞定位 |
| 2.2.7 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
| 2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
| 2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
| 2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
| 2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 试验主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
| 3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 试验主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
| 4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 4.2.3 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
| 4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
| 4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
| 4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
| 5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
| 5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
| 5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
| 5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
| 5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
| 5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 样品来源 |
| 6.1.2 试验主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
| 6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
| 6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
| 6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
| 6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
| 6.2.6 数据统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
| 6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
| 6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
| 6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
| 6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 8 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PGCs的发生及生物学特性 |
| 1.1 PGCs的发生 |
| 1.2 PGCs的生物学特性 |
| 2 PGCs发生的分子调控研究进展 |
| 2.1 细胞因子调节PGCs形成 |
| 2.2 RNA结合蛋白调节PGCs形成 |
| 2.3 关键基因调节PGCs形成 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路对雄性生殖细胞形成的研究进展 |
| 3.1 Wnt信号通路概述 |
| 3.1.1 经典Wnt信号通路 |
| 3.1.2 非经典Wnt信号通路 |
| 3.2 Wnt/β-catenin信号通路对靶基因转录的调控研究 |
| 3.2.1 β-catenin/TCF核心效应因子 |
| 3.2.2 表观遗传学机制 |
| 3.3 Wnt/β- catenin信号通路在雄性生殖细胞形成过程中的研究 |
| 4 PGCs形成过程的表观遗传调控 |
| 4.1 DNA甲基化在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.1.1 哺乳动物PGCs发育过程的DNA甲基化 |
| 4.1.2 家禽PGCs形成过程的DNA甲基化 |
| 4.2 组蛋白甲基化修饰在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.2.1 哺乳动物PGCs发育过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.2.2 家禽PGCs形成过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.3 组蛋白甲基化修饰发挥功能的机制研究 |
| 4.3.1 抑制性和激活性赖氨酸甲基化修饰 |
| 4.3.2 组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶 |
| 5 本课题的前期研究发现 |
| 6 本研究的研究目的与意义 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt5A/β-Catenin/ TCF7L2信号链的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 细胞分离培养 |
| 1.5 ChIP-Seq和RNA-seq联合分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 1.6 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号参与鸡PGCs形成的研究 |
| 1.6.1 细胞分组与处理 |
| 1.6.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.6.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号分子的表达变化 |
| 1.6.4 COIP检测β-Catenin和TCF7L2的结合 |
| 1.7 ESCs、PGCs中Wnt关键信号分子启动子区的H3K4me2富集检测 |
| 1.7.1 细胞分组与处理 |
| 1.7.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Wnt关键信号分子启动子区的富集情况 |
| 1.8 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt信号分子的表达影响检测 |
| 1.8.1 细胞分组与处理 |
| 1.8.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.8.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin信号通路信号分子的表达变化 |
| 1.8.4 Westen blot检测Wnt通路关键信号分子的表达变化 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 PGCs形成关键信号通路的筛选 |
| 2.1.1 RNA-seq分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 2.1.2 ChIP-Seq分析H3K4me2在PGCs形成过程中富集的关键信号通路 |
| 2.1.3 RNA-seq和ChIP-Seq联合分析筛选PGCs形成关键信号通路 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链参与鸡PGCs形成过程 |
| 2.2.1 Wnt5A介导Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号 |
| 2.2.2 载体构建结果 |
| 2.2.3 β-Catenin与TCF7L2结合 |
| 2.3 ESCs、PGCs中Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区H3K4me2富集检测 |
| 2.3.1 ChIP的条件摸索 |
| 2.3.2 H3K4me2富集于Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区 |
| 2.3.3 H3K4me2在Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区差异富集 |
| 2.4 H3K4me2激活Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号促进PGCs的形成 |
| 2.4.1 体外验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 2.4.2 体内验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进PGCs形成 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 1.5 体内外验证Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号对Lin28A/B的表达影响 |
| 1.5.1 β-Catenin慢病毒干扰载体构建及活性验证 |
| 1.5.2 细胞分组与处理 |
| 1.5.3 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.5.4 qRT-PCR检测Wnt信号分子及Lin28A/B表达情况 |
| 1.6 Lin28A/B启动子区域的生物学信息学分析 |
| 1.7 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 1.7.1 pLin28A-EGFP、pLin28B-EGFP的构建 |
| 1.7.2 DF1细胞培养与转染 |
| 1.7.3 启动子活性定性分析 |
| 1.8 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.8.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 1.8.2 PGL3-basic重组载体鉴定与命名 |
| 1.8.3 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.9 TCF7L2结合位点缺失对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 1.9.1 TCF7L2结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建 |
| 1.9.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 1.10 验证Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin下游靶基因 |
| 1.10.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 1.10.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集Lin28A/B核心启动子区 |
| 1.11 H3K4me2水平变化对Lin28A/B的表达影响的研究 |
| 1.11.1 细胞分组与处理 |
| 1.11.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.11.3 qRT-PCR检测Lin28A和Lin28AB的表达变化 |
| 1.12 Lin28A/B干扰载体构建及干扰效率验证 |
| 1.13 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 1.14 Lin28A/B在PGCs形成过程中的功能研究 |
| 1.14.1 细胞分组与处理 |
| 1.14.2 鸡胚孵化分组与处理 |
| 1.14.3 荧光定量PCR检测PGCs形成相关基因表达 |
| 1.14.4 PAS染色法检测各组生殖嵴发育 |
| 1.14.5 流式细胞分析检测PGCs形成效率 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 2.1.1 不同物种TCF7L2靶基因预测 |
| 2.1.2 GO注释筛选与生殖分化相关的靶基因 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号正向促进Lin28A/B表达 |
| 2.2.1 β-Catenin干扰载体构建及活性验证 |
| 2.2.2 体内验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.2.3 体外验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.3 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.3.1 真核表达载体pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B的构建 |
| 2.3.2 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.4 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.4.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 2.4.2 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.5 TCF7L2结合位点突变对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 2.5.1 转录因子TCF7L2结合位点突变的启动子报告基因载体的构建 |
| 2.5.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 2.6 Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin/TCF7L2信号链直接靶基因 |
| 2.6.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.6.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集于Lin28A/B启动子区 |
| 2.7 H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.1 体外验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.2 体内验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.8 Lin28A/B正向调控PGCs形成的功能研究 |
| 2.8.1 Lin28A/B干扰载体构建 |
| 2.8.2 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 2.8.3 Lin28A/B正向调控PGCs的形成 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 H3K4me2在Lin28A/B启动子区的富集检测 |
| 1.4.1 细胞分组与处理 |
| 1.4.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Lin28/B启动子区的富集情况 |
| 1.5 荧光素酶报告基因检测H3K4me2对Lin28A/B响应Wnt信号能力的影响 |
| 1.6 H3K4me2去甲基化酶LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.6.1 LSD1与β-catenin和TCF7L2的结合能力检测 |
| 1.6.2 LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 H3K4me2富集于Lin28A/B的启动子区并差异性调节Lin28A/B转录 |
| 2.2 H3K4me2甲基化/去甲基化影响Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录 |
| 2.3.1 LSD1融合表达载体构建 |
| 2.3.2 LSDl 与 TCF7L2 互作而不是(3-Catenin |
| 2.3.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 Lin28通过抑制gga-let-7a-2-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.4.1 鸡micRNA-let7s筛选 |
| 1.4.2 细胞分组与处理 |
| 1.4.3 qRT-PCR检测Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.5 gga-let-7a-2-3p靶基因筛选 |
| 1.6 检测gga-let-7a-2-3p对靶基因的靶向作用 |
| 1.6.1 gga-let-7a-2-3p模拟物、抑制物合成及效率验证 |
| 1.6.2 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 1.6.3 双荧光素报告基因检测gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Lin28A/B靶向的关键micRNA let7的筛选 |
| 2.2 gga-let-7a-2-3p靶基因预测 |
| 2.3 gga-let-7a-2-3p负向调控Blimp1的表达 |
| 2.4 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 2.5 gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）鸡VNN1基因在肝脏脂代谢中的功能及其调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 家禽肝脏脂质代谢 |
| 第二节 泛酰巯基乙胺酶(Vanin-1)基因的研究进展 |
| 2.1 VNN1基因的发现与定位 |
| 2.2 VNN1基因及蛋白的结构 |
| 2.3 VNN1基因的表达与调控 |
| 2.4 VNN1基因的生物学功能 |
| 第三节 CRISPR/Cas9系统在基因功能研究中的应用 |
| 3.1 CRISPR/Cas9的作用机制与发展 |
| 3.2 CRISPR/Cas9技术在基因功能研究中的应用 |
| 第四节 本研究目的意义、研究内容与技术路线 |
| 4.1 本研究目的意义 |
| 4.2 本研究具体内容 |
| 4.3 本研究的技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 CRISPR/Cas9介导鸡VNN1基因敲除后对LMH细胞脂质代谢的影响 |
| 1材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 VNN1靶向sgRNAs设计与pX330重组表达载体的构建 |
| 2.2 pX330重组表达载体转染与嘌呤霉素筛选 |
| 2.3 CRISPR/Cas9基因敲除活性检测 |
| 2.4 CRISPR Cas9系统脱靶检测 |
| 2.5 CRISPR/Cas9敲除细胞群中VNN1基因表达 |
| 2.6 敲除细胞群的转录组分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 PPARα对鸡VNN1基因表达调控的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 饥饿诱导鸡肝脏中VNN1及相关脂代谢基因的表达 |
| 2.2 PPARα在鸡VNN1基因表达中起重要作用 |
| 2.3 PPARα上调VNN1基因启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡HNF4α多克隆抗体制备及对VNN1基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸡HNF4α基因稀有密码子分析及优化 |
| 2.2 鸡HNF4α重组表达菌株的构建 |
| 2.3 鸡HNF4α真核过表达质粒的构建 |
| 2.4 重组蛋白HNF4α的诱导表达、纯化与鉴定 |
| 2.5 抗血清制备及效价分析 |
| 2.6 HNF4α抗体特异性分析 |
| 2.7 HNF4α基因过表达对VNN1表达的影响 |
| 2.8 siRNA干扰鸡HNF4α基因对VNN1表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 miRNA-181a-5p对鸡VNN1基因转录调控的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸡VNN1基因潜在作用的microRNA的预测 |
| 2.2 荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.3 过表达gga-miR-181a-5p对VNN1基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 附1 |
| 表1 主要仪器与设备 |
| 表2 主要试剂与试剂盒 |
| 附2 载体结构图谱 |
| (1) pMD19-T载体结构 |
| (2) pGL3-basic载体结构 |
| (3) pcDNA3.1载体结构 |
| (4) pMIR-REPORT 载体结构 |
| (5) pCMV-3Tag-9质粒图谱 |
| (6) pYSY-spCas9-sgRNA-Puro(pX330)质粒图谱 |
| (7) pet30a(+)质粒图谱 |
| 附3 转录组测序脂类代谢相关DEGs详细信息 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫与弓形虫病 |
| 1 弓形虫的发现 |
| 2 弓形虫的生活史 |
| 3 弓形虫繁殖 |
| 3.1 细胞周期进程 |
| 3.2 作为组织中心的中心体 |
| 3.3 有丝分裂 |
| 4 弓形虫病 |
| 4.1 人弓形虫病 |
| 4.2 动物弓形虫病 |
| 5 弓形虫的诊断 |
| 5.1 直接检查法 |
| 5.2 免疫学诊断法 |
| 5.3 分子诊断法 |
| 6 弓形虫病的治疗 |
| 7 弓形虫的预防 |
| 参考文献 |
| 第二章 原癌基因 |
| 1 原癌基因分类 |
| 1.1 逆转录病毒致癌基因 |
| 1.2 从基因转移实验中发现的细胞癌基因 |
| 1.3 潜在的癌基因 |
| 2 原癌基因在正常细胞中的功能 |
| 2.1 编码生长因子的原癌基因 |
| 2.2 生长因子受体原癌基因 |
| 2.3 细胞外信号的传导器 |
| 2.4 核转录因子 |
| 3 部分原癌基因与癌症的关系 |
| 3.1 Ras家族基因与癌症 |
| 3.2 蛋白酪氨酸激酶与癌症 |
| 3.3 新癌基因与癌症 |
| 4 寄生原虫原癌基因的研究 |
| 参考文献 |
| 第三章 弓形虫组蛋白研究进展 |
| 1 弓形虫的组蛋白概况 |
| 2 弓形虫组蛋白修饰 |
| 2.1 H4 |
| 2.2 H3 |
| 2.3 H2A和H2B |
| 3 弓形虫分化过程中组蛋白修饰的初步模型 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 刚地弓形虫原癌基因缺失株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 刚地弓形虫eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能及虫体繁殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 eIF-5A的克隆表达 |
| 2.2 eIF-5A western blot分析 |
| 2.3 eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 2.4 eIF-5A的RNA干扰 |
| 2.5 噬斑实验 |
| 2.6 粘附实验 |
| 2.7 侵入实验 |
| 2.8 细胞内增殖实验 |
| 2.9 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 刚地弓形虫eIF-5A对虫体蛋白组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白质鉴定 |
| 2.2 蛋白定量重复性分析 |
| 2.3 蛋白质iTRAQ定量 |
| 2.4 蛋白GO注释分析 |
| 2.5 蛋白COG注释分析 |
| 2.6 蛋白Pathway注释分析 |
| 2.7 差异蛋白GO富集分析 |
| 2.8 差异蛋白Pathway富集分析 |
| 2.9 差异蛋白分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 刚地弓形虫Rab43对虫体繁殖能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Rab43的克隆表达 |
| 2.2 Rab43 western blot分析 |
| 2.3 Rab43的RNA干扰 |
| 2.4 噬斑实验 |
| 2.5 粘附实验 |
| 2.6 侵入实验 |
| 2.7 细胞内增殖实验 |
| 2.8 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 刚地弓形虫CDPK3对虫体繁殖能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CDPK3缺失株的构建 |
| 2.2 噬斑实验 |
| 2.3 粘附实验 |
| 2.4 侵入实验 |
| 2.5 细胞内增殖实验 |
| 2.6 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 刚地弓形虫Rab18的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 Rab18序列的PCR扩增 |
| 2.3 弓形虫Rab18原核表达载体的构建 |
| 2.4 弓形虫Rab18重组蛋白的表达 |
| 2.5 rTgRab18的抗原性分析 |
| 2.6 rTgRab18蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.7 Ana-1细胞增殖实验 |
| 2.8 Ana-1细胞凋亡实验 |
| 2.9 Ana-1细胞吞噬实验 |
| 2.10 Ana-1细胞趋化性实验 |
| 2.11 Ana-1细胞Toll样受体4检测 |
| 2.12 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.13 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十章 刚地弓形虫H3的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 基因的PCR扩增 |
| 2.3 pET-32a(+)表达载体的构建 |
| 2.4 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 抗原性分析 |
| 2.6 Western blot分析 |
| 2.7 rTgH3蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.8 细胞增殖实验 |
| 2.9 细胞凋亡实验 |
| 2.10 细胞吞噬实验 |
| 2.11 细胞趋化性实验 |
| 2.12 细胞Toll样受体4检测 |
| 2.13 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.14 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十一章 刚地弓形虫H4的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 H4序列的PCR扩增 |
| 2.3 弓形虫H4原核表达载体的构建 |
| 2.4 弓形虫H4重组蛋白的表达 |
| 2.5 TgH4的抗原性分析 |
| 2.6 rTgH4蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.7 Ana-1细胞增殖实验 |
| 2.8 Ana-1细胞凋亡实验 |
| 2.9 Ana-1细胞吞噬实验 |
| 2.10 Ana-1细胞趋化性实验 |
| 2.11 Ana-1细胞Toll样受体4检测 |
| 2.12 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.13 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 附录 |
（8）Sirt1基因对鸡肝脏中脂类代谢的调控及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 SIRT1与肝脏代谢 |
| 2.1 SIRT1是细胞代谢重要的应答因子 |
| 2.2 SIRT1与肝脏的糖代谢 |
| 2.3 SIRT1与肝脏的脂类合成代谢 |
| 2.4 SIRT1与肝脏的脂肪酸氧化代谢 |
| 2.5 SIRT1与肝脏的胆固醇代谢 |
| 2.6 SIRT1与肝脏的氧化应激和炎症 |
| 3 SIRT1基因的表达调控 |
| 3.1 Sirt1的转录水平调控 |
| 3.2 microRNA对Sirt1基因的转录后调控 |
| 3.3 Sirt1的转录后修饰调控 |
| 4 畜禽Sirt1基因的研究进展 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 鸡Sirt1基因的时空表达规律及营养状态对肝脏Sirt1基因表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验动物 |
| 2.2 试验药品和试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 组织取样 |
| 3.2 禁食试验 |
| 3.3 总RNA的提取 |
| 3.4 总蛋白的提取 |
| 3.5 荧光定量检测 |
| 3.6 Western Blot |
| 3.7 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 鸡Sirt1基因的时空表达分析 |
| 4.2 饥饿对鸡血糖、血脂变化和肝脏代谢基因表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 鸡肝脏中受Sirt1调控的基因和信号通路的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验动物和细胞 |
| 2.2 试验药品和试剂 |
| 2.3 主要仪器和设备 |
| 2.4 引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 干扰鸡原代肝细胞中Sirt1基因后的基因表达分析 |
| 3.2 鸡SIirt1基因在LMH中的过表达 |
| 3.3 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 鸡肝细胞表达谱测序 |
| 4.2 鸡Sirt1基因在LMH细胞中的过表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 Sirt1基因对肝细胞应答高糖高脂的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验细胞 |
| 2.2 试验药品和试剂 |
| 2.3 主要仪器和设备 |
| 2.4 引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 Sirt1基因稳定低表达LMH细胞系的建立 |
| 3.2 重组细胞LMH-gSmiR30对糖脂代谢的变化研究 |
| 3.3 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 Sirt1基因稳定低表达LMH细胞系的建立 |
| 4.2 高糖、高脂肝细胞内Sirt1基因及其下游基因表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 鸡Sirt1基因表达调控机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验细胞 |
| 2.2 试验药品和试剂 |
| 2.3 主要仪器和设备 |
| 2.4 引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 鸡Sirt1基因5'RACE和3'RACE的扩增 |
| 3.2 鸡Sirt1基因启动子结构功能研究 |
| 3.3 甲基化对LMH细胞中Sirt1基因表达的影响 |
| 3.4 microRNA对鸡Sirt1基因表达调控机制的研究 |
| 3.5 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 鸡Sirt1基因5'RACE和3'RACE的扩增 |
| 4.2 鸡Sirt1基因启动子结构功能研究 |
| 4.3 甲基化对Sirt1基因转录影响的初步研究 |
| 4.4 microRNA对鸡肝内Sirt1基因转录后的表达调控 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附1 |
| 附2 |
| 附3 |
| 附4 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）J亚群禽白血病病毒与宿主细胞相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 符号说明 第一章 文献综述 |
| 综述一 禽白血病毒的研究进展 |
| 1 禽白血病毒简介 |
| 2 禽白血病毒的细胞受体 |
| 3 禽白血病毒导致免疫抑制 |
| 综述二 病毒感染与宿主抗病毒免疫研究进展 |
| 1 先天免疫在抗病毒反应过程中的作用 |
| 2 病毒逃逸先天免疫抗病毒反应的策略 |
| 3 禽类抗病毒免疫相关模式识别受体 第二章 膜表面蛋白GRP78参与ALV-J入侵宿主细胞 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 Real-time PCR |
| 2.1.7 TCID_(50) |
| 2.1.8 IFA |
| 2.1.9 Western-blot |
| 2.1.10 鹅胚成纤维细胞(GEF)的制备 |
| 2.1.11 质粒转染 |
| 2.1.12 siRNA干扰试验 |
| 2.1.13 chGRP78转染HEK293T重建试验 |
| 2.1.14 chGRP78转染GEF重建试验 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 多克隆抗体封闭细胞膜表面chGRP78抑制ALV-J的复制 |
| 2.2.2 siRNA干扰chGRP78的表达以抑制ALV-J的复制 |
| 2.2.3 非易感细胞重建试验 |
| 2.3 讨论 第三章 Toll样受体在ALV-J复制中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试验仪器 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.1.5 引物序列 |
| 3.1.6 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 3.1.7 ALV-J病毒的浓缩 |
| 3.1.8 细胞增殖和毒性试验 |
| 3.1.9 ALV-J感染前配体刺激 |
| 3.1.10 ALV-J感染后配体刺激 |
| 3.1.11 Real-time PCR检测配体刺激前后ALV-J mRNA水平表达情况 |
| 3.1.12 配体刺激前后细胞培养上清ALV-J TCID_(50)测定 |
| 3.1.13 IFA检测CEF细胞中ALV-J Env蛋白的表达 |
| 3.1.14 Western Blot分析CEF细胞中ALV-J Env蛋白的表达 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 Toll样受体(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR21)相应配体细胞毒性检测 |
| 3.2.2 Toll样受体(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR21)相应配体在ALV-J感染前刺激CEF细胞时对病毒复制的影响 |
| 3.2.3 TLR2配体PGN-EB在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制影响 |
| 3.2.4 TLR3配体poly(I:C)在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制影响 |
| 3.2.5 TLR4配体LPS在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制情况的检测 |
| 3.2.6 TLR5配体FLA-BS在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制情况的检测 |
| 3.2.7 TLR7配体Imiquimod在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制情况的检测 |
| 3.2.8 TLR21配体ODN(2006)在ALV-J感染后不同时间点刺激CEF细胞时对病毒复制情况的检测 |
| 3.3 讨论 第四章 ALV-J感染宿主细胞CEF时激活非MyD88依赖途径 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞和病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试验仪器 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.1.5 引物序列 |
| 4.1.6 病毒感染试验 |
| 4.1.7 Real-time PCR方法检测病毒感染后细胞中Toll样通路中各因子的表达情况 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 禽白血病毒感染宿主细胞后模式识别受体(Toll样受体和MDA5)的确定 |
| 4.2.2 禽白血病毒感染宿主细胞后参与MyD88依赖途径中相关因子检测 |
| 4.2.3 禽白血病毒感染宿主细胞后参与TLR3通路中相关因子 |
| 4.3 讨论 第五章 鸡IRF3/7在ALV-J抗天然免疫中的作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要生物材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要试验仪器 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.1.5 引物的设计和目的片段的扩增 |
| 5.1.6 目的片段的克隆 |
| 5.1.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 5.1.8 小鼠多抗血清的制备 |
| 5.1.9 pcDNA3.1-chIRF3/7-rIgG和pcDNA3.1-rIgG真核表达质粒构建与鉴定 |
| 5.1.10 鸡IRF3/7过表达后对禽白血病毒复制的影响 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 鸡IRF3/7的PCR扩增 |
| 5.2.2 pCold-TF-chIRF3/7原核表达载体的构建 |
| 5.2.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 5.2.4 表达条件的优化 |
| 5.2.5 重组蛋白的鉴定 |
| 5.2.6 pcDNA3. 1-chIRF3/7-rIgG和pcDNA3.1-rIgG真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 pcDNA3.1-chIRF3/7-rIgG和pcDNA3.1-rIgG真核表达的鉴定 |
| 5.2.8 鸡IRF3/7多抗血清的鉴定 |
| 5.2.9 过表达鸡IRF3/7对ALV-J复制的影响 |
| 5.2.10 过表达鸡IRF3/7能够上调宿主细胞IFN-β的表达 |
| 5.3 讨论 第六章 ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中作用初探 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要生物材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要试验仪器 |
| 6.1.4 引物序列 |
| 6.1.5 引物的设计和目的片段的扩增 |
| 6.1.6 目的片段的克隆 |
| 6.1.7 真核表达的鉴定 |
| 6.1.8 luciferase检测 |
| 6.1.9 Real-time PCR |
| 6.1.10 统计分析和作图 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 ALV-J Env基因片段的PCR扩增 |
| 6.2.2 pcDNA3.1-Env真核表达载体的构建 |
| 6.2.3 pcDNA3.1-Env真核表达的鉴定 |
| 6.2.4 过表达ALV-J Env蛋白对IFN-β表达的影响 |
| 6.2.5 过表达ALV-J Env蛋白对与Ⅰ型干扰素相关分子的影响 |
| 6.3 讨论 全文总结 论文的创新点 文献引用 致谢 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（10）TGF-β/SMAD信号通路与非编码RNAs互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 缩写语中英文对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 TGF-β/SMAD信号通路 |
| 1.1 TGF-β/SMAD信号通路成员 |
| 1.2 TGF-β/SMAD转导信号过程 |
| 1.3 TGF-β/SMAD信号通路的表观遗传学调控 |
| 2 TGF-β/SMAD信号通路与miRNAs互作 |
| 2.1 miRNAs概述 |
| 2.2 TGF-β/SMAD信号通路调控miRNAs |
| 2.3 miRNAs调控TGF-β/SMAD信号通路 |
| 3 TGF-β/SMAD信号通路与LncRNAs互作 |
| 3.1 lncRNAs概述 |
| 3.2 lncRNAs调控TGF-β/SMAD信号通路 |
| 3.3 TGF-β/SMAD信号通路调控lncRNAs |
| 第二章 miR-425介导SMAD4反馈调控猪卵泡颗粒细胞中TGF-β/SMAD信号通路 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SMAD4调控猪卵泡颗粒细胞中miRNAs表达 |
| 2.2 TGFBR2是SMAD4抑制miRNAs的共同靶基因 |
| 2.3 miR-425通过TGF-β/SMAD信号通路促进猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.4 miR-425基因启动子区的鉴定 |
| 2.5 SMAD4通过与miR-425基因启动子结合调控其表达 |
| 2.6 miR-425介导SMAD4对TGF-β/SMAD信号通路的反馈调控 |
| 2.7 miR-425受TGF-β/SMAD信号通路调控 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 TGF-β/SMAD信号通路通过miR-143/FSHR轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 FSHR参与猪卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁 |
| 2.2 FSHR是miR-143的靶基因 |
| 2.3 miR-143靶向抑制猪卵泡颗粒细胞中FSHR的表达 |
| 2.4 miR-143靶向FSHR影响颗粒细胞凋亡 |
| 2.5 SMAD4作为转录因子抑制miR-143的表达 |
| 2.6 SMAD4通过靶向抑制miR-143从而促进FSHR表达 |
| 2.7 TGF-β/SMAD信号通路调控miR-143/FSHR轴的表达与功能 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 Linc-NORFA通过TGF-β/SMAD信号通路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Linc-NORFA的鉴定与分析 |
| 2.2 Linc-NORFA调控颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁 |
| 2.3 Linc-NORFA作为ceRNA吸附miR-126 |
| 2.4 miR-126的表达水平与linc-NORFA显着相关 |
| 2.5 miR-126促进颗粒细胞凋亡,并介导linc-NORFA的功能 |
| 2.6 TGFBR2是miR-126的功能靶基因 |
| 2.7 miR-126靶向TGFBR2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.8 Linc-NORFA/miR-126轴调控TGF-β/SMAD信号通路 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 TGF-β/SMAD信号通路通过lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 SMAD4调控猪卵泡颗粒细胞中9号染色体上750Kb基因组区域内基因的转录 |
| 2.2 猪LOC102160066066和LOC102160236基因转录本特征分析 |
| 2.3 Lnc-066/236簇调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.4 Lnc-066/236簇通过FZD4/β-catenin通路调控颗粒细胞凋亡 |
| 2.5 SMAD4直接与lnc-066和lnc-236启动子区结合 |
| 2.6 SMAD4通过lnc-066/236簇调控FZD4/β-catenin通路 |
| 2.7 TGF-β/SMAD信号通路调控lnc-066/236簇/FZD4轴 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定（论文参考文献）
- [1]闭合蛋白Claudin-2在家蚕质型多角体病毒感染细胞中的作用[D]. 朱涵雪. 苏州大学, 2020(02)
- [2]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [3]H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究[D]. 王曼. 扬州大学, 2019
- [4]沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究[D]. 陶华. 苏州大学, 2019(08)
- [5]鸡VNN1基因在肝脏脂代谢中的功能及其调控机制的研究[D]. 王中亮. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [7]刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究[D]. 刘欣超. 南京农业大学, 2018(07)
- [8]Sirt1基因对鸡肝脏中脂类代谢的调控及其机制研究[D]. 郁建锋. 扬州大学, 2019
- [9]J亚群禽白血病病毒与宿主细胞相互作用机制研究[D]. 王琳. 扬州大学, 2018(12)
- [10]TGF-β/SMAD信号通路与非编码RNAs互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制[D]. 杜星. 南京农业大学, 2017(07)