一、恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达（论文文献综述）
姚亚文[1]（2021）在《基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究》文中研究说明鸡球虫病是一种寄生于鸡肠道危害严重的寄生虫病。目前,该病主要依赖于药物防治,药物的长期广泛使用导致鸡球虫出现严重耐药性。为研究鸡球虫耐药性产生的分子机制,本研究对柔嫩艾美耳球虫敏感株（DS）和盐霉素耐药株（SMR）进行全基因组重测序,利用选择性清除方法筛选出可能与盐霉素耐药相关的候选基因,并对3个耐药相关基因（柔嫩艾美耳球虫保守蛋白35（EtCHP35）、柔嫩艾美耳球虫保守蛋白40（EtCHP40）和柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG））的特性进行了初步分析。1.全基因组重测序与选择性清除筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因本研究对柔嫩艾美耳球虫10株药物敏感株、3株实验室诱导的盐霉素耐药株和15株单卵囊分离的田间盐霉素耐药株进行了全基因组重测序分析,结果显示样品数据量均在1?Gb以上,Q20≥95%、Q30≥90%,与参考基因组比对结果显示比对率均高于82%,测序深度均大于14%,覆盖度（4×）均高于92%。利用选择性清除方法对柔嫩艾美耳球虫药物敏感株和盐霉素耐药株重测序结果进行分析,获得73个在敏感株受选择基因,共1221个SNPs位点,其中81个SNPs属于非同义突变;获得148个在盐霉素耐药株受选择基因,共2545个SNPs位点,其中118个SNPs位点属于非同义突变。GO富集分析结果显示,敏感株候选基因主要参与生物过程和分子功能,盐霉素耐药株候选基因主要参与生物代谢过程。KEGG通路分析结果显示,敏感株候选基因主要参与吞噬体、氧化磷酸化和新陈代谢等通路,盐霉素耐药株候选基因主要参与吞噬体,新陈代谢等通路。将选择性清除的候选基因与转录组结果关联分析,获得共有基因14个,这些基因主要参与核糖体和ATP转运等通路。2.3个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊c DNA第一链为扩增模板,成功克隆了EtCHP35,EtCHP40和EtSAG的ORF序列。对氨基酸序列分析显示,三个蛋白均无跨膜结构,有多个蛋白酶磷酸化位点,其中EtCHP35含一个逆转录酶位点,EtCHP40含一个天冬氨酸蛋白酶活性位点,EtSAG含一个信号肽,一个苏氨酸富集区,属于表面抗原家族（SAG family member）。成功构建原核重组表达质粒并诱导表达了三个重组蛋白（r EtCHP35,r EtCHP40和r EtSAG）,并制备了相应的抗体。3.3个耐药相关基因特性分析间接免疫荧光定位结果显示EtCHP35和EtCHP40主要分布在子孢子的表面和顶端,EtSAG主要分布在子孢子和第二代裂殖子的表面。体外抑制实验结果显示这3个蛋白与子孢子入侵宿主细胞无关。利用实时荧光定量PCR,对3个基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株（耐药株和敏感株）的mRNA转录水平进行分析,结果显示EtCHP35和EtSAG基因在敏感株孢子化卵囊阶段的mRNA转录水平最高,EtCHP40基因在第二代裂殖子阶段高表达。与敏感株相比,EtCHP35基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株和盐霉素耐药株第二代裂殖子阶段上调;EtCHP40基因在3株耐药株（地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株）第二代裂殖子阶段均上调,且在马杜拉霉素耐药株的转录水平显着高于其他耐药株;EtSAG基因的mRNA转录水平在马杜拉霉素耐药株上调,在盐霉素和地克珠利耐药株的转录水平下调。且在不同浓度的盐霉素作用下,EtCHP35和EtCHP40的mRNA转录水平随着药物浓度的升高而升高。上述结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫耐药性产生的分子机制及建立田间鸡球虫耐药性快速检测方法提供了一定的基础。
李慕晓[2]（2019）在《田鼠巴贝斯虫体外培养分泌抗原的筛选及功能鉴定》文中认为田鼠巴贝斯虫是一种重要的经硬蜱传播的顶复门红细胞专性寄生虫。多感染小型啮齿类动物,也可感染人。健康人感染田鼠巴贝斯虫后往往无明显临床症状,但是免疫功能丧失的个体（如脾脏摘除患者,艾滋病患者）和免疫力低下的人群可能会引发严重感染,继而引起由呼吸窘迫或贫血引起的肾功能衰竭,严重时导致死亡。田鼠巴贝斯虫在感染宿主时通过裂殖生殖进行无性繁殖,裂殖子裂解后会入侵更多的红细胞从而对宿主循环系统造成损害。在这个过程中,田鼠巴贝斯虫会分泌一些抗原,这些抗原使得虫体可以有效地识别宿主红细胞并对其进行黏附、入侵等一系列行为。因此,筛选出裂殖子时期重要的分泌蛋白对于探究田鼠巴贝斯虫入侵和致病机制具有重要意义。而筛选、鉴定分泌抗原的一个重要前提是虫体的体外培养,本课题从建立田鼠巴贝斯虫的体外培养方法入手,通过质谱分析田鼠巴贝斯虫高丰度分泌抗原,并对其中两个进行功能研究。具体如下:1.田鼠巴贝斯虫体外培养方法的建立本研究首先建立了田鼠巴贝斯虫体外培养的方法。对HL-1培养基与1640培养基进行比较,结果表明二者并无明显差异。但是从换液及对血清要求来说使用1640培养基要求新鲜宿主血清,实验小鼠需求量大,而HL-1可使用商品化胎牛血清,故最终确定使用HL-1培养基。2.田鼠巴贝斯虫分泌抗原的筛选使用无血清体系培养田鼠巴贝斯虫,分别收取不同时间段的培养上清进行蛋白质液相色谱质谱分析（LC-MS/MS）,结果一共筛选到40种蛋白,通过生物信息学分析,发现两种表达丰度较高的蛋白SA1与GPI10。此两种蛋白为GPI家族蛋白,具有锚定在虫体表面的特点,故选择GPI10与SA1进行研究。3.田鼠巴贝斯虫SA1与GPI10的功能鉴定首先对SA1与GPI10进行截短表达片段的扩增,构建含GST标签的pGEX-6p-1-SA1与pGEX-6p-1-GPI10原核表达载体,转化入BL21与Transetta大肠杆菌后分别进行表达,分别从上清与包涵体得到了纯化后的SA1与GPI10重组蛋白。Western blot分析表明rSA1与rGPI10可以被田鼠巴贝斯虫的BALB/c鼠阳性血清特异性识别,证明其具有很好的反应原性。随后分别进行了鼠源与兔源多克隆抗体的制备,对这两种基因的天然蛋白存在形式进行鉴定,发现SA1与GPI10既存在于虫体裂解物中,也存在于染虫红细胞裂解物中。间接免疫荧光试验表明SA1在田鼠巴贝斯虫裂殖子时期大量表达,且在虫体膜和胞质内均能检测到SA1的荧光信号,在激光扫描共聚焦显微镜下可观察到SA1被大量分泌至胞外;相比之下GPI10胞质内和整体表达量均偏少,且主要分布在虫体膜表面;SA1与GPI10共定位表明,二者在虫体膜上的荧光具有部分重叠,存在部分共定位。红细胞结合试验表明SA1与GPI10的重组蛋白具有黏附红细胞的能力,并且黏附量与蛋白量成正比,表明二者均为离子型黏附;红细胞花环试验结果表明SA1蛋白在HEK293T细胞内表达后会通过其GPI锚结构定位在细胞表面,并且这些SA1蛋白会黏附住宿主红细胞形成明显的花环。由此推测这两种蛋白可能对虫体入侵红细胞起着十分重要的作用;抗体中和试验结果表明SA1与GPI10的多克隆抗体均能抑制虫体生长,抗体浓度分别在0.24 mg/mL和0.2 mg/mL时与对照组差异极显着。综合以上,本研究成功建立了田鼠巴贝斯虫短期连续体外培养方法,通过质谱及生物信息学筛选出SA1与GPI10两种分泌蛋白,通过间接免疫荧光、红细胞结合试验、花环试验及抗体中和试验对二者进行了功能鉴定,对深入探讨田鼠巴贝斯虫入侵宿主的分子机制及对田鼠巴贝斯虫病的免疫预防研究具有重要意义。
刘亭岐[3]（2018）在《巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究》文中研究说明鸡球虫病是家禽的肠道胞内寄生原虫病。该病严重影响饲料转化效率,所以造成严重的损失。鸡球虫病目前基本通过使用化学药物进行预防治疗,然而,随着耐药性的产生和食品安全问题日益突出,有效的疫苗预防措施备受关注。本研究选取了四种巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）侵入过程相关的蛋白,进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在为发现新抗原以及评价其对宿主在抗巨型艾美耳球虫感染过程中所产生的免疫保护力,提供新型疫苗候选保护性抗原。1.巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的分子特性研究及免疫保护性研究评估本章研究成功扩增了E.maxima表面蛋白（EmSAG）的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由645对碱基所组成,编码214个氨基酸。随后,将EmSAG基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。激光共聚焦试验结果证实,EmSAG在巨型艾美耳球虫的子孢子表面分布,试验结果同时发现EmSAG也存在于裂殖子的表面。动物实验证实,rEmSAG和pVAX1-SAG都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmSAG疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmSAG免疫组中CD4+T和CD8+T细胞的百分含量均显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS,pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡血清中抗EmSAG特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-y与TGF-β含量显着增加（P<0.05）。本章研究结果表明,EmSAG可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供参考。2.巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima延伸因子2（elongation factor 2,EmEF2）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由2499对碱基组成,编码832个氨基酸。随后,将EmEF2基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmEF2和pVAX1-EF2都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmEF2疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmEF2免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡血清中抗EmEF2特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ,TGF-β含量显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmEF可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供备选抗原。3.巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima14-3-3基因（Em14-3-3）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由861bp对碱基组成,编码286个氨基酸。随后,将Em14-3-3基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。使用激光共聚焦试验对Em14-3-3进行亚细胞定位,试验结果表明Em14-3-3在巨型艾美耳球虫的子孢子和裂殖子阶段都有表达。动物试验证实,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。Em14-3-3疫苗可增加雏鸡的卵囊减少率,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组相比,Em14-3-3免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。与 PB S、pET-32a（+）和 pVAX 1 对照组雏鸡相比,rEm 14-3-3 和 pVAX 1-14-3-3免疫组的雏鸡,抗Em14-3-3特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ和TGF-β水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,Em14-3-3可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为新型巨型艾美耳球虫疫苗的研发打下基础。4.巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因分子特性及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima棒状蛋白（EmRON）的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由2475对碱基组成,编码824个氨基酸。随后,将EmRON基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmRON和pVAX1-RON都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmRON疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组雏鸡相比,EmRON免疫组中CD4+T细胞的的百分含量显着增高（P<0.05）。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,抗EmRON特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IFN-γ,TGF-β和IL-4水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmRON可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为巨型艾美耳球虫疫苗的研发提供候选抗原。
赵笑[4]（2017）在《基于双特异性抗体的热带传染病快速侦检方法的研究》文中研究指明热带传染病是威胁我军指战员身体健康的重要疾病。部队官兵热带传染病自我防护意识比较薄弱且进入新环境因缺乏免疫力等而极易感染热带传染病。由于部队执行多样化的军事任务,迫切需要建立热带传染病侦检、诊治和防控相关技术,应对热带传染病的威胁。疟疾属于虫媒传染病,由疟原虫寄生人体红细胞引起,被WHO列入的8大热带病之一,广泛分布于热带亚热带地区,且近年来疟原虫对抗疟药普遍具有抗药性,潜在危害极大。恙虫病是由恙虫病东方体感染人体而引起的虫媒传染病,近年来在我国的流行区域有不断扩大延伸的趋势。我国南海岛屿地处热带,常年多雨,温暖潮湿,是各种病原体滋生的温床,有调查显示该地区大部分区域是恙虫病的疫源地。由于驻守海岛的部队多为外来人群,对该类传染病的免疫力低,发病率较高,严重影响了部队各项任务的完成,是我国南方战区造成非战斗减员的重要传染病。部队军事作业及战时的特点都要求建立快速、便捷、无需或较少借助仪器的诊断方法。为了建立这样一种满足现场使用要求的热带传染病快速侦检方法,我们引入了基因工程双特异性抗体BsAb,它是将两种针对不同抗原的单克隆抗体A和B的重、轻链可变区以非共价键、共价键或亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋等蛋白质结构域连接形成的重组抗体分子。利用基因工程双特异性抗体可同时结合两种不同的抗原的特性,如构建抗人红细胞/抗病原体抗原的双特异性抗体,该BsAb可同时分别结合人红细胞和血液中病原体,形成可见的红细胞的集聚,从而对病原体感染做出诊断检测。本课题在制备了抗恶性疟原虫裂殖子表面抗原、抗恙虫病东方体外膜抗原以及抗人红细胞膜表面非凝集抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞的基础上,通过RT-PCR分别获得cDNA,以其为模板,利用设计的多对引物PCR扩增得到各单克隆抗体的重链和轻链可变区目的基因片段VH、VL。设计拼接引物,利用重叠延伸PCR法,将抗疟原虫裂殖子表面抗原的单克隆抗体的重链和轻链可变区目的基因片段通过连接肽序列拼接得到抗-疟原虫裂殖子表面抗原的单链抗体scFv目的基因片段;将抗人红细胞膜表面非凝集抗原的单克隆抗体的重链和轻链可变区目的基因片段与抗恙虫病东方体外膜抗原的单克隆抗体的重链和轻链可变区目的基因片段通过两个短连接肽序L10（SAKTTPKLGG）和一个长连接肽序列LL（RADAAAA（G4S）4）拼接得到抗-人红细胞膜表面非凝集抗原/抗-恙虫病东方体外膜抗原的双特异性抗体BsAb目的基因片段。同时分别在其N端引入毕赤酵母真核表达系统中信号肽前导序列,在其C端引入6×His标签序列。将这些基因片段分别克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K,电转化毕赤酵母菌GS115并诱导表达,先通过SDS-PAGE电泳分析确定疑似目的蛋白条带后,再应用Western blot检测目的蛋白的表达。获得的确定有目的蛋白表达的上清后续可经镍柱纯化得到电泳纯重组抗体。本研究中,我们通过重叠延伸PCR获得抗-疟原虫裂殖子表面抗原的单链抗体scFv和抗-人红细胞膜表面非凝集抗原/抗-恙虫病东方体外膜抗原的双特异性抗体BsAb目的基因片段。将抗-疟原虫裂殖子表面抗原的单链抗体scFv克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测分析重组蛋白的表达,得到的重组蛋白大小与理论分子量相符。间接免疫荧光实验结果表明该单链抗体可与疟原虫裂殖子表面蛋白识别并结合,从而检测到疟原虫感染,具有与亲本抗体相似的识别结合能力。将抗-人红细胞膜表面非凝集抗原/抗-恙虫病东方体外膜抗原的双特异性抗体重组基因片段克隆至毕赤酵母真核分泌表达载体pPIC9K进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白的表达,得到的重组蛋白大小与理论分子量相符。红细胞集聚实验结果表明该双特异性抗体具有与红细胞膜表面非凝集抗原识别并结合的活性,为后续将该基因工程双特异性抗体用于恙虫病等感染性疾病病原体的快速诊断以及种属鉴定等提供技术支撑。
宿世杰[5]（2018）在《毒害艾美耳球虫3个发育阶段的比较转录组学研究与差异表达基因的克隆表达和功能鉴定》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内引起的一种寄生原虫病,严重危害养鸡业,在我国每年仅用于该病的防治费用就达3～6亿元。长期以来,该病的防治主要依赖药物。但随着药物的长期使用,引起耐药性虫株普遍出现,使药物防治效果不断下降。此外,抗球虫药在饲料中的长期添加,还导致药物残留肉蛋,污染环境,危害人类健康。因此,迫切需要寻找新的策略或方法来控制鸡球虫病。毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）是7种鸡球虫中致病性最强的球虫之一,主要危害8～18周龄的鸡,引起急性小肠球虫病。艾美耳球虫的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三个发育阶段,裂殖生殖又有不同的繁殖代数。一般认为艾美耳球虫的生长发育与性别分化受制于不同发育阶段的基因差异表达与调控。球虫各阶段虫体的分离纯化很难,因此也制约了球虫分子生物学研究领域的发展。艾美耳球虫发育的相关研究国内外文献报道很少,尤其是有关毒害艾美耳球虫的不同发育阶段的分子学研究国内外尚无有关报道。毒害艾美耳球虫的裂殖生殖包括三代,第一、二代裂殖生殖发生在小肠中段的肠黏膜上皮细胞内,第三代裂殖生殖和配子生殖发生在盲肠黏膜上皮细胞内,易于虫体鉴别与分离。本文分离与纯化了毒害艾美耳球虫的第二、三代裂殖子和配子体,提取总RNA后采用第二代测序技术分别对这3个发育阶段虫体的mRNA进行测序,获得转录组数据;对转录组数据进行比较分析,筛选不同发育阶段虫体的差异表达基因,并进行实时定量PCR验证、功能注释与代谢通路富集分析;最后,对4个差异表达基因进行原核表达与免疫荧光定位,对其中1个重组蛋白进行了动物免疫保护试验。本文通过毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体3个发育阶段的转录组测序和比对分析,获得了3个发育阶段的差异表达基因,而对艾美耳球虫不同发育阶段差异表达基因的研究,不仅可以解析艾美耳球虫生长发育的的分子基础与机制,而且可能寻找到药物或疫苗免疫的靶点,从而为鸡球虫病的防治提供新途径和新方法。一、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的分离与纯化用毒害艾美耳球虫孢子化卵囊经嗉囊接种无球虫感染雏鸡后,从鸡小肠中段黏膜组织中分离第二代裂殖子,最后采用Percoll密度梯度离心法纯化裂殖子,平均每只鸡获得7.25×108个裂殖子;从鸡盲肠黏膜组织中分离第三代裂殖子,最后采用DEAE-52纤维素柱层析法纯化裂殖子,平均每只鸡获得0.6×107个裂殖子。通过外科手术经盲肠直接接种第二代裂殖子后30 h,从鸡盲肠黏膜组织中分离配子体,最后采用Percoll密度梯度离心法纯化配子体,平均每只鸡获得0.5×108个配子体。二、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子与配子体的转录组分析分别提取毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的RNA,构建测序样本文库,进行高通量测序。分别从第二代裂殖子文库、第三代裂殖子文库和配子体文库中获得68009 332,51 854 332,73 219 844条Raw reads。比对后,第二代裂殖子共有6 977个基因注释成功,第三代裂殖子有6 901个基因注释成功,配子体有7983个基因注释成功。基因的表达分析显示,7 137个基因在3个阶段均有表达,71个基因仅在第二代裂殖子表达,61个基因仅在第三代裂殖子表达,340个基因仅在配子体表达。GO分析显示在3个发育阶段基因富集的GO条目数相近,仅在条目中的基因数有所不同。KEGG分析显示3个阶段的通路有所不同,第二代裂殖子的基因主要参与剪接体、核糖体、的合成、蛋白酶体、DNA复制、RNA转运等通路;第三代裂殖子的基因主要参与剪接体、核糖体合成、RNA转运、RNA降解、RNA聚合酶等;配子体的基因主要参与核糖体的合成、HIF-1信号通路、剪接体、突触囊泡循环、溶酶体、磷酸戊糖途径等。三、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子比较转录组学分析比较分析每个转录本在第二代裂殖子和第三代裂殖子的表达量,发现2 053个基因表达显着差异,其中第二代裂殖子显着上调表达基因1 216个,特异性表达基因95个;第三代裂殖子显着上调表达基因837个,特异性表达基因48个。GO分析显示中有1 203个差异表达基因被成功注释到59个GO条目,GO富集分析中有1 091个差异表达基因富集在243个GO条目。KEGG分析显示,620个差异表达基因被成功注释到198条信号通路,727个差异表达基因富集到242条信号通路。四、毒害艾美耳球虫第三代裂殖子与配子体比较转录组学分析比较分析每个转录本在第三代裂殖子和配子体的表达量,发现4 267个基因表达显着差异,其中第三代裂殖子显着上调表达基因1 478个,特异性表达基因329个;第三代裂殖子显着上调表达基因2 789个,特异性表达基因1 289个。差异表达基因的GO分析显示,1 295个被成功注释到57个GO条目。KEGG分析显示,620个差异表达基因被成功注释到198条信号通路。富集分析显示,725个显着差异表达基因富集到241条信号通路。五、差异表达基因的原核表达及免疫荧光定位分析根据荧光定量PCR的验证结果,选择4个差异表达基因（EnPIPK、En4GC、EnCK2、EnHAP2）,人工合成或应用RT-PCR方法克隆基因序列,并分别用原核表达载体pET28a（+）构建表达质粒,转化大肠杆菌BL21,诱导表达。融合蛋白的大小分别为30 kDa、17kDa、20 kDa、20kDa左右,均以包涵体的形式存在为主。Western blot检测显示,4种重组蛋白均能识别抗6×HIS标签单抗。分别用4种重组蛋白免疫小鼠制备的多抗进行免疫免疫荧光定位试验,结果显示EnPIPK、EnCK2和EnHAP2基因表达产物定位在第二代裂殖子（或裂殖子体）、第三代裂殖子（或裂殖体）和配子体,但在3个发育阶段表现的荧光强度不尽一致;EnAGC基因表达产物仅见于第三代裂殖子（或裂殖体）和配子体。免疫免疫荧光定位与荧光定量PCR结果相一致。六、重组蛋白rEnHAP2免疫保护效果将纯化复性的重组蛋白rEnHAP2按不同剂量（200、100、50μg/羽）免疫无球虫感染雏鸡,免疫2次后除未免疫未攻虫组外,其余各试验组雏鸡均感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊,以成活率、卵囊减少率、病变记分、平均增重等为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果,并检测其诱导的细胞因子的表达水平。试验共进行2次。结果显示,rEnHAP2以每鸡200 μg的免疫剂量保护效果最好,与未免疫攻虫组相比,重组蛋白rEnHAP2能降低卵囊产量与病变记分,提高存活率;能诱导机体产生较高水平的细胞免疫和体液免疫。
周健华[6]（2016）在《恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质PF3D70811600的表达及功能分析》文中研究说明疟疾是由疟原虫引起并可通过雌性按蚊叮咬传播的传染病。在过去15年里,由于积极的预防和治疗,疟疾得到了很好的控制。2013年世界卫生组织报告显示,全球每年仍有1.8亿人感染疟疾,其中36-75万人发生死亡,随着耐药虫株的出现,开发有效的疟疾疫苗对于降低疟疾的发病率和促进对疟疾的长期控制十分必要。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是疟疾的主要病原体,其致病手段是通过血液感染阶段的裂殖子入侵宿主红细胞,并在红细胞内大量繁殖,而此过程中表达的虫体蛋白和分泌的代谢产物成为关键的致病因子。因此恶性疟原虫裂殖子蛋白可作为研发新型抗疟疫苗的重要靶标。恶性疟原虫裂殖子通过特异性识别红细胞表面受体侵入到新的宿主红细胞内。研究表明,肝素类分子是介导裂殖子入侵红细胞的重要受体,迄今为止,在疟原虫中确定与肝素结合的蛋白质非常有限。本实验室前期利用亲和纯化和高通量质谱分析发现部分恶性疟原虫天然蛋白质能与肝素特异性结合。其中筛选出的PF3D70811600与肝素结合肽段数较多,猜测其可能介导了虫体与红细胞的黏附和入侵。为了研究该蛋白在裂殖子入侵红细胞过程中发挥的作用,首先进行了荧光定量PCR,检测PF3D70811600基因在恶性疟原虫3D7株红内期不同发育阶段的转录水平。通过对目的基因进行序列分析,在C端和N端分别选取一段亲水性序列,用设计的特异性引物扩增目的片段,连接克隆载体测序正确后,用Eco RI和Xho I进行双酶切,分别连接至表达载体p ET-28a和p GEX-4T-1,进行His标签和GST标签重组蛋白质的表达和纯化。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,制备特异性多克隆抗体。通过Western blot检测PF3D70811600虫体蛋白的表达。通过间接免疫荧光和免疫电镜实验,对PF3D70811600虫体蛋白进行定位分析。用纯化的GST标签重组蛋白质进行肝素结合实验,用纯化的His标签重组蛋白质进行红细胞黏附实验,检测该蛋白质的肝素结合特性和红细胞黏附特性。用纯化的抗PF3D70811600的Ig G进行体外虫体入侵抑制实验,进一步探究其在裂殖子入侵过程中的作用。同时用间接ELISA检测疟疾病人血清,评价其在自然感染过程中的免疫原性。荧光定量PCR结果显示,PF3D70811600基因在恶性疟原虫3D7株红内期不同发育阶段均有转录,在40 h时转录水平最高。纯化的重组蛋白质纯度较高,免疫家兔后获得高效价的抗血清。Western blot检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体的天然蛋白质,定位分析结果显示PF3D70811600表达在裂殖子表面,推测其为裂殖子表面蛋白。肽段PF3D70811600-N和PF3D70811600-C均能和肝素发生特异性结合,而与红细胞发生黏附的肽段为PF3D70811600-C。抗PF3D70811600-N和PF3D70811600-C的Ig G对虫体入侵均有很好的抑制作用,其中抗PF3D70811600-C的Ig G抑虫效果更明显。由此推测PF3D70811600的C端在裂殖子入侵宿主红细胞的过程中发挥着重要作用。肽段PF3D70811600-C能够与疟疾病人血清产生特异性免疫反应,说明该蛋白质具有较好的免疫原性,很有可能成为新型抗疟疾疫苗的候选抗原。
周健华,魏晓燕,常志广,姜宁,陆慧君,陈启军[7]（2016）在《恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质（PF3D70811600）的表达纯化及其多克隆抗体的制备》文中认为利用大肠杆菌原核表达并纯化恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D70811600,免疫家兔制备特异性多克隆抗体,通过对虫体天然蛋白的识别,分析PF3D70811600在虫体内的表达。采用PCR技术从恶性疟原虫3D7株总DNA中获得PF3D70811600基因的目的片段,连接到p MD18-T克隆载体,得到的克隆质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建重组原核表达质粒p ET-PF3D70811600和p GEX-PF3D70811600,通过优化表达条件,分别在大肠杆菌中得到高效表达,并用亲和层析柱纯化目的蛋白质。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,用Western Blot方法检测制备的特异性多克隆抗体。结果表明:成功纯化并获得重组蛋白质,用间接ELISA方法检测多抗效价达到1∶16 000,用Western Blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够识别虫体天然蛋白。恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D70811600在虫体晚期表达,说明该蛋白在虫体发育的晚期发挥重要作用,猜测其可能与裂殖子入侵宿主红细胞有关。
仰梦佳[8]（2014）在《恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析》文中研究指明第一部分麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白目的：采用麦胚无细胞蛋白合成系统表达具有生物活性的恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2。方法：恶性疟原虫实验室培养标准株3D7提取的基因组DNA为模板，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体pEU-His。转化大肠杆菌DH5α株，获得含有目的基因的表达质粒。通过双酶切和DNA测序分析鉴定重组质粒。中提重组质粒后，用麦胚无细胞蛋白合成系统进行表达，对表达产物进行纯化和分析。结果：PCR成功扩增6个目的基因片段，MSPDBL1（2043bp），MSPDBL2（2200bp），DBL1（933bp），DBL2（921bp），SPAM1（465bp），SAPM2（576bp），并成功构建了6个用于麦胚无细胞蛋白合成系统的重组质粒，该6个重组质粒在麦胚无细胞蛋白合成系统中成功地表达出了6个重组恶性疟原虫蛋白rMSPDBL1（Mr74kDa），rMSPDBL2（Mr84kDa），rDBL1（Mr34kDa），rDBL2（Mr34kDa），rSPAM1（Mr17kDa），rSAPM2（Mr21kDa），经western blotting鉴定，表达产物的可溶性为100%，并成功纯化出重组蛋rSPAM1。结论：麦胚无细胞蛋白合成系统可以提高重组蛋白的可溶性。关于麦胚无细胞蛋白合成系统表达的重组蛋白质的纯化问题，需要进一步的研究。第二部分恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2-DBL2结构域的原核表达和抗原性分析目的：克隆、表达恶性疟原虫疫苗候选分子裂殖子表膜蛋白MSPDBL2（PF100355）的DBL2结构域，并研究其抗原性。方法：提取恶性疟原虫实验室培养标准株3D7的基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体，构建重组表达质粒pET28a-DBL2，转化大肠埃希菌BL2l（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并经亲和层析获得纯化的重组蛋白rDBL2。分别以恶性疟病人血清、正常人血清、对照混合血清作为一抗，蛋白质印迹（western blotting）分析该重组蛋白的抗原性。结果：PCR扩增获得长约950bp片段，菌落PCR和测序结果显示，重组质粒pET28a-DBL2构建成功，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，经IPTG诱导并经亲和层析纯化后获得相对分子质量（Mr）约为34kDa的包涵体蛋白。经变性条件纯化得到rDBL2，western blotting分析结果显示，该重组表达蛋白rDBL2被恶性疟病人血清识别，有较好的抗原性。结论：成功克隆和表达纯化了恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2的DBL2结构域，重组蛋白rDBL2有良好的抗原性。第三部分中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性分析目的：探讨中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性特点。方法：中缅边境恶性疟病人血滤纸片提取恶性疟原虫基因组DNA，根据恶性疟原虫基因Pfmspdbl2（PF100355）为目的扩增片段设计特异性引物，进行聚合酶链反应（PCR）扩增，以恶性疟原虫标准株3D7作为参照，利对所获得的基因序列进行测序分析，评估序列多态性。结果：80份恶性疟原虫基因组DNA，PCR扩增并测序成功16个Pfmspdbl2基因片段。测序结果显示，Pfmspdbl2基因16样本中，野生型占87.5%（14/16），突变型占12.5%（2/16）。结论：中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因具有多态性。中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2有阳性选择趋势，可能与人的抗虫免疫的有关。
杜承[9]（2010）在《恶性疟原虫Pf332抗原的免疫原性分析》文中研究表明疟原虫抗药性的产生和扩散已使全球疟疾疫情严重恶化,每年疟疾死亡人数自上世纪七十年代的约50万上升至目前约100万,药物防治疟疾的措施亦面临严重的困难和挑战。因此新的疟疾控制措施的实施已成为当务之急。疫苗接种已使许多种传染病得到有效的控制乃至根除,因此研制有效的疟疾疫苗成为防止疟原虫感染的重要手段。Pf332是恶性疟原虫基因组所编码的分子量最大的蛋白质。该蛋白质具有典型的跨膜蛋白结构,其膜外区含有一个保守的Duffy抗原结合基团相类似的功能区（Duffy-binding like, DBL domain）。Pf332由红内期恶性疟原虫分泌运输到感染的红细胞表面,在裂殖子侵入红细胞的过程中起到了辅助作用。由于其膜外DBL区与其他膜外区蛋白质相比具有高度的保守性,使其可能成为发展新的抗疟药物和疫苗的候选分子。本研究制备得到12株抗Pf332-DBL区重组蛋白质的IgG1亚型单克隆抗体,通过Western blot和间接免疫荧光实验验证了这12株单抗不仅可以特异性识别重组蛋白质,而且可以识别虫体天然蛋白Pf332。在此基础上,根据Pf332-DBL区氨基酸序列合成9段多肽,以肽扫描的方法确定了单抗的结合肽段,通过单抗体外抑制虫体侵入实验,发现Pf332-DBL区在疟原虫裂殖子侵入红细胞过程中发挥重要作用的两个功能区域位于第125个氨基酸和第76100个氨基酸。在分析Pf332-DBL区重要生物学功能的同时,为确定其在疟疾疫苗研究中的可应用性,本研究还对Pf332-DBL区重组蛋白质的免疫原性进行了分析。通过比较Pf332-DBL区重组蛋白质与4种不同佐剂混合免疫动物后的抗体效价、抗体亚型及抗体维持水平,揭示出Pf332-DBL区具有很强的免疫原性,而且筛选到适合Pf332-DBL区在疫苗研究中的佐剂ISA720。本研究发现Pf332是疟原虫的一个重要功能蛋白质,DBL区是Pf332蛋白实施生物学功能的关键区域。Pf332-DBL区具有很强的免疫原性,是抗疟原虫的重要疫苗候选抗原。
曲久鑫[10]（2010）在《第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选》文中研究说明摘要疟疾是世界上最严重的传染病之一,2008年有2.43亿人感染疟原虫,约86.3万人因患疟疾死亡,而恶性疟原虫是造成严重危害的主要“元凶”。近年来,虽然在“疟疾控制”方面取得了显着的成绩,但对于预防性和治疗性疟疾疫苗的需求仍十分迫切。目前,针对疟原虫生活史复杂,抗原的表达具有阶段特异性、高度变异性等特点,亚单位、多表位嵌合疫苗成为抗恶性疟疫苗的研究热点。前期研究中,本实验室发明了“表位改组”技术,利用其构建了具有极高表位连接多样性的多表位基因文库,并筛选出了高免疫原性和体外抑制疟原虫生长能力的第一代多表位嵌合抗原M.RCAg-1,证实了“表位改组”技术的可行性。但是,由于其N端带有载体来源的43肽以及6×His蛋白标签,虽然能够用肠激酶（EK）切除,但成本过高,限制了M.RCAg-1的研究价值。本研究在前期工作的基础上,进行了一系列改进,包括：选择了12个以恶性疟原虫红内期主要的疫苗候选抗原为主的15个B细胞和Th细胞表位；在表位连接处引入特定的间隔序列；在多表位抗原的N、C端固定引入抗原侧翼序列FN和FC；所有多表位抗原序列均为疟原虫来源,不含任何载体肽和蛋白标签,符合国家《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的标准规范。构建并筛选得到了第二代多表位嵌合抗原疫苗。与此同时,通过对多表位嵌合抗原序列（表位）组成、二级结构、免疫原性和疟原虫体外生长抑制率（GIA）水平的对比分析,初步探讨了几个参数间的关系。此外,建立了以C端固定肽的特异性多克隆IgY抗体为配基的免疫亲和层析,为文库中多表位嵌合抗原的高效纯化探索了新的途径。主要取得以下进展：1.成功构建并得到具有高免疫原性和表位连接多样性的第二代多表位嵌合基因文库,同时其小鼠免疫血清对培养恶性疟原虫天然蛋白具有识别多样性。2.从基因文库中筛选得到高免疫原性嵌合抗原D10,免疫大白兔后,总IgG和特异性IgG的GIA水平分别为47%和67%,高于阳性对照抗原MSP1抗体的44%。此外,对72份疫区患者血清的筛查发现,对D10抗原的识别率达到67%,且与患者虫血率显着负相关,提示D10可能与恶性疟疾保护有关。表明全序列为疟原虫来源的嵌合抗原D10,具有继续优化开发的价值。3.我们发现多表位嵌合抗原二级结构中的"Coil-Helix-Coil-Helix"结构影响抗原的免疫原性；同时,也发现含有“连续4个Th细胞表位”结构的多表位嵌合抗原具有更高的GIA水平。4.证实了在多表位嵌入肽段抗体中,抑制性和促进性抗体的存在,并推断其以级联或协同的方式影响总抗体的GIA水平。5.通过制备C端融合序列的特异性多克隆IgY抗体,建立了免疫亲和纯化文库多表位嵌合抗原的新途径。6.证实了基于Hydroethidine染料的流式细胞术,可以作为恶性疟原虫虫血率及其生长周期的相对定量分析方法,并将其工作浓度优化为10μg/ml。本研究利用部分改进的“表位改组”技术,构建并筛选得到了具有较大开发价值的多表位嵌合抗原D10。同时,通过大量实验数据证实了N、C端融合片段作为鉴定和免疫亲和纯化内源标签的实际应用性,以及多表位嵌入肽段序列对多表位嵌合抗原免疫原性和其特异性抗体对疟原虫体外生长抑制率的影响。以上实验结果为各类多表位嵌合抗原疫苗的设计提供了有意义的理论依据。
二、恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达（论文提纲范文）
（1）基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗球虫药 |
| 1.1.1 聚醚离子载体类抗球虫药 |
| 1.1.2 化学合成类抗球虫药 |
| 1.2 鸡球虫耐药性产生的原因 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 药物选择压力 |
| 1.2.3 生物学因素 |
| 1.3 鸡球虫耐药性的研究现状 |
| 1.4 其他顶复门原虫耐药性的研究现状 |
| 1.5 全基因组重测序 |
| 1.6 选择性清除 |
| 1.7 展望 |
| 第二章 全基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药相关基因 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 试验药物 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 子孢子的收集与纯化 |
| 2.2.7 基因组重测序 |
| 2.2.8 选择性清除分析结果与转录组测序结果的关联分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 虫体的收集与纯化 |
| 2.3.2 DNA的提取检测 |
| 2.3.3 质控结果 |
| 2.3.4 样品与参考基因组比对结果 |
| 2.3.5 基于Hp&Fst的选择消除分析结果 |
| 2.3.6 候选基因SNP位点的分布 |
| 2.3.7 基因功能富集分析 |
| 2.3.8 与转录组的关联分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 3 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物和实验虫株 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.2.4 敏感株孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 3.2.5 cDNA第一链模板的制备 |
| 3.2.6 基因克隆 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 3个耐药相关基因功能特性的初步分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与细胞 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 实验虫株的收集与纯化 |
| 4.2.6 cDNA模板的制备 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.10 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.2.11 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.12 实时荧光定量PCR |
| 4.2.13 间接免疫荧光定位 |
| 4.2.14 体外抑制实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的反应原性分析 |
| 4.3.5 3个基因在DS不同发育阶段的mRNA转录水平 |
| 4.3.6 三个蛋白在DS虫体上的定位分析 |
| 4.3.7 三个多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验 |
| 4.3.8 3个基因在不同耐药株和敏感株的转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）田鼠巴贝斯虫体外培养分泌抗原的筛选及功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 田鼠巴贝斯虫简介 |
| 1.1.2 田鼠巴贝斯虫的传播方式及生活史 |
| 1.1.3 田鼠巴贝斯虫入侵机制的研究 |
| 1.1.4 顶复门原虫分泌蛋白概述 |
| 1.1.5 田鼠巴贝斯虫分泌蛋白概述 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 虫株、血清和试验动物 |
| 2.1.2 菌种、细胞株与质粒 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.1.5 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 生物信息学网站及工具 |
| 2.2.2 田鼠巴贝斯虫体外培养的建立 |
| 2.2.3 Real-time PCR检测方法的建立 |
| 2.2.4 田鼠巴贝斯虫体外培养上清的质谱分析 |
| 2.2.5 SA1与GPI10 基因全长及表达片段的扩增和克隆测序 |
| 2.2.6 SA1与GPI10 原核表达及免疫特性研究 |
| 2.2.7 SA1和GPI10 的细胞定位 |
| 2.2.8 SA1和GPI10 的红细胞结合试验 |
| 2.2.9 SA1和GPI10 的花环试验 |
| 2.2.10 SA1和GPI10 抗体中和试验 |
| 3 试验结果与分析 |
| 3.1 田鼠巴贝斯虫体外培养 |
| 3.1.1 BALB/c鼠感染田鼠巴贝斯虫实验动物模型 |
| 3.1.2 Real-Time PCR检测方法的建立 |
| 3.1.3 田鼠巴贝斯虫的体外培养生长曲线 |
| 3.2 田鼠巴贝斯虫体外培养上清的质谱分析 |
| 3.2.1 田鼠巴贝斯虫体外培养上清的银染分析 |
| 3.2.2 质谱结果分析 |
| 3.3 SA1和GPI10 基因的扩增及克隆测序 |
| 3.3.1 SA1和GPI10 基因的全长扩增与克隆 |
| 3.3.2 SA1和GPI10 基因的全长序列的测定 |
| 3.3.3 SA1和GPI10 基因的分子进化分析 |
| 3.3.4 SA1与GPI10 序列的生物信息学分析 |
| 3.4 SA1和GPI10 的原核表达与抗原性分析 |
| 3.4.1 原核表达质粒的构建 |
| 3.4.2 SA1与GPI10 的原核表达与反应原性分析 |
| 3.4.3 SA1 天然蛋白存在形式的检测与免疫原性分析 |
| 3.4.4 GPI10 天然蛋白存在形式的检测与免疫原性分析 |
| 3.5 SA1和GPI10 的功能鉴定 |
| 3.5.1 SA1和GPI10 的细胞定位 |
| 3.5.2 rSA1和rGPI10 的红细胞结合试验 |
| 3.5.3 SA1与GPI10 的花环试验 |
| 3.5.4 Anti-SA1和Anti-GPI10 对田鼠巴贝斯虫体外生长的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 田鼠巴贝斯虫体外培养 |
| 4.2 田鼠巴贝斯虫体外培养上清质谱结果分析 |
| 4.3 SA1和GPI10 基因克隆、生物信息学分析及原核表达 |
| 4.4 SA1和GPI10 的功能验证 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者在攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（3）巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 巨型艾美耳球虫的危害及防控现状 |
| 1 巨型艾美耳球虫(Eimeria. maxima)生活史 |
| 2 巨型艾美耳球虫的流行情况 |
| 3 巨型艾美耳球虫病的症状及病理变化 |
| 4 鸡球虫病的防治现状 |
| 5 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 巨型艾美耳球虫4种侵入相关抗原研究进展 |
| 1 鸡艾美耳球虫表面蛋白 |
| 2 鸡艾美耳球虫延伸因子2 |
| 3 鸡艾美耳球虫14-3-3蛋白 |
| 4 鸡艾美耳球虫棒状体蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmSAG基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmSAG基因的克隆结果 |
| 2.3 重组质粒pMD19-T-SAG的鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒pET-32a(+)-SAG的构建和鉴定 |
| 2.5 重组SAG蛋白的诱导表达以及纯化 |
| 2.6 Wester blot分析 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-EmSAG的构建和鉴定 |
| 2.8 DNA疫苗pVAX-EmSAG在鸡体内表达的检测 |
| 2.9 EmSAG蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.10 EmSAG基因免疫保护试验结果 |
| 2.11 EmSAG免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.12 EmSAG免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.13 EmSAG免疫诱导鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文章 |
| 第四章 巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmEF2基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmEF2基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-EF2的构建和鉴定 |
| 2.4 重组EF2蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-EmEF2的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmEF2在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmEF2免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmEF2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏T淋巴细胞亚群变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em14-3-3基因的生物信息学分析 |
| 2.2 14-3-3 PCR扩增和克隆 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-14-3-3的构建 |
| 2.4 重组14-3-3蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 Em14-3-3蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.9 Em14-3-3的免疫保护试验结果 |
| 2.10 Em14-3-3免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.11 Em14-3-3免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.12 Em14-3-3刺激鸡脾脏T淋巴细胞百分含量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmRON基因的克隆和序列分析 |
| 2.2 EmRON基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-RON的构建和鉴定 |
| 2.4 重组RON蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX-EmRON的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmRON在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmRON免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmRON免疫诱导血清抗体和细胞因子 |
| 2.10 鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表情况 |
| 致谢 |
（4）基于双特异性抗体的热带传染病快速侦检方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的活性检测 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法与步骤 |
| 结果 |
| 第二部分 用于热带病病原体检测的基因工程抗体的构建、表达及检测 .. |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病病原体检测中的应用 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（5）毒害艾美耳球虫3个发育阶段的比较转录组学研究与差异表达基因的克隆表达和功能鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、球虫与疟原虫的分化与发育研究进展 |
| 1 球虫性别分化的研究 |
| 2 疟原虫性别分化和发育的研究 |
| 二、高通量测序及其在寄生虫研究中的应用 |
| 1 高通量测序的发展 |
| 2 高通量测序在寄生虫研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 第一章 毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的分离与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子与配子体的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子比较转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫第三代裂殖子和配子体比较转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 差异表达基因的原核表达及免疫荧光定位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 重组蛋白rEnHAP2免疫保护效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（6）恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质PF3D70811600的表达及功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 恶性疟原虫裂殖子入侵相关蛋白的研究进展 |
| 1.1 恶性疟原虫的生活史和致病机理 |
| 1.2 裂殖子入侵红细胞的过程 |
| 1.3 裂殖子入侵红细胞相关蛋白的研究 |
| 1.4 红细胞表面多糖受体的研究 |
| 1.5 问题与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 荧光定量PCR检测PF3D7_0811600基因在恶性疟原虫3D7株红内期的转录规律 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 恶性疟原虫PF3D7_0811600重组蛋白质的表达纯化及其多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600在红内期虫体的表达和定位分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600的功能分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质（PF3D70811600）的表达纯化及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和虫体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 恶性疟原虫的培养 |
| 1.4 提取基因组DNA |
| 1.5 PCR扩增获得目的基因 |
| 1.6 基因克隆及原核表达 |
| 1.6.1 克隆载体的构建 |
| 1.6.2 p ET-28a和p GEX-4T-1重组质粒的构建 |
| 1.6.3 重组蛋白质的表达与纯化 |
| 1.7 多克隆抗体的制备 |
| 1.8 Western blot检测多克隆抗体的特异性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因的克隆 |
| 2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组质粒的表达与纯化 |
| 2.4 多克隆抗体的鉴定 |
| 2.4.1 ELISA方法检测抗血清效价 |
| 2.4.2 Western Blot检测多抗的特异性 |
| 3 讨论 |
（8）恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白 MSPDBL1和 MSPDBL24 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 恶性疟原虫 MSPDBL2-DBL2 结构域的原核表达和抗原性分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 中缅边境恶性疟原虫 PFMSPDBL2 基因多态性分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1. 疟原虫入侵红细胞和红细胞黏附的相关过程 |
| 2. 恶性疟原虫中的 DBL（Duffy binding-like）结构域超家族 |
| 3. 展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 硕士在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）恶性疟原虫Pf332抗原的免疫原性分析（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 恶性疟原虫蛋白质组学研究进展 |
| 1.1 恶性疟原虫生活史不同发育期蛋白质组学 |
| 1.2 恶性疟原虫亚蛋白质组学研究 |
| 1.3 恶性疟原虫蛋白质组的翻译后修饰 |
| 1.4 结语 |
| 第2章 恶性疟原虫表面抗原及其致病机理 |
| 2.1 环状体红细胞表面抗原(Ring surface protein,RSP) |
| 2.2 恶性疟原虫红细胞表面抗原1（PfEMP1） |
| 2.3 Rifin 抗原 |
| 2.4 Pf332 抗原 |
| 2.5 STEVOR 抗原 |
| 2.6 CLAG(Cytoadherence linked asexual gene)抗原 |
| 2.7 SURFIN 抗原 |
| 2.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 恶性疟原虫Pf332-DBL 区重组蛋白质的表达及纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 抗Pf332-DBL 区重组蛋白质单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 抗Pf332-DBL 区重组蛋白质单克隆抗体的功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Pf332-DBL 区重组蛋白质免疫原性的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（10）第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分:多表位随机嵌合基因文库的构建及其免疫原性评价 |
| 第二部分:多表位嵌合抗原疫苗的筛选及其功能性分析 |
| 第三部分:应用免疫亲和层析柱对多表位嵌合抗原的纯化通用性的探索 |
| 第四部分:Hydroethidine-流式细胞术法相对定量分析恶性疟原虫虫血率及其生长周期 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达（论文参考文献）
- [1]基于基因组重测序筛选柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药的候选基因及耐药相关基因特性研究[D]. 姚亚文. 中国农业科学院, 2021
- [2]田鼠巴贝斯虫体外培养分泌抗原的筛选及功能鉴定[D]. 李慕晓. 华中农业大学, 2019
- [3]巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究[D]. 刘亭岐. 南京农业大学, 2018(07)
- [4]基于双特异性抗体的热带传染病快速侦检方法的研究[D]. 赵笑. 第二军医大学, 2017(01)
- [5]毒害艾美耳球虫3个发育阶段的比较转录组学研究与差异表达基因的克隆表达和功能鉴定[D]. 宿世杰. 扬州大学, 2018(05)
- [6]恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质PF3D70811600的表达及功能分析[D]. 周健华. 吉林大学, 2016(09)
- [7]恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质（PF3D70811600）的表达纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 周健华,魏晓燕,常志广,姜宁,陆慧君,陈启军. 吉林农业大学学报, 2016(02)
- [8]恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析[D]. 仰梦佳. 苏州大学, 2014(05)
- [9]恶性疟原虫Pf332抗原的免疫原性分析[D]. 杜承. 吉林大学, 2010(08)
- [10]第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选[D]. 曲久鑫. 中国协和医科大学, 2010(09)