一、异体角膜对人外周血T细胞及其亚群CD_(69)分子表达的体外调节（论文文献综述）
丁黎莉[1]（2021）在《白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是胰酶在体内异常激活所导致的局部或全身性炎症反应。促炎免疫与抗炎免疫系统失衡是促进疾病进展的重要机制。髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell,MDSC）是骨髓来源的调节性免疫细胞,可通过精氨酸酶（Arginase）-1、活性氧（reactive oxygen species,ROS）、免疫抑制性受体（immune receptors,IRs）等机制发挥免疫抑制作用。含免疫球蛋白和ITIM基序的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Lg and ITIM domains,TIGIT）作为一种新型的IRs,对T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）的功能产生一定影响。但是TIGIT在AP中T细胞上表达的变化及其作用目前尚无报道。白介素（interleukin,IL）-37是新发现的抗炎因子,可通过诱导调节性免疫细胞表型转化等方式发挥抗炎作用。我们在预实验中发现AP患者血浆中IL-37升高。本研究通过分析AP患者体内MDSC、IL-37的变化,结合体外实验进一步阐释IL-37通过影响MDSC的抑制功能,影响AP的发生发展的作用及其机制,为AP的治疗提供新的思路。研究方法:（1）应用流式细胞分析法（flow cytometry,FCM）测定患者及健康对照组（healthy control,HC）中HLADR-CD11b+MDSC及其亚群CD66b+CD14-粒细胞样及CD66b-CD14+单核细胞样MDSC比例与数目,并分析与APACHE II评分、C-反应蛋白、住院天数（length of stay,LOS）的相关性。应用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色测定T细胞增殖法分析HC来源与重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）来源的MDSC的抑制功能。应用FCM进一步分析及来源的Arg-1、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及MDSC表面CD155的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）表达有无差异。（2）应用FCM测定HC及AP患者外周血中CD3+T细胞及其亚群CD4+、CD8+T细胞比例、数量。测定HC与来AP来源的CD3+T细胞及其亚群CD4+、CD8+T细胞中的IFN-γ的比例及细胞表面TIGIT的差异。分析CD3+T细胞及其亚群细胞表面TIGIT表达与IFN-γ的表达、细胞增殖能力之间的关系。（3）应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定HC、AP患者血浆IL-37浓度,并检测其与APACHE II评分、MDSC之间的相关性。体外分析IL-37处理组与未处理组的MDSC的比例、Arg-1、ROS及MDSC表面CD155的表达变化。将IL-37处理的与未处理的MDSC细胞分别与T细胞共培养,检测各孔细胞增殖率。将HC及SAP来源的MDSC与TIGIT+及TIGIT-细胞分别共培养,检测各组细胞的增殖率变化,揭示抑制细胞可能机制。研究结果:（1）AP患者外周血中MDSC细胞及其亚群G-MDSC、M-MDSC在外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中比例及绝对计数增加,且与APACHE II评分、C-反应蛋白正相关。SAP患者来源的MDSC对CD3+T细胞抑制作用增强。SAP来源的MDSC较HC组的Arg-1、ROS、CD155表达升高。（2）AP患者外周血中CD3+T细胞及其CD4+、CD8+亚群在PBMC中比例及数量减少,且各T细胞亚群IFN-γ分泌减少。AP患者外周血T细胞表面TIGIT表达比例较HC组降低。TIGIT+T细胞较TIGIT-T细胞IFN-γ分泌增多,细胞增殖能力增强。（3）AP患者血浆中IL-37浓度较HC升高,与MDSC呈负性相关。IL-37在体外不能诱导PBMC中细胞向MDSC转化,但是可以增强MDSC对T细胞的抑制作用。IL-37在体外降低MDSC的ROS、CD155的表达,对Arg-1表达强度无影响。阻断ROS降低MDSC表面CD155的表达。MDSC对TIGIT+T细胞具有抑制功能,而对TIGIT-T细胞无抑制功能。研究结论:本研究发现MDSC在AP患者体内增多,且MDSC抑制功能增强,且与疾病严重程度正相关,MDSC对T细胞的抑制作用可能是通过CD155/TIGIT途径实现的。AP患者外周血中IL-37因子升高,IL-37增强MDSC对T细胞的抑制作用,其增强作用机制尚不明确。本研究为探究AP的发病机制提供了新的思路,为阻止AP进展为SAP提供了新的理论依据。
王亦心[2]（2021）在《利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答》文中研究说明研究目的:流感病毒属于正粘病毒科,分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒（Influenza A viruses,IAVs）是导致人类流感大流行的主要原因,对公众健康造成潜在威胁。目前对于IAVs主要的预防措施是应用流感病毒疫苗,但是由于存在抗原漂移及抗原突变的情况,使得这种方式难以发挥较好的保护作用,并且一种疫苗难以针对不同种病毒毒株进行中和。很多研究发现组织定居记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells,Trm cells）可能对于抵抗流感病毒感染有一定的作用,因此近些年针对于T细胞疫苗的研究也逐渐开展。甲型流感病毒的研究主要依赖于小鼠模型,但小鼠的肺组织结构及细胞比例与人肺脏存在一定的差异,因此小鼠的肺脏在感染后的免疫变化可能无法完全反应在人肺中的情况。而轻、中度流感病毒患者的肺组织样本往往难以取材,多数样本来源于癌旁组织及器官捐献,这些样本难以进行流感病毒感染期间肺内免疫细胞的动态观察研究。因此我们在给NCG免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统（human immune system,HIS）的基础上,同时在鼠背部皮下移植同源HL组织,建立人免疫系统-人肺小鼠（HIS with autologous lung xenograft,HISL mice）模型。通过对移植后的人肺脏组织进行甲型流感病毒感染,来研究人肺中以及各个器官在感染之后的免疫应答情况,探究此模型的重要临床意义。研究方法:（1）通过给NCG小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织、背部皮下移植同源肺脏组织（HL）及尾静脉注射同源肝脏来源CD34+造血干细胞,建立HISL小鼠模型;（2）给予HISL小鼠皮下人肺移植物接种H1N1病毒,对照组给予PBS等体积接种,研究两组小鼠免疫细胞的变化、特异性抗体的产生、转录组的特征及差异;（3）给予HISL小鼠皮下HL预先接种H1N1病毒,再给予HISL小鼠致死剂量H1N1病毒经鼻接种,探求预先接种对于HISL小鼠接受致死剂量H1N1经鼻感染后的保护作用。研究结果:（1）给予接受全身辐照后的NCG小鼠肾被膜下胚胎胸腺组织移植、皮下同源胚胎肺组织移植、尾静脉注射同源胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞后,成功建立HISL小鼠模型,其人CD45+细胞嵌合比例可达90%以上,以T细胞、B细胞为主,髓系细胞、自然杀伤细胞比例较低;小鼠皮下移植的HL组织在模型建立成功后可见其具有与成人肺中相似的、完整的呼吸性气道等结构。（2）H1N1病毒感染小鼠皮下移植的人肺组织后,H1N1组HISL小鼠人肺中的HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞比例显着高于对照组,且H1N1组小鼠HL中CD4+Trm、CD8+Trm水平较PBS组显着升高,其水平与HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞的比例呈正相关;H1N1组HISL小鼠HL中HLA-A*0201限制性H1N1抗原特异性的CD8+T细胞的比例相比对照组显着升高;H1N1组HISL小鼠血清中产生病毒特异性的Ig、IgG抗体;两组小鼠人肺的转录组测序后表达基因存在显着差异,H1N1组小鼠HL中H1N1流感病毒感染相关、免疫相关的基因表达显着上调。（3）HISL小鼠皮下HL经过5000TCID50 H1N1病毒单次接种后,再次给予小鼠致死剂量（5000TCID50）病毒的经鼻接种,小鼠死亡;预先给予HISL小鼠多次500 TCID50 H1N1病毒皮下HL内接种,小鼠在经过致死剂量流感病毒经鼻感染后生存时间较对照组显着延长。研究结论:（1）HISL小鼠模型可实现对人肺脏组织结构、免疫细胞水平及变化等的研究。（2）HISL小鼠可研究人肺脏组织在流感病毒感染后人肺中的免疫细胞的变化,可进一步研究其中T细胞亚型的特点、基因组的差异以及血清中特异性抗体的产生。（3）多次低剂量H1N1病毒预先感染HISL小鼠皮下HL可提供一定的保护作用,延长该小鼠在接受致死剂量病毒经鼻感染后的生存时间,并提高其生存率。综上所述,本课题首次建立了可用于流感病毒研究的人肺脏组织及免疫系统的小鼠模型,为后期进一步研究感染后免疫系统的变化、T细胞表型特点、特异性抗体的产生、转录水平的差异等提供了有力的工具,并对后期疫苗的研发及其他肺部感染性疾病的研究等具有重要意义。
吕梦楠[3]（2021）在《三氧化二砷对T细胞介导的免疫性肝损伤及急性GVHD的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:三氧化二砷（Arsenic trioxide,ATO）在治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）方面取得了良好效果。其涉及的机制主要是诱导分化和诱导凋亡的双重作用。近年来,有许多研究表明ATO在多种免疫性疾病中都有治疗作用,例如系统性红斑狼疮,溃疡性结肠炎及固体器官移植后的移植排斥反应等。ATO可促进CD4+,CD8+T细胞凋亡,抑制T细胞增殖反应,增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例并显着降低IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17等细胞因子水平。异基因造血细胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）后,移植物抗宿主病（Graft-versus-hostdisease,GVHD）是一种常见的并发症。由于供体T细胞是GVHD的主要效应细胞,因此抑制T细胞应答是预防及治疗GVHD的标准治疗方法。多项研究表明,细胞糖代谢会影响T细胞的分化和功能,靶向T细胞糖代谢有可能成为治疗GVHD的新方法。有研究利用人类蛋白质组芯片发现砷剂可特异性结合糖酵解途径中的蛋白质。因此,我们想要探究ATO 在急性 GVHD（Acute graft-versus-host disease,aGVHD）中的治疗作用并进一步阐明作用机制是否与T细胞糖代谢相关。研究目的:1.研究ATO对T细胞增殖活化、分化及凋亡的影响及ATO在aGVHD中的治疗作用;2.研究ATO治疗aGVHD的机制及其对T细胞糖代谢的影响。研究方法:于体外给予刀豆蛋白A（ConcanavalinA,ConA）、CD3/CD28活化磁珠及混合淋巴细胞培养（Mixed lymphocyte culture,MLC）刺激小鼠及正常供者T细胞增殖并予不同浓度ATO行T细胞增殖抑制实验。流式细胞术检测ATO对T细胞凋亡情况的影响。我们于体内建立了 ConA诱导的免疫性肝损伤模型,并对小鼠进行肝功能、病理学检查,流式细胞术检测各组小鼠肝脏及脾脏中淋巴细胞的组成及活化。通过在已知靶蛋白晶体库中虚拟筛选检测ATO的结合靶点并应用RT-PCR技术检测脾脏T细胞糖酵解途径相关酶类的表达。同时,我们也建立了 MHC不匹配的allo-HSCT模型,观察各组小鼠生存时间,GVHD评分及病理学检查,采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群及活化,RT-PCR检测脾脏T细胞编码糖酵解途径相关酶类的mRNA表达水平。Legendplex多因子检测盒检测两种小鼠模型血清中12种细胞因子水平。研究结果:1.于体外,ATO可降低ConA、CD3/CD28活化磁珠及MLC诱导的小鼠及正常供者T细胞增殖,且ATO对T细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。另外,在T细胞稳态及活化增殖情况下,1-2μmol/L的ATO可显着诱导T细胞凋亡且呈剂量依赖性,随着三氧化二砷浓度的升高,存活的CD4+T细胞比例逐渐升高而CD8+T细胞比例逐渐降低。2.小鼠尾静脉注射ConA（20mg/kg）建立免疫性肝损伤模型,应用ATO后可明显升高小鼠生存率,降低肝酶水平并减轻肝脏病理中所示的肝细胞坏死及炎性细胞浸润。进一步分析肝脾淋巴细胞比例及数量,ATO治疗12h后可明显减少肝脾细胞中T细胞、NKT细胞的浸润、升高调节性T细胞（Regulatory T cell,treg）及髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSC）细胞比例。另外ATO可减少免疫性肝损伤小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10等细胞因子水平。通过虚拟筛选我们发现ATO的结合靶点之一是糖酵解途径中的6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3（Phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,Pfkfb3）。利用RT-PCR验证了 ATO可以降低疾病小鼠T细胞糖酵解途径中己糖激酶-2（Hexokinase-2.HK2）、乳酸脱氢酶 a（Lactate dehydrogenase a,LDHa）、乳酸脱氢酶b（Lactate dehydrogenase b,LDHb）、Pfkfb3、葡萄糖转运蛋白 1（Glucose transporter 1,Glut1）、单羧酸转运蛋白 4（Monocarboxylate transporter 4,MCT4）、磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase,Tpi）、丙酮酸激酶 2（Pyruvatekinase 2,PKM2）、血小板同种型磷酸果糖激酶（The platelet isoform of phosphofructokinase,Pfkp）、肝脏磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase,liver type,Pfk1）、磷酸甘油酸变位酶 1（Phosphoglycerate Mutase 1,Pgaml）、烯醇化酶（Enolase,Enol）、葡萄糖磷酸异构酶（Glucose phosphate isomerase,Gpi）的表达。同时,ATO也降低了体外增殖的T细胞HK2、Pfkfb3、MCT4、Gpi的表达。3.ATO可延长aGVHD小鼠生存期、降低aGVHD评分并减轻aGVHD病理表现。移植后14d,三氧化二砷可降低脾脏内供者CD3+T细胞,抑制CD4+、CD8+效应记忆T细胞（Effector memory T cell,Tem）细胞产生,抑制Th1细胞分化而促进treg细胞分化,减少CD8+T细胞分泌穿孔素并降低IL-6、IFN-γ、TNF-α等细胞因子。利用RT-PCR也验证了 ATO可以降低aGVHD小鼠T细胞糖酵解途径中T细胞 HK2、Pfkfb3、MCT4、Gpi、Glut1、LDHa 的表达。研究结论:ATO可通过影响细胞因子分泌、T细胞的分化与活化,抑制T细胞增殖并促进T细胞凋亡减轻ConA诱导的免疫性肝损伤及aGVHD,而这可能与ATO抑制T细胞的糖酵解途径相关。[目的]比较自体造血干细胞移植（auto-HSCT）和同胞全相合造血干细胞移植（MSD-HSCT）治疗费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）的疗效,为患者移植方式的选择提供依据。[方法]回顾性总结2008年1月至2017年12月于中国医学科学院血液病医院行auto-HSCT（31例）及MSD-HSCT（47例）的78例Ph+ALL患者的临床特征,比较不同移植方式患者的生存（OS）率、无白血病生存（LFS）率、累积复发率（CIR）及非复发死亡率（NRM）,并观察3个月内实现完全分子学缓解（CMR）并持续至移植（s3CMR）对不同移植方式预后的影响。[结果]auto-HSCT组、MSD-HSCT组粒细胞植入的中位时间分别为12（10～29）d、14（11～24）d（P=0.006）,血小板植入的中位时间分别为17.5（10～62）d、17（10～33）d（P=0.794）。MSD-HSCT组中,Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生率分别为27.7%（13/47）和8.5%（4/47）,局限型和广泛型慢性 GVHD 的发生率为 17.0%（8/47）和 12.8%（6/47）。auto-HSCT 组、MSD-HSCT组3年CIR、NRM、LFS差异均无统计学意义（P值均>0.05）。在达到s3CMR的44例患者中,auto-HSCT组和MSD-HSCT组的3年OS率[（84.0±8.6）%对（78.0±8.7）%,P=0.612]、LFS 率[（70.3±10.3）%对（68.2±10.1）%,P=0.970]、CIR[（24.9±10.0）%对（14.4±8.0）%,P=0.286]NRM[（4.7±4.7）%对（17.4±8.1）%,P=0.209]差异均无统计学意义;未达到s3CMR的34例患者中,auto-HSCT组与MSD-HSCT 组相比,3 年 CIR 明显升高[（80.0±14.7）%对（39.6±10.9）%,P=0.057]。结论 对于化疗后达s3CMR的Ph+ALL患者,auto-HSCT是一种有效的巩固治疗选择,与MSD-HSCT疗效相当;对于未达到s3CMR的患者,MSD-HSCT复发率更低。[结论]对于化疗后达s3CMR的Ph+ALL患者,auto-HSCT是一种有效的巩固治疗选择,与MSD-HSCT疗效相当;对于未达到s3CMR的患者,MSD-HSCT复发率更低。
程纪伟[4]（2020）在《组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响》文中研究说明食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤,位居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位。食管癌发病高风险区发病率可达低风险区的500倍,表现出明显的地区差异性,其中我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。因此,寻找新的食管癌防治手段是我国食管癌研究领域的重要课题。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。提示,阐明肿瘤浸润关键免疫细胞亚群及其与肿瘤微环境的交互作用机制是进行有效免疫治疗干预的关键。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。因此,本研究拟依托临床生物样本资源优势,以人食管癌组织特异性记忆T细胞为切入点,试图探明食管癌浸润TRM细胞生物学特征,从而为寻找新的食管癌防治方法提供新的思路。第一部分食管癌TILs细胞亚群构成研究研究背景食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤。我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。我们通过单细胞分析平台Cytobank对食管癌及配对正常组织浸润 T 细胞进行 SPADE（Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events,SPADE）分析发现,人食管癌组织内CD8+TRM细胞（CD8+CD103+CD69+TRM细胞）含量较正常组织明显增高,通过传统设门分析方法我们同样确认了人CD8+TRM细胞特异性表达于食管癌组织及配对正常食管组织,且人食管癌组织CD8+TRM细胞含量较正常组织明显增高。以上初步研究结果提示:CD8+TRM细胞的异常增高是人食管癌炎性微环境内T细胞组成改变的非常重要的一个特征。因此,进一步探明CD8+TRM细胞在人食管癌免疫微环境中的作用及其参与肿瘤免疫应答及调控的潜在机制,能为寻找靶向干预食管癌免疫微环境关键细胞的免疫治疗新策略提供方向。目的探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。方法这部分研究工作将在医院伦理委员会批准和患者知情同意下,告知患者研究相关事项并签署知情同意书后,首先收集食管癌手术患者配对新鲜肿瘤组织和相对正常食管组织,通过原代组织浸润淋巴细胞分离方法制备单细胞悬液。然后通过多色荧光抗体标记,高通量多色流式检测食管癌及配对正常组织内TILs细胞及其亚群表达情况,探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。为下一步分离并鉴定食管癌CD8+TRM细胞在食管癌组织内的分布及特征奠定基础。结果（1）对人食管癌及配对正常组织CD3+T细胞SPADE分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。（2）流式设门分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。结论CD8+TRM细胞在人食管癌组织显着富集。第二部分食管癌浸润CD8+TRM细胞亚群、分布、表型及生物学特征研究研究背景目前TRM细胞被认为具有以下特征:（1）具有长时期自我更新能力;（2）大量表达于上皮粘膜等免疫屏障组织;（3）识别微生物产物、细胞因子、危险信号分子及应激相关配体;（4）快速分泌多种炎症因子。经典的感染免疫学研究显示,在初始感染后小鼠阴道粘膜CD8+TRM细胞能够快速识别病原并产生特异性免疫记忆;而再次接触同类抗原的时候通过分泌大量细胞因子促进体液免疫应答、DC细胞成熟及自然杀伤细胞活化。提示TRM细胞广泛参与机体多种免疫应答的调节。但其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。我们前期的研究发现CD8+TRM细胞在人食管癌组织内显着增高,加之先前的研究显示CD8+TRM细胞在慢性炎症模型中能够启动固有免疫及获得性免疫,并能对多种免疫应答进行调控。由此我们推测CD8+TRM细胞是人食管癌炎症免疫失调及肿瘤进展的关键因素之一。目的这部分研究工作重点通过多种CD8+TRM细胞相关细胞表面标记抗体,运用多色流式检测分析技术,检测食管癌及其配对正常组织单细胞悬液内CD8+TRM细胞的亚群、组织分布及其他表型特征。阐明食管癌组织浸润CD8+TRM细胞的组织分布、分化相关表型表达特征。从而初步明确其分化表型及组织趋向性等基本生物学特征。为进一步明确其在食管癌相关炎症组织中功能重塑及进一步极化的调控机制打下基础。方法（1）食管癌浸润CD8+TRM细胞组织分布特征检测:取手术切除新鲜配对食管癌及正常组织,无菌环境制备单细胞悬液,然后通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69）,分析不同组织CD8+TRM细胞比例及数量。（2）分化相关表型鉴定:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、CD45RA、CD45RO）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞分化相关表型特征。（3）免疫检查点分子检测:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、PD-1、Tim-3）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞免疫检查点分子表达特征。结果（1）食管癌肿瘤浸润T细胞以CD4和CD8细胞为主,因此我们对人食管癌配对组织CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞进一步分析显示,食管癌患者配对正常食管组织及肿瘤中均表达较高比例的CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞。然而,统计学分析显示人食管癌组织CD8+TRM细胞比例和绝对数量均较配对正常组织均显着增高（P<0.0001）。相反,虽然CD4+TRM细胞数量在食管癌组织也呈增高趋势,但其在人食管癌组织中比例较配对正常食管组织却呈降低趋势。（2）我们对人食管癌及配对正常组织CD3+TRM细胞的研究显示,人食管癌浸润CD3+TRM细胞较正常配对组织显着增高。进一步分析显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞主要以CD8+TRM细胞和CD4+TRM细胞为主,仅有少量TRM细胞亚群为γδT细胞和iNKT细胞。更重要的是我们对肿瘤组织TRM细胞亚群的平行比较发现,人食管癌浸润CD8+TRM细胞在比例和数量上较其余TRM细胞亚群均占有绝对优势。（3）基于小鼠慢性自身免疫性疾病模型的研究显示,持续存在于病变组织的CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭状态（Immune exhaustion）,且能持续募集促炎性CD4+Th细胞及巨噬细胞。提示,在慢性炎症持续存在的情况下CD8+TRM细胞发生免疫耗竭,并进一步促进局部炎症反应。我们的研究显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞以效应记忆T细胞（Effector memory T cells,TEM）及中央型记忆T细胞（Central memory T cells,TCM）为主,进一步研究显示,人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。我们通过viSNE（visual stochastic network embedding,viSNE）分析也同样证实 了人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。提示,人食管癌炎性免疫微环境内某些因素促进CD8+TRM细胞免疫耗竭。而肿瘤微环境内慢性炎症的持续存在已被公认与肿瘤免疫调控失衡密切相关。因此,我们有理由相信人食管癌组织CD8+TRM显着增高并表现为免疫耗竭状态这一现象与肿瘤炎性微环境稳态失衡有密切关联。结论（1）CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位。（2）人食管癌浸润CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭表型。第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究研究背景以上研究证明CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位,通过分析食管癌浸润CD8+TRM细胞数量与肿瘤临床特征及预后的相关性,为靶向干预食管癌相关炎症免疫调节的关键细胞（分子）提供新的思路,也为临床运用CD8+TRM细胞作为食管癌预后预测指标及靶向干预CD8+TRM细胞介导的食管癌免疫抑制提供了潜在可能性,具有临床转化意义。目的这部分研究工作重点将应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测,结合患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期、临床病理特征的相关性。从而明确人CD8+TRM细胞与食管癌临床病理特征及预后的相关性。方法（1）应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测。（2）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者临床病理特征的相关性分析:收集患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期及其他临床病理特征的相关性。（3）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者预后相关性分析:应用既往患者食管癌组织芯片免疫组织化学染色的方法,分析CD8+TRM细胞数量与患者预后的关系。结果（1）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者总生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）（2）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者无病生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）结论（1）CD8+TRM细胞高表达的食管癌患者预后良好,CD8+TRM细胞可以作为一个判断食管癌患者预后的生物学指标。（2）CD8+TRM细胞可以作为预测指标筛选接受免疫治疗临床实验的食管癌患者。
周长军[5]（2020）在《活化的淋巴细胞和细胞因子检测对于鉴别活动性、潜伏性结核感染和健康人群的临床价值分析》文中研究说明目的:评价淋巴细胞亚群、活化的淋巴细胞以及胞外细胞因子检测对于鉴别活动性、潜伏性结核患者（活动组、潜伏组）及健康人群（健康组）的临床价值。方法:收集41例初诊肺结核患者活动组、24例潜伏组及30例健康组外周静脉抗凝全血,用流式细胞术检测全血标本中淋巴细胞亚群、活化的淋巴细胞百分比,用流式微球阵列法检测血浆中细胞因子水平;通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）和二元logistic回归分析比较各指标在肺结核的诊断及鉴别诊断潜伏性和活动性肺结核中的临床价值。结果:相较于潜伏组,活动组外周血中调节性T细胞（Treg）（7.75±2.24%vs6.15±1.47%,P<0.01）和γ干扰素（IFN-γ）水平（2.65±0.80 pg/ml vs 2.06±0.31pg/ml,P<0.01）显着升高;相较于健康组,活动组和潜伏组外周血中CD3+HLA-DR+细胞（分别为5.34±7.64%和4.10±3.39%vs 1.74±0.73%,P<0.01）、CD4+HLA-DR+细胞（分别为2.18±2.47%和1.47±0.91%vs 0.68±0.36%,P<0.01）、CD8+HLA-DR+细胞（分别为2.66±5.11%和2.12±2.06%vs 0.88±0.44%,P<0.05）及IL-6水平（分别为3.25±2.94 pg/ml和5.05±6.20 pg/ml vs 1.78±0.97 pg/ml,P<0.01）均显着升高,而CD8+CD28+细胞和NK细胞水平显着降低;此外,活动组的CD4+/CD8+、Treg细胞、CD16+CD56+CD69+细胞和IFN-γ水平也高于健康组。而在鉴别活动组和潜伏组时,联合Treg细胞、IFN-γ的ROC曲线下面积（AUC）为0.848;在鉴别潜伏组和健康组时,联合CD3+T细胞、CD4+HLA-DR+细胞和IL-6的AUC值为0.923;在鉴别活动组和健康组时,联合CD3+HLA-DR+细胞、CD4+HLA-DR+细胞和IL-6时AUC值为0.932。结论:联合检测淋巴细胞亚群、活化的淋巴细胞以及胞外细胞因子能有效区分结核分枝杆菌感染以及感染的潜伏期和活动期,对于结核病的诊断以及活动性和潜伏性肺结核的鉴别诊断具有临床应用价值。
李智德[6]（2020）在《PD-1经T细胞介导泡型包虫病免疫耐受的临床和实验研究》文中指出目的:泡型包虫病（Alveolar Echinococcosis,AE）有浸润性生长和芽生增殖的特点,素有“虫癌”之称。第二信号中的抑制性信号参与多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis,E.multilocularis）和人体的相互作用,影响免疫反应、寄生结局和疾病发生发展转归整个过程。本研究旨在:1)探讨免疫抑制性分子程序性死亡因子-1（programmed death receptor-1,PD-1）通过T细胞介导AE患者和E.multilocularis感染小鼠免疫耐受的机制;2)探讨阻断E.multilocularis感染小鼠中PD-1/PD-L1信号通路后的作用及其机制,PD-1成为新的免疫靶点治疗E.multilocularis感染的可行性。方法:第一部分,经门静脉注射细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,E.granulosus）原头蚴（protoscoleces,PSCs）感染C57BL/6小鼠,利用病理相关技术、流式细胞术（flow cytometry,FCM）,对比与E.multilocularis感染C57BL/6小鼠病理与免疫的异同点。第二部分,1)采集20例AE患者的术后肝脏标本,病理切片观察病理改变;收集患者肝功能等指标,明确肝脏病理损伤;利用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术和Masson染色检测肝脏纤维化;2)利用FCM明确病灶周围浸润的T细胞表面PD-1的表达;利用实时荧光定量PCR检测PD-1的表达并分析与肝功能的相关性;3)分析PD-1阳性与阴性T细胞分泌细胞因子情况。第三部分,1)利用BALB/c、Nude和SCID小鼠,制造E.multilocularis感染模型,大体观察和测量,对比3组感染比例、病灶部位、病灶数量和大小;利用病理切片和染色,对比病理改变;利用天狼星红染色技术和IHC技术检测肝脏纤维化;2)用E.multilocularis PSCs感染C57BL/6小鼠,注射抗CD4+T、抗CD8+T和对照组抗体,注射12周后,大体观察和测量,对比3组感染比例、病灶部位、病灶数量和大小;利用病理切片和染色,对比病理改变。3)经门静脉注射E.multilocularis PSCs感染BALB/c小鼠,分离肝脏单个核淋巴细胞,通过FCM检测肝脏T细胞表面的PD-1的表达情况,明确PD-1阳性与阴性群T细胞分泌细胞因子等情况。第四部分,1)利用PD-1基因缺陷(PD-1 knockdown,PD-1-/-)小鼠和BALB/c野生型小鼠制造经门静脉E.multilocularis感染模型,大体观察和测量,对比2组感染比例、病灶部位、病灶数量和大小;利用病理切片和染色,对比病理改变;利用天狼星红染色技术和IHC技术检测肝脏纤维化;分离肝脏单个核淋巴细胞,通过FCM检测各淋巴细胞群绝对数、T细胞活化比例、T细胞记忆型分群、T细胞亚群（Th1、Th2、Th17和Treg）等情况。利用PD-1-/-小鼠和BALB/c野生型小鼠制造E.multilocularis皮下感染模型,对比2组感染比例、病灶部位、病灶数量和大小,对比病理改变;2)利用E.multilocularis感染C57BL/6小鼠模型,12周后注射抗PD-1、抗PD-L1和对照组抗体,对比2组感染比例、病灶部位、病灶数量和大小;利用病理切片和染色,对比病理改变;检测肝脏纤维化;分离肝脏、脾脏、肝门淋巴结、外周血的单个核淋巴细胞,通过FCM检测各淋巴细胞群绝对数、T细胞活化比例、T细胞记忆型分群、T细胞亚群等情况。结果:第一部分,E.granulosus感染小鼠在早期,E.multilocularis感染小鼠在中、晚期,CD4+T和CD8+T细胞显着升高。第二部分,1)AE患者肝脏病灶周围存在“炎症免疫微环境”,以肝损伤和肝纤维化为主要特点;2)AE患者病灶周围以T细胞为主（CD4+T和CD8+T）,伴巨噬细胞等细胞;3)病灶周围区域T细胞表面的PD-1较远端高表达,病灶周围区域PD-1在CD4+T和CD8+T细胞表面的表达高于远端（21.11±1.15%vs 11.69±0.69%,22.31±1.15%vs 11.42±0.79%,P<0.05）;PD-1-CD4+T、PD-1-CD8+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α显着高于PD-1+CD4+T、PD-1+CD8+T细胞。第三部分,1)在Nude和SCID小鼠中,泡球蚴感染明显重于BALB/c小鼠,但Nude与SCID二者无明显差异。纤维化程度在BALB/c小鼠重于Nude和SCID小鼠（24周,天狼星红:29.35±2.56%vs 8.90±2.67%vs 9.90±1.56%,P<0.05;IHC:22.89±4.93%vs 3.84±0.98%vs 7.23±3.23%,P<0.05）;2)与对照组对比,封闭CD4+T细胞和封闭CD8+T细胞后病灶显着增大（重量1523.00±288.50 vs1285.00±272.60 vs 375.00±83.24mg,P=0.012,P=0.044;体积2197.00±647.10 vs1744.00±367.20 vs 108.80±22.63mm3,P=0.013,P=0.048）,但封闭组之间无显着差异。3)成功建立E.multilocularis经门静脉感染BALB/c小鼠模型,感染早期,PD-1在CD8 Tcm表面高表达;感染晚期,PD-1在CD3+T、CD4+T、CD8+T和Treg细胞表面高表达;12周和24周时,PD-1+CD8+T分泌的IFN-γ显着低于PD-1-CD8+T（14.42±1.89%vs 32.26±0.47%,4.59±0.43%vs 10.17±0.74%,P<0.001,P=0.027）;第四部分,1)敲除PD-1基因后,经门静脉注射E.multilocularis感染PD-1-/-小鼠后,E.multilocularis生长被抑制（24周,重量296.20±26.15 vs 471.00±88.70mg,体积221.40±29.61 vs 451.40±113.20mm3,P<0.05）,脾脏肿大,纤维化加重（24周,天狼星红:53.56±3.77%vs 32.64±0.83%,P<0.05;IHC:27.32±6.23%vs 10.99±1.83%,P<0.05）。PD-1-/-鼠肝脏区域CD69阳性CD4+T细胞和效应性CD4+T细胞早期显着增加（46.44±2.06%vs 29.86±4.60%,67.12±3.96%vs 42.68±5.17%,P<0.05）,肝脏Th1型细胞增加（24周,IFN-γ+CD4+T 19.26±1.90%vs 7.21±0.88%,P<0.05）,Th2型细胞减少（24周,IL-4+CD4+T 2.83±0.12%vs 5.53±0.92%,P<0.05）;2)敲除PD-1基因后,经皮下注射E.multilocularis感染PD-1-/-小鼠后,E.multilocularis生长被抑制（24周,重量101.20±43.12 vs 393.70±123.5mg,体积82.17±28.43 vs429.30±148.30mm3,P<0.05）;3)抗体封闭PD-1/PD-L1信号通路后,E.multilocularis生长未显着抑制,纤维化加重（α-PD-1,天狼星红:37.72±2.24%vs 28.39±1.60%,P<0.05;α-PD-L1,天狼星红:34.15±1.70%vs 22.56±4.26%,P<0.05,IHC:25.52±3.23%vs 13.65±1.94%,P<0.05）,Th1型细胞增加（IL-2+CD4+T 10.75±0.74%vs 7.85±0.60%,TNF-α+CD4+T 22.43±1.94%vs 13.73±1.99%,P<0.05）,Th2型细胞减少（IL-4+CD4+T 4.96±0.29%vs 7.00±0.62%,P<0.05）。结论:1)PD-1在AE患者病灶周围T细胞表面高表达介导T细胞免疫耗竭,导致肝脏区域免疫耐受;2)T细胞在感染中有重要作用,参与纤维化形成的过程;PD-1在E.multilocularis感染小鼠中T细胞表面高表达;3)阻断PD-1抑制泡球蚴的生长,增加肝纤维化,逆转Th1/Th2和Th17/Treg失衡。
张雷[7]（2018）在《多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞对肿瘤的主动免疫治疗》文中研究表明人工抗原提呈细胞（Artificial antigen-presenting cells,aAPCs）在T细胞扩增及肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。按照载体类型不同,aAPCs可分二类:一类是细胞性载体的aAPCs,即通过多基因转染载体细胞,如3T3,K562和果蝇细胞等,使其表达相应的peptide/MHC复合体（pMHC）分子和共刺激分子;第二类是非细胞性载体的aAPCs。常用载体有磁珠,聚苯乙烯胶乳微球,外泌体和脂质体等,人工制备的pMHC分子和共刺激分子等被共价偶联在载体表面。本室和其他研究者的诸多体内观察性研究已证实,静态表面载体的非细胞型aAPCs具有较强的靶向活化和扩增抗原特异性T细胞的能力,在对肿瘤等疾病的主动免疫治疗方面具有潜在应用价值。但是,以往的aAPCs设计只是在表面携带2或3种免疫分子;研究尚未涉及体内作用机制和运行规律;而且所用载体多为磁珠、聚苯乙烯胶乳微球等材料,不能在体内生物降解,不适于临床应用。为此,本课题在前期基础上拟进一步探讨aAPCs的体内作用机制,并全面改造和优化aAPCs系统。（1）选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微粒做载体,可在体内生物降解,组织相容性高,无毒性,以适应人体使用。（2）在微粒内部混合包裹IL-2、IL-15、CCL21以及CTLA-4和PD-1的封闭性抗体,通过旁分泌方式刺激多信号通路,以趋化募集和活化T细胞,并封闭抑制性信号通路。（3）在微粒表面联合吸附两种pMHC多聚体、CD28和4-1BB单抗、CD2单抗以及CD47分子,为T细胞活化提供多抗原信号、共刺激信号和粘附分子,同时为微粒提供抗吞噬分子。我们将研制该多抗原表位、高仿生、适用于人体的多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞（MaAPCs）,探讨其对黑色素皮下瘤模型鼠的疗效和体内的作用机制、时空分布以及与免疫细胞的接触规律、对整体免疫功能的影响和可能引起的毒副作用等,以期为肿瘤疾病提供一种新的、高能的抗原特异性主动免疫疗法。研究目的:研究装载11种免疫分子的MaAPCs在体内外扩增肿瘤抗原特异性T细胞及抑制肿瘤生长的能力,并探讨其体内作用机制。研究方法及结果:1、内部包裹蛋白分子的表面功能化PLGA微粒（PLGA-MPs）的制备、表征及功能检测:以PLGA为原料,采用复乳溶剂挥发法制备内部包裹BSA、平均粒径约为4.6μm的PLGA-MPs,EDC/NHS化学修饰法使其表面获得-NH2+而功能化,使PLGA-MPs获得偶联蛋白的能力。利用扫描电镜、粒径分析仪和Zeta电位分析仪对PLGA-MPs进行表征,并通过蛋白定量和流式细胞术分析PLGA-MPs包裹和偶联蛋白的能力。结果显示:所制备PLGA-MPs呈规则球形,表面光滑,平均粒径为4.6±1.9μm;对BSA包封率达91.0±4.1%,而且所囊入蛋白可缓慢释放;PLGA-MPs表面功能化后,平均Zeta电位为31.3±5.58 mV,表明其具有较强的蛋白偶联能力,对BSA的最大吸附量达73μg/5×106 MPs。以上结果表明本室制备的PLGA-MPs具有良好的表征和蛋白包裹及表面吸附能力。2、MaAPCs的制备及验证:制备内部包裹IL-2、IL-15、CCL21以及CTLA-4和PD-1的封闭性抗体的功能化PLGA-MPs,并将其与两种pMHC多聚体（H-2Kb/TRP2-Ig、H-2Db/gp100-Ig）、CD28和4-1BB单抗、CD2单抗以及CD47-Fc等六种免疫分子共同孵育,使其联合吸附于微粒表面,制备装载11种免疫分子的MaAPCs。ELISA实验结果显示:MaAPCs内部包裹的五种免疫分子均可缓慢释放,且互不干扰;颗粒表面有效偶联了六种免疫分子,且不明显影响内部包裹蛋白的缓慢释放效率。说明本室自制的MaAPCs具有正确、完整表型和第三信号分子的旁分泌缓释功能。3、MaAPCs体外扩增抗原特异性CTL细胞的功能研究:在体外,MaAPCs与小鼠脾脏淋巴细胞共培养7天,同时设置空白PLGA微粒（Blank-MPs）、表面负载六种分子的PLGA微粒(MP6+)和只有内部包裹五种分子的PLGA微粒(MP5+)的共培养对照,然后行H-2Kb/TRP2-Ig或H-2Db/gp100-Ig二聚体荧光染色,流式分析共培养后小鼠脾脏淋巴细胞中TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的频率。与Blank-MPs组频率相比（0.19%）,MaAPCs、MPs6+和MPs5+各组在没有添加IL-2的条件下,TRP2180–188特异性CD8+T细胞的扩增倍数分别为268.4倍（MaAPCs组:51.0%）、124.2倍(MP6+组:23.6%)和15.5倍(MP5+组:2.95%);gp10025-33特异性CD8+T细胞的扩增倍数分别为Blank-MPs组（0.13%）的333.1倍（MaAPCs组:43.3%）、166.9倍(MP6+组:21.7%)和16.6倍(MP5+组:2.16%)。结果说明,MaAPCs在体外刺激抗原特异性T细胞扩增的能力远超于对照aAPCs。4、MaAPCs体内扩增特异性CTL并抑制肿瘤生长的功能研究:制备Blank-MPs及负载不同免疫分子的PLGA微粒:MP2+（Blank-MPs+H-2Kb/TRP2-Ig和H-2Db/gp100-Ig）、MP5+(MP2++anti-CD2/anti-4-1BB/anti-CD28)、MP6+(MP5++CD47)、MP2+6+(MP6++IL-2/IL-15)、MP36++(MP2+6++CCL21)及MaAPCs（MP63+++anti-CTLA-4/anti-PD-1）,分别于B6鼠接种B16细胞后第7、9和11天经尾静脉三次注射,对黑色素皮下瘤模型鼠进行主动免疫治疗,每三天观察肿瘤生长情况,第28天处死小鼠,二聚体染色,流式检测外周血、脾脏和肿瘤组织标本中TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的频率。结果显示,负载11种免疫分子的MaAPCs明显比其它各aAPCs更能有效地促进治疗鼠体内TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的扩增、提高肿瘤组织局部两种肿瘤抗原表位特异性CD8+T细胞的浸润程度,并有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期。5、MaAPCs体内抗肿瘤的机制研究:将Blank-MPs、MP2+、MP5+、MP6+、MP2+6+、MP3+6+及MaAPCs分别同上于第7、9和11天经尾静脉注射治疗黑色素瘤皮下模型鼠,第14天杀鼠取脾细胞和肿瘤组织,检测各组aAPCs诱导机体抗肿瘤免疫反应的能力,分析MaAPCs的体内抗肿瘤机制。结果显示,MaAPCs比其他各组更能有效促进机体内肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的扩增;提高抗原特异性CTL中活化和记忆性细胞的比例;增强CD8+T细胞、TRP2180–188和gp10025-33特异性CTL的脱颗粒能力及对肿瘤细胞的特异性杀伤能力;同时,MaAPCs比其他各组更能有效地抑制调节性T细胞的增殖和CD8+T细胞及TRP2180–188和gp10025-33特异性CTL的凋亡;提高CD8+T及TRP2180–188、gp10025-33特异性CTL的体外增殖活性;促进炎症性细胞因子分泌,并降低抑制性细胞因子的产生。结果显示MaAPCs是通过以上多种机制增强机体抗肿瘤的特异性免疫应答能力,从而达到抑制肿瘤生长、延长生存期的目的。6、MaAPCs体内运行分布及与免疫细胞的接触规律研究:制备吲哚青绿（ICG）标记的MaAPCs、H-2Kb-aAPCs、CD47-aAPCs和Blank-MPs,于造模后第11天分别经尾静脉注入肿瘤模型鼠体内,在不同时间点进行小鼠活体荧光成像和器官离体成像。制备PE标记的MaAPCs,于造模后第11天经尾静脉注入肿瘤模型鼠体内,4小时后取脾脏制备冰冻切片,分别用FITC标记的CD4、CD8、CD11b、F4/80和CD19单抗染色,而后共聚焦显微镜下拍照观察MaAPCs与各类免疫细胞的共定位情况。结果显示,MaAPCs经静脉输注后很快分布于全身各器官组织;与H-2Kb-aAPCs（无靶向抗原）、CD47-aAPCs（无抗吞噬分子）和Blank-MPs相比,更多的MaAPCs分布在脾脏和淋巴结等免疫器官;而且可以在体内滞留达36 h以上。在脾脏组织切片中,MaAPCs可靶向性地与CD8+T细胞直接结合,促进抗原特异性CTL细胞的活化和扩增,而较少被巨噬细胞和DC细胞吞噬。7、MaAPCs治疗对机体整体免疫功能的影响和毒副作用的初步研究:造模后第7、9、11天,对载瘤鼠分别进行MaAPCs、Blank-MPs或PBS的尾静脉三次输注治疗,第14天分析脾脏淋巴细胞群各种免疫细胞的数量或功能,第14、21、和28天检测血常规和肝肾功能,并对主要脏器进行病理分析。结果显示,MaAPCs治疗可提高载瘤鼠脾脏CD3+T和CD8+T细胞比例和血液中的白细胞数、淋巴细胞数和淋巴细胞比例等多项指标,但对其他免疫细胞未产生明显影响;可一定程度增强载瘤鼠脾脏T细胞的同种增殖能力以及对其他肿瘤细胞（S180和SP2/0）的非特异性杀伤效应;但对NK的数量和杀瘤活性没有明显影响,对血清中肿瘤细胞特异性IgG抗体的水平也无显着影响;对血常规指标、肝肾功能和主要脏器未造成明显病理损伤。结论:成功制备了可生物降解的、装载11种免疫分子的多功能人工抗原提呈细胞,通过表面提呈和旁分泌等两种方式和多信号通路刺激,在体内和体外有效扩增肿瘤抗原表位特异性的CTL细胞,并在体内与肿瘤抗原特异性CTL靶向接触,极大地提高其活化、增殖能力和杀伤活性,提高记忆性T细胞频率,抑制调节性T细胞扩增和抗原特异性CTL凋亡,促进炎性细胞因子释放和抑制调节性细胞因子的产生,通过上述多种免疫机制抑制肿瘤生长。MaAPCs治疗在一定程度上促进了机体的整体免疫功能,并对主要脏器无明显毒副作用。本研究为肿瘤的特异性主动免疫治疗提供了新的策略和新型免疫制剂。
陈海德[8]（2017）在《GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究》文中进行了进一步梳理(1)GGTA1敲除猪的研究面临器官移植供体短缺的现状,异种移植是一种可行的替代方案。大量研究证明猪是合适的异种移植供体。使用猪进行异种移植仍然需要克服许多免疫排斥障碍,包括超急性免疫排斥反应（HAR）,急性体液异种排斥反应（AHXR）,急性细胞排斥反应（ACR）,凝血功能异常,慢性排斥反应（CR）和炎症反应等。基于相关致病机理的研究,研究人员认为制备基因修饰猪是克服异种移植免疫排斥障碍的有效措施。目前功能正常的猪多能干细胞系仍然没有建立,而基于同源重组进行的基因修饰在猪体细胞中效率较低,严重制约了相关研究的进展。最近几年出现了多种高效的基因定点修饰工具,包括锌指核酶（ZFN）,转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及CRISPR/Cas9。这些技术被成功地应用于各种模式生物中,我们也建立了基于ZFN和TALEN的猪基因修饰系统。我们首先使用ZFN制备GGTA1KO（GTKO）猪,然后在GTKO猪细胞中使用TALEN对猪白细胞抗原（SLAs）相关基因进行修饰。GGTA1参与形成的Ga1是引起HAR的主要异种抗原。在进化过程中,GGTA1在人类和旧世界猴中失去功能,导致他们的细胞表面没有Ga1抗原,所以他们血液中存在大量靶向Ga1抗原的天然抗体。为了克服HAR障碍,研究人员在猪体细胞上通过同源重组修饰GGTA1并结合体细胞核移植技术制备GTKO猪,通过异种移植实验表明GTKO猪可以显着抑制HAR的发生。但是这种技术不仅效率很低,而且会引入外源的抗药基因,无法满足后续大量基因修饰的需求。我们将靶向GGTA1编码区序列的ZFN质粒和抗药质粒通过瞬转手段导入胎猪成纤维细胞中,经过药物筛选获得了18个单拷贝敲除和4个双拷贝敲除的细胞克隆,效率分别为23.4%和5.2%。随后我们将获得的双拷贝敲除的细胞作为核供体进行体细胞核移植,产生克隆猪。经鉴定,一共获得3头GTKO猪。同时我们利用克隆胎儿建立了一个GTKO胎猪成纤维细胞系。通过细胞表面标记鉴定证明GTKO猪的细胞膜上Ga1抗原被完全清除。通过杀伤实验证明GTKO猪的细胞可以在与人血清共培养时不受抗体补体介导的免疫攻击。在GTKO猪的基础上,我们通过TALEN技术修饰猪的SLAs,将其中的部分基因替换为人类白细胞抗原（HLAs）中的部分基因。我们设计并验证了靶向SLA-1和-2的TALEN。同时我们设计并构建了相关的KI载体进行基因替换实验。通过PCR验证HLA-A基因成功替代SLA-1,并能在猪细胞中表达。这一策略在异种移植中的效果仍需要使用实验猪进行进一步的异种移植验证。（2）低免疫原性人多能干细胞的研究人多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力,并可以在一定条件下分化为机体内所有的细胞类型。所以研究人员尝试将hPSCs分化为各种组织细胞,用于移植替换病人身上受损的组织细胞。在人类同种异体组织器官移植的过程中,供受体细胞表面的HLAs不兼容会导致免疫排斥反应。HLAs分为HLA Ⅰ和HLA Ⅱ:CD8+T细胞识别HLA Ⅰ,参与直接靶细胞杀伤作用;CD4+T细胞识别HLA Ⅱ,分泌大量细胞因子参与调控免疫反应。我们实验室的工作重点在于使用定点基因修饰的方法降低hPSCs的免疫原性,以满足其临床使用的要求。我们实验室之前通过对B2M的KO已经建立了 HLA Ⅰ缺陷的hPSCs,证明了其免疫原性的降低,同时hPSCs的多能性和自我更新能力都没有显着的变化。在本研究中我们使用TALEN对HLA Ⅱ的关键调控基因CIITA进行KO,从而降低hPSCs及其分化获得的细胞中的HLA Ⅱ相关基因的表达。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面与WT hPSCs无明显差异。将CIITA-/-hPSCs分化为树突状细胞（DCs）后,CD83和CD86等表面蛋白标记物正常表达,但其结构型HLA Ⅱ表达显着下降。将CIITA-/-hPSCs分化为成纤维细胞后,在IFN-γ的刺激下诱导型HLA Ⅱ表达显着下降。将分化获得的CIITA--成纤维细胞与CD4+T细胞共培养,CD4+T的活化减弱。这些结果说明CIITA-/-hPSCs分化获得的组织细胞可能降低CD4+T细胞介导的免疫排斥反应。我们的研究将有利于推动hPSCs的临床应用,尤其是将hPSCs分化为结构型高表达HLAII的组织细胞进行移植替换,比如DCs和T细胞等。
车媛媛[9]（2016）在《吉兰—巴雷综合征患者循环记忆性滤泡辅助性T淋巴细胞亚群的变化及其意义》文中进行了进一步梳理背景:吉兰-巴雷综合征（Guillain–Barre′syndrome,GBS）是一种世界性分布的免疫介导的急性炎症性周围神经系统疾病。尽管其发病率比较低（0.001-0.002%）且多数病程具有自限性,仍有少数严重病例可见轴突变性碎裂并呈现较高的致残率（15%）和死亡率（5%）。国内外的研究报道均指出,依据受损神经纤维的类型可将GBS进行亚型分类,包括:急性炎症性脱髓鞘性多发神经根神经病（acute inflammatory demyelinating polyneuropathies,AIDP）、急性运动轴索性神经病（acute motor axonal neuropathy,AMAN）、急性运动感觉轴索性神经病（acute motor-sensory axonal neuropathy,AMSAN）、Miller Fisher综合征（Miller Fisher syndrome,MFS）、急性泛自主神经病（acute panautonomic neuropathy）和急性感觉神经病（acute sensory neuropathy,ASN）等。其中欧洲和北美大约90%的病例为AIDP,亚洲及中南美AMAN和AMSAN两型多见。不同亚型之间免疫学发病机制存在差异。AMAN、AMSAN和MFS发病与神经节苷脂自身抗体产生有关,其中大约95%的MFS患者中抗GQ1b自身抗体阳性,而AIDP则主要表现为CD4+辅助性T细胞诱导巨噬细胞及补体活化进而引起周围神经脱髓鞘反应。大量研究表明不同亚型GBS的发病机制、临床病程、严重程度和结局具有高度各异性。其中,2014年张洪亮研究团队在对中国北方地区GBS亚型临床数据统计分析后指出与神经节苷脂自身抗体相关的GBS亚型具有更严重的临床症状和更差的预后。2015年张刚等人对中国西南地区170例GBS患者疾病严重程度做了回顾性研究并得出结论AMAN亚型预后较AIDP更差。上述研究结果提示我们体液免疫异常表现在某些GBS亚型的发病过程中,可能是多数重症GBS的重要免疫学发病机制。滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cells,Tfh）,是定位于淋巴滤泡中的一类CD4和CXCR5双阳性的T淋巴细胞亚群,这群细胞在健康人外周血中占CD4阳性T淋巴细胞百分比为（11.9±0.38）%,目前已知的Tfh细胞记忆性标记物包括CD45RA-/CD45RO+。Tfh细胞的主要功能为辅助B淋巴细胞参与体液免疫。依据表面分子标记物CXCR3和CCR6的不同表达可以将Tfh分成Tfh1（CXCR3+CCR6-）、Tfh2（CXCR3-CCR6-）和Tfh17（CXCR3-CCR6+）三种不同的细胞亚群,据报道这些细胞亚群在B细胞的分化、成熟以及免疫球蛋白类别转换过程中起着各自不同的信息传递作用。国内外大量的实验研究证实Tfh细胞数量变化、分子表达异常及其亚群细胞分布失衡与许多自身免疫病的发生、发展和转归有关。目前,Tfh细胞在GBS发病机制中的研究未见报道。目的:研究外周血记忆性滤泡辅助性T细胞（CD4+CXCR5+CD45RA-）及其亚群Tfh1（CXCR3+CCR6-）、Tfh2（CXCR3-CCR6-）和Tfh17（CXCR3-CCR6+）在GBS两个发病率高的亚型AIDP和AMAN疾病进程中的数量变化、表面分子ICOS/PD-1表达水平、细胞亚群的分布比率。探讨上述细胞的变化在GBS发病早期对机体体液免疫状态的影响和调控途径,为未来发展个性化临床治疗提供理论依据。方法:本研究收入急性期吉兰-巴雷综合征患者36例,其中应用免疫球蛋白治疗后的重症患者7例,以及年龄、性别相匹配的体检人群18例作为对照组。根据2012年修订的国际通用临床神经电生理学诊断标准将36名急性期GBS患者进行AIDP/AMAN亚型分组,同时参照休斯功能分级量表（HFGS）和医学研究理事会（MRC）评分标准对全部患者的疾病严重程度进行评估。应用淋巴细胞提取技术和流式细胞技术检测急性期（acute phase）GBS患者及应用免疫球蛋白治疗后平台期（plateau phases）患者、对照组（Control subjects,CS）外周血中Tfh细胞表面标记物CD4/CXCR5/CD45RA/CCR6/CXCR3/ICOS/PD-1以及B细胞表面标记物CD19/CD27/CD38/CD20的表达水平。流式分选获得健康人和AMAN患者外周血B细胞、记忆性Tfh2细胞和Tfh17细胞,并通过体外共培养系统验证患者记忆性Tfh亚群细胞辅助B细胞分化及抗体分泌的功能变化。酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测外周血、脑脊液和细胞共培养上清液中细胞因子IL-21的表达水平,流式微球阵列（CBA）用于检测细胞因子IL-17A,IFN-γ,TNF,IL-10,IL-6,IL-4和IL-2的表达水平以及免疫球蛋白Ig G/Ig A/Ig M的含量,散射比浊法检测脑脊液免疫球蛋白和总蛋白的含量。结果:1.GBS分组包括:24名AMAN和12名AIDP,其中HFGS评分≥4的7名重症GBS全部来源于AMAN组。2.AMAN组患者外周血中CD4+CXCR5+CD45RA-Tfh细胞频数以及Tfh1（CXCR3+CCR6-）,Tfh2（CXCR3-CCR6-）和Tfh17（CXCR3-CCR6+）亚群细胞频数均比正常对照组显着升高。而总Tfh及其亚群细胞频数在AIDP组和正常对照组之间差异无显着性。3.AMAN组患者外周血中记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞比率较正常对照组和AIDP组均有不同程度的升高,且（Tfh2+Tfh17）/Tfh1比率变化与疾病严重程度和外周血浆细胞数量正相关。4.AMAN患者外周血记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞表面诱导性协同刺激分子（ICOS）的表达水平较正常对照组和AIDP组升高,相反地,其表面免疫抑制性受体程序性死亡分子1（PD1）的表达水平较正常对照组下降。5.在体外共培养实验中,经过6天的共培养,实验组的活性B细胞（CD3-CD4-）及浆细胞（CD38+CD20-）比例较对照组升高,且培养上清中免疫球蛋白Ig M和Ig G浓度同比升高。6.给予大剂量免疫球蛋白冲击治疗,每公斤体重每天用量0.4g连续5天,且病程进入平台期（发病两周以上）后重症GBS患者外周血中CD4+CXCR5+CD45RA-Tfh细胞总数降低,其中以Tfh17数量下降最为显着,其次是Tfh1,而Tfh2频数变化不明显。同时,亚群分布比率（Tfh2+Tfh17）/Tfh1下降,伴有血清细胞因子IL-21浓度降低。7.免疫球蛋白治疗后重症GBS患者外周血ICOS+Tfh1细胞比例下降;ICOS+Tfh2细胞和PD1+Tfh2细胞比例均下降。8.免疫球蛋白治疗前后重症GBS患者外周血浆细胞（CD3-CD4-CD38+CD20-）比例变化不明显。结论:1.本实验阐释了循环记忆性滤泡辅助性T细胞不同细胞亚群数量变化、细胞表面分子异常表达及其亚群细胞分布失衡在GBS病程中的临床意义,提示AMAN患者体内过度活化的体液免疫应答可能与循环记忆性Tfh亚群细胞数量变化和功能异常有关。2.体外共培养实验结果验证了AMAN患者外周血记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞与正常对照组相比具有更强的协同诱导B细胞分化和抗体分泌的能力。3.重症GBS患者应用免疫球蛋白（IVIg）治疗后外周血中浆细胞比例未见明显下降可能与记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞异常活化状态未被显着抑制有关。寻找有效抑制记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞的方法,进而有效调控病理状态下过度活化的Tfh-B细胞轴,或可成为未来重症AMAN的新型治疗手段。
武晓丽[10]（2013）在《gammadelta T细胞在乙型肝炎不同疾病状态中的作用和机制》文中研究指明HBV病毒感染人类肝脏后随着疾病的进展会逐渐造成肝脏损伤并最终导致肝硬化、肝癌而人们对于这个疾病进程中的确切的免疫学机制却并不清楚。γδT细胞是一小群天然免疫细胞,在肿瘤和病毒感染中发挥一定保护和调节性作用,但是在HBV感染疾病中的作用并不清楚。在本项研究中我们探讨了在HBV感染的不同疾病状态下γδT细胞其及亚群的表型及功能的变化。在慢性乙肝疾病患者中我们通过64例免疫活化期患者（IA）、22例免疫耐受期患者（IT）以及30例健康对照（HC）分析了γδT细胞的影响。同健康对照和免疫耐受组患者相比,外周血和肝脏的Vδ2γδ T细胞频率在免疫活化期患者中显着降低,且在免疫活化期患者中降低的V82T细胞在外周血和肝脏分别同丙氨酸氨基转移酶和肝脏炎症程度显着负相关。免疫活化期患者中,呈现活化的TEM状态的Vδ2γδ T细胞增殖能力和趋化能力均受损伤,但是分泌IFN-y的能力并未变化。最为重要的是,Vδ2γδ T细胞可以在体外通过细胞接触或是IFN-γ依赖的方式显着降低Th17的产生以及Th17相关细胞因子（IL-17, IL-22）的产生。同时,在HBV急性感染中,我们首先按HBV感染发展不同进程的患者描述了外周γδT细胞频率的变化：29名急性乙肝患者、29名慢性乙肝患者、15名慢加急性肝衰竭患者、15名肝硬化患者和25名健康对照。同健康对照相比在炎症程度较为明显的急性乙肝患者、慢性乙肝患者和慢加急性肝衰竭患者而非肝硬化患者的外周γδT细胞频率显着降低,且AHB患者外周γδT细胞频率的降低同血浆丙氨酸氨基转移酶的水平显着负相关且这些活化的TEM状态的外周γδT细胞分泌颗粒酶A的能力显着降低。在随访过程中,同急性期相比患者在恢复期病毒被清除,炎症程度降低,γδT细胞的频率上升,活化程度降低,且表面NKR抑制性受体表达降低,同时我们在ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型中证明了CD4+T细胞有可能是造成肝损伤的原因。总之,本项研究拓展了γδT细胞在HBV感染的认识,为临床HBV患者的治疗提供新的方法。
二、异体角膜对人外周血T细胞及其亚群CD_(69)分子表达的体外调节（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、异体角膜对人外周血T细胞及其亚群CD_(69)分子表达的体外调节（论文提纲范文）
（1）白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 急性胰腺炎 |
| 1.1.1 急性胰腺炎概述 |
| 1.1.2 AP的发病机制 |
| 1.2 调节性免疫细胞 |
| 1.2.1 调节性T细胞 |
| 1.2.2 调节性B细胞 |
| 1.2.3 调节性NK细胞 |
| 1.2.4 调节性DC细胞 |
| 1.2.5 调节性巨噬细胞 |
| 1.3 髓源性抑制细胞 |
| 1.3.1 髓源性抑制细胞概述 |
| 1.3.2 MDSC的产生与分化 |
| 1.3.3 MDSC的功能 |
| 1.3.4 影响MDSC功能的因素 |
| 1.3.5 MDSC与疾病 |
| 1.4 TIGIT |
| 1.4.1 耗竭性T细胞概述 |
| 1.4.2 TIGIT概况 |
| 1.4.3 TIGIT在肿瘤中的研究 |
| 1.4.4 TIGIT在移植中的研究 |
| 1.4.5 TIGIT在感染性疾病中的研究 |
| 1.4.6 TIGIT在自身免疫性疾病中的研究 |
| 1.5 IL-37 |
| 1.5.1 IL-37 的调控作用 |
| 1.5.2 IL-37 在疾病中的作用 |
| 1.6 MDSC与 TIGIT的关系及其调控机制 |
| 1.7 展望 |
| 第2章 AP患者中MDSC数量及功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂耗材 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验对象 |
| 2.3.2 样本采集与保存 |
| 2.3.3 梯度密度离心法分离PBMC |
| 2.3.4 细胞计数 |
| 2.3.5 细胞表面染色 |
| 2.3.6 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.7 细胞内染色 |
| 2.3.8 流式分选MDSC细胞 |
| 2.3.9 磁珠分选CD3~+T 细胞 |
| 2.3.10 MDSC抑制实验 |
| 2.3.11 抑制实验检测 |
| 2.3.12 ROS染色 |
| 2.3.13 统计学方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HC、MAP、SAP患者一般信息及临床特点 |
| 2.4.2 MAP、SAP患者外周血中MDSC细胞升高 |
| 2.4.3 SAP患者腹腔积液中MDSC细胞比例较外周血升高 |
| 2.4.4 AP患者外周血中MDSC升高与疾病严重程度相关 |
| 2.4.5 G-MDSC和 M-MDSC与疾病严重程度相关性分析 |
| 2.4.6 SAP患者外周血中MDSC对 T细胞的抑制作用更强 |
| 2.4.7 AP患者与健康对照外周血中 MDSC中 Arg-1、ROS分析 |
| 2.4.8 AP患者与健康对照外周血中MDSC表面CD155 表达分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 TIGIT在 AP患者外周血中表达及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象、入选标准、排除标准及疾病严重程度分级标准 |
| 3.3.2 样本采集与保存 |
| 3.3.3 外周血PBMC的获取 |
| 3.3.4 细胞计数 |
| 3.3.5 细胞表面染色 |
| 3.3.6 PBMC体外刺激实验 |
| 3.3.7 细胞内染色 |
| 3.3.8 流式分选CD3~+TIGIT~+、CD3~+TIGIT~-细胞 |
| 3.3.9 细胞增殖实验 |
| 3.3.10 细胞增殖实验检测 |
| 3.3.11 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AP外周血中CD3~+ T 细胞及CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+ T细胞百分比及数量减少 |
| 3.4.2 AP外周血中CD3~+ T 细胞及CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+ T细胞表面TIGIT表达下降 |
| 3.4.3 SAP患者外周血中CD3~+ T 细胞及其亚群CD4~+、CD8~+ T细胞功能检测 |
| 3.4.4 TIGIT~+T 细胞增殖能力较TIGIT~-T 细胞增殖能力强 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 IL-37 通过影响 CD155 表达影响 MDSC对 T细胞的抑制功能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象、入选标准、排除标准及疾病严重程度分级标准 |
| 4.3.2 样本采集与保存 |
| 4.3.3 外周血PBMC的获取 |
| 4.3.4 细胞计数 |
| 4.3.5 细胞表面染色 |
| 4.3.6 PBMC体外刺激实验 |
| 4.3.7 细胞内染色 |
| 4.3.8 流式分选MDSC细胞及CD3~+TIGIT~+、CD3~+TIGIT~-细胞 |
| 4.3.9 细胞增殖实验 |
| 4.3.10 细胞增殖实验检测 |
| 4.3.11 ELISA法检测血浆IL-37 浓度 |
| 4.3.12 数据分析及统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AP患者血清中及单核细胞中IL-37 表达升高 |
| 4.4.2 IL-37对MDSC表型的影响 |
| 4.4.3 IL-37对MDSC抑制功能的影响 |
| 4.4.4 IL-37对MDSC抑制功能的影响的机制 |
| 4.4.5 MDSC表面CD155 的表达依赖于ROS的表达 |
| 4.4.6 MDSC通过CD155/TIGIT途径抑制T细胞功能 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 甲型流感病毒的概述 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 结构及致病机制 |
| 2.1.3 预防和治疗 |
| 2.2 流感病毒感染后机体的免疫应答 |
| 2.2.1 病毒如何进入宿主 |
| 2.2.2 病毒编码的几种蛋白 |
| 2.2.3 固有免疫反应 |
| 2.2.4 适应性免疫反应 |
| 2.3 人源化小鼠模型的发展和应用 |
| 2.3.1 人源化小鼠模型的发展 |
| 2.3.2 人源化小鼠模型在流感病毒研究中的应用 |
| 2.4 组织定居记忆性T细胞 |
| 2.4.1 概述 |
| 2.4.2 特征 |
| 2.4.3 发展 |
| 2.4.4 Trm与呼吸系统 |
| 第3章 人免疫系统-人肺小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 人胚胎组织来源 |
| 3.2.3 材料及试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人胚胎肺脏组织处理 |
| 3.3.2 人胚胎肝脏来源CD34~+细胞的分离 |
| 3.3.3 人胚胎胸腺组织处理 |
| 3.3.4 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.3.5 HISL小鼠模型的构建 |
| 3.3.6 HISL小鼠构建后流式细胞术鉴定免疫系统重建水平 |
| 3.3.7 HISL小鼠取材检测 |
| 3.3.8 HISL小鼠各组织器官HE染色 |
| 3.3.9 流式细胞术染色方案 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.4.2 HISL小鼠模型构建 |
| 3.4.3 HISL小鼠免疫系统的重建水平 |
| 3.4.4 HISL小鼠建立后HL结构及其中免疫细胞的水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 人免疫系统-人肺小鼠流感病毒感染后的免疫应答 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 SPF鸡蛋 |
| 4.2.3 甲型流感病毒和MDCK细胞 |
| 4.2.4 材料和试剂 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 种蛋孵育 |
| 4.3.2 甲型流感病毒的扩增 |
| 4.3.3 甲型流感病毒血凝值的测定 |
| 4.3.4 甲型流感病毒TCID50测定 |
| 4.3.5 人免疫系统-人肺小鼠建立及鉴定 |
| 4.3.6 人免疫系统-人肺小鼠感染甲型流感病毒 |
| 4.3.7 感染甲型流感病毒后21天取材检测 |
| 4.3.8 流感病毒特异性IgM、IgG抗体ELISA检测 |
| 4.3.9 各器官组织化学染色 |
| 4.3.10 流式细胞术染色方案 |
| 4.3.11 转录组测序分析 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 H1N1流感病毒效价及TCID50 |
| 4.4.2 HISL小鼠感染H1N1后免疫细胞的总体变化 |
| 4.4.3 HISL小鼠感染H1N1病毒后T细胞亚群的表达情况 |
| 4.4.4 HISL小鼠感染H1N1病毒后病毒特异性T细胞的产生 |
| 4.4.5 HISL小鼠感染H1N1病毒后血清特异性抗体的产生 |
| 4.4.6 HISL小鼠感染H1N1病毒后HL基因组测序分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 流感病毒预先接种对人免疫系统-人肺小鼠产生保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 材料和试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 甲型流感病毒的扩增及TCID50 测定 |
| 5.3.2 人源化小鼠模型建立 |
| 5.3.3 人免疫系统-人肺小鼠的建立 |
| 5.3.4 甲型流感病毒经鼻接种 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 单次H1N1病毒接种未能给予人免疫系统-人肺小鼠良好的保护作用 |
| 5.4.2 多次H1N1病毒接种可延长致死剂量H1N1病毒经鼻接种小鼠的生存时间 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）三氧化二砷对T细胞介导的免疫性肝损伤及急性GVHD的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: 三氧化二砷对T细胞介导的免疫性肝损伤及急性GVHD的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病78例自体和同胞全相合造血干细胞移植的疗效分析 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 病例与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: 肠道微生物与移植物抗宿主病研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词注释 |
| 学位期间发表论文及参加会议 |
| 致谢 |
（4）组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 食管癌TILs细胞亚群构成研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 食管癌浸润CD8~+TRM细胞亚群、分布及表型特征研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组织特异性记忆T细胞在实体肿瘤免疫中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）活化的淋巴细胞和细胞因子检测对于鉴别活动性、潜伏性结核感染和健康人群的临床价值分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 结核病流行现状 |
| 1.2 淋巴细胞在结核病的国内外研究现状 |
| 1.3 淋巴细胞活化的标志物研究现状 |
| 1.4 细胞因子与结核病的研究现状 |
| 1.5 课题的研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 纳入及排除标准 |
| 2.3 仪器与试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 活动组、潜伏组与健康组外周血中淋巴细胞亚群的变化 |
| 3.2 活动组、潜伏组与健康组外周血中活化的淋巴细胞的变化 |
| 3.3 活动组、潜伏组与健康组外周血中细胞因子浓度的变化 |
| 3.4 淋巴细胞亚群、活化的淋巴细胞联合细胞因子检测在诊断肺结核和鉴别诊断肺结核潜伏期与活动期时的临床价值分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结核分枝杆菌实验室检测研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（6）PD-1经T细胞介导泡型包虫病免疫耐受的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 E.granulosus和 E.multilocularis经门静脉感染小鼠模型对比 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物和分组 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 PD-1 在泡型包虫病患者肝脏中的表达 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象和分组 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PD-1 在泡球蚴感染小鼠肝脏中的表达 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物和分组 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂配制方法 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 阻断PD-1 在治疗泡球蚴感染小鼠中的疗效分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物和分组 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂配制方法 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 PD-1和IL-10在泡型包虫病中免疫作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞对肿瘤的主动免疫治疗（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩写词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 内部包裹蛋白分子且表面功能化PLGA微粒的制备 |
| 引言 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第二章 MaAPCs的制备及体内外扩增肿瘤抗原特异性CTL细胞和抑瘤效应的研究 |
| 引言 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三章 MaAPCs体内抗肿瘤的作用机制研究 |
| 引言 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 MaAPCs对治疗鼠整体免疫功能的影响 |
| 引言 |
| 1.材料和试剂 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间已发表论文 |
（8）GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第1部分 文献综述 |
| 第1章 基因修饰猪用于异种移植的研究进展 |
| 1.1 猪异种移植免疫障碍 |
| 1.2 促进异种移植发展的相关技术 |
| 1.3 组织器官异种移植的研究进展 |
| 1.4 展望 |
| 第2章 人多能干细胞移植的免疫障碍 |
| 2.1 人多能干细胞移植的意义 |
| 2.2 人多能干细胞的免疫原性 |
| 2.3 克服人多能干细胞移植免疫障碍的相关策略 |
| 2.4 展望 |
| 第2部分 实验研究 |
| 第3章 GGTA1敲除猪的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果和讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 低免疫原性人多能干细胞的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法(与3.2相同者,省略) |
| 4.3 实验结果和讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 过表达转录因子提高人多能干细胞造血分化能力 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法(与3.2,4.2相同者,省略) |
| 5.3 实验结果和讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
（9）吉兰—巴雷综合征患者循环记忆性滤泡辅助性T淋巴细胞亚群的变化及其意义（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 吉兰-巴雷综合征的免疫学研究进展 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 发病机制 |
| 2.1.3 临床病理表现 |
| 2.1.4 诊断标准 |
| 2.1.5 治疗及预后 |
| 2.1.6 小结 |
| 2.2 滤泡性辅助性T细胞的研究现状 |
| 2.2.1 Tfh细胞的起源 |
| 2.2.2 Tfh细胞的分子标记物 |
| 2.2.3 Tfh细胞的分类及功能 |
| 2.2.4 Tfh细胞与疾病的关系 |
| 2.2.5 Tfh细胞在神经系统免疫疾病中的研究进展 |
| 2.2.6 小结 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 研究对象 |
| 3.1.1 GBS诊断标准及分组依据 |
| 3.1.2 病例排除标准 |
| 3.1.3 GBS疾病严重性评价 |
| 3.1.4 GBS治疗方案及标本采集 |
| 3.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 外周血单个核细胞提取 |
| 3.3.2 细胞计数 |
| 3.3.3 细胞因子诱导表达 |
| 3.3.4 流式细胞仪对细胞表型鉴定 |
| 3.3.5 酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测细胞因子IL-21 |
| 3.3.6 流式微珠阵列检测（CBA）Th1/Th2/Th17相关细胞因子 |
| 3.3.7 流式微珠阵列检测（CBA）免疫球蛋白 |
| 3.3.8 人扁桃体组织淋巴细胞提取 |
| 3.3.9 Tfh-B流式细胞分选 |
| 3.3.10 Tfh-B共培养体系建立 |
| 3.3.11 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 样本的一般信息和临床特征 |
| 4.2 GBS患者外周血中记忆性Tfh细胞及其亚群的数量变化 |
| 4.3 GBS患者外周血中记忆性Tfh亚群细胞频数及比率变化与临床指标的相关性 |
| 4.4 GBS患者外周血记忆性B细胞和浆细胞的频数及与记忆性Tfh亚群细胞数量和分布比率的相关性分析 |
| 4.5 GBS患者外周血记忆性Tfh亚群细胞中ICOS+、PD-1+和ICOS+PD-1+细胞的比例变化 |
| 4.6 共培养体系中AMAN患者循环记忆性Tfh2和Tfh17的功能变化 |
| 4.7 共培养上清中Th1/Th2/Th17相关细胞因子及IL-21 的表达水平 |
| 4.8 免疫球蛋白治疗前后重症AMAN患者实验室指标的变化 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）gammadelta T细胞在乙型肝炎不同疾病状态中的作用和机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第一节 不同疾病状态HBV感染的背景介绍 |
| 1.1.1 急性乙型肝炎背景介绍 |
| 1.1.2 慢性乙型肝炎及其背景介绍 |
| 1.1.3 急性肝衰竭背景介绍 |
| 1.1.4 HBV感染基础上的肝硬化背景介绍 |
| 第二节 γδ T细胞简介及其在不同疾病状态下的作用 |
| 1.2.1 γδ T细胞简介 |
| 1.2.2 γδ T细胞在肿瘤疾病中的作用 |
| 1.2.3 γδ T细胞在感染性疾病中的作用 |
| 1.2.4 γδ T细胞在免疫治疗中的应用 |
| 1.2.5 γδ T细胞在HBV感染中的作用 |
| 第三节 本课题的研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 患者入组及小鼠资料 |
| 2.1.2 使用试剂 |
| 2.1.3 主要仪器耗材 |
| 2.1.4 使用的软件 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 细胞分离及纯化 |
| 2.2.2 流式相关检测实验 |
| 2.2.3 细胞功能相关实验方法 |
| 2.2.4 细胞因子和蛋白表达检测技术 |
| 2.2.5 临床指标相关 |
| 2.2.6 小鼠试验相关 |
| 2.2.7 全文数据统计方法 |
| 第三章 γδ T细胞在慢性乙肝患者中的作用和机制 |
| 第一节 γδ T细胞亚群频率变化及与临床指标的相关性分析 |
| 3.1.1 γδ T细胞及其亚群在外周血和肝组织原位的频率变化 |
| 3.1.2 γδ T细胞及其亚群与临床指标关系 |
| 第二节 Vδ2 T细胞亚群在炎症环境下的变化 |
| 3.2.1 Vδ2 T细胞趋化能力变化 |
| 3.2.2 Vδ2 T细胞增殖能力变化 |
| 3.2.3 V52 T细胞活化水平、记忆细胞亚群分布分泌细胞因子能力变化 |
| 第三节 Vδ2 T细胞与Th17的关系 |
| 3.3.1 Vδ2 T细胞与Th17频率的相关性 |
| 3.3.2 Vδ2 T细胞在体外调节Th17的产生和Th17相关细胞因子分泌 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第四章 γδ T细胞在急性肝炎患者中的表型和功能 |
| 第一节 丫δ T细胞频率在急性乙肝患者变化及其与临床指标相关性 |
| 4.1.1 外周γδ T细胞在不同HBV感染情况患者中的频率变化 |
| 4.1.2 急性乙肝感染患者γδT细胞与临床指标的相关性 |
| 第二节 γδ T细胞在急性乙肝患者中表型的变化 |
| 4.2.1 γδ T细胞活化水平、记忆细胞亚群分布的变化 |
| 4.2.2 γδ T细胞分泌颗粒酶和穿孔素的变化 |
| 第三节 AHB患者γδ T细胞急性期到恢复期变化 |
| 4.3.1 γδ T细胞频率以及患者临床指标的变化 |
| 4.3.2 γδ T细胞活化程度的变化 |
| 4.3.3 γδ T细胞分泌颗粒酶和穿孔素能力的变化 |
| 4.3.4 γδ T细胞表面NK相关分子的变化 |
| 第四节 小鼠急性肝炎模型中造成肝损伤的细胞类型 |
| 第五节 讨论和小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历和在学期间发表的学术论文 |
四、异体角膜对人外周血T细胞及其亚群CD_(69)分子表达的体外调节（论文参考文献）
- [1]白介素-37通过髓源性抑制细胞影响急性胰腺炎炎症反应的机制研究[D]. 丁黎莉. 吉林大学, 2021(01)
- [2]利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答[D]. 王亦心. 吉林大学, 2021(01)
- [3]三氧化二砷对T细胞介导的免疫性肝损伤及急性GVHD的作用及机制研究[D]. 吕梦楠. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响[D]. 程纪伟. 郑州大学, 2020(02)
- [5]活化的淋巴细胞和细胞因子检测对于鉴别活动性、潜伏性结核感染和健康人群的临床价值分析[D]. 周长军. 杭州师范大学, 2020(02)
- [6]PD-1经T细胞介导泡型包虫病免疫耐受的临床和实验研究[D]. 李智德. 新疆医科大学, 2020(01)
- [7]多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞对肿瘤的主动免疫治疗[D]. 张雷. 东南大学, 2018(05)
- [8]GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究[D]. 陈海德. 浙江大学, 2017(11)
- [9]吉兰—巴雷综合征患者循环记忆性滤泡辅助性T淋巴细胞亚群的变化及其意义[D]. 车媛媛. 吉林大学, 2016(08)
- [10]gammadelta T细胞在乙型肝炎不同疾病状态中的作用和机制[D]. 武晓丽. 南开大学, 2013(07)