一、雏鸡感染堆型艾美耳球虫早熟株外周血T淋巴细胞的动态变化（论文文献综述）
蒋保余[1]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平》文中研究指明鸡球虫病由一种或多种艾美耳球虫引起的危害养鸡业最严重的肠道寄生虫病,可导致体重显着下降、营养不良、失血、脱水和对其他疾病的易感性增加,每年造成世界范围内的经济损失高达30亿美元。先天性免疫系统是抵抗微生物入侵的第一道防线,其中巨噬细胞在先天性免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。巨噬细胞可被多种细胞因子和病原相关分子模式如脂多糖、CpG DNA信号激活,从而启动先天免疫反应。本研究将鸡巨噬细胞（HD11）作为柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）子孢子的宿主细胞,研究体外E.tenella子孢子在鸡巨噬细胞（HD11）中的发育情况以及巨噬细胞（HD11）产生的抗感染免疫。具体内容如下:1.柔嫩艾美耳球虫子孢子的HD11细胞体外培养。将E.tenella子孢子接种HD11巨噬细胞,制备细胞爬片,用吉姆萨染色显微镜观察,结果发现E.tenella子孢子成功入侵HD11细胞,但并没有发育迹象,体外培养至50 h时巨噬细胞裂解,子孢子游离在培养基中并且活力良好。2.分别设置实验组,活子孢子感染HD11细胞组;空白对照组,将子孢子悬液换成相等体积的培养基;阳性对照组,将子孢子悬液换成试剂盒中阳性对照试剂。用荧光探针法检测细胞内一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的水平,结果显示:与空白对照组相比,活子孢子感染后HD11细胞内NO含量在4 hpi显着升高（P<0.05）,8 hpi达到最高并且随时间变化不再变化,而ROS含量在2hpi显着升高（P<0.05）,6 hpi达到最高并且随时间变化逐渐降低。3.分别设置活子孢子感染HD11细胞组,热灭活子孢子感染HD11细胞组和细胞空白对照组（加等量细胞培养基）。用qPCR方法检测E.tenella感染相关的8种宿主细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7）的mRNA水平,为巨噬细胞在球虫感染中的免疫反应进行初步阐述。结果显示:与空白对照组相比,活子孢子感染HD11细胞IL-1β和iNOS mRNA表达水平在6 hpi显着增加（P<0.05）,IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7在10 hpi显着增加（P<0.05）。与空白对照组相比,热灭活子孢子感染后HD11细胞IL-6和IFN-γmRNA表达水平在4 hpi显着增加（P<0.05）,IL-1、TNF-α和iNOS在6 hpi显着增加（P<0.05）,而IL-10、IL-12和IRF7在10 hpi显着增加（P<0.05）。表明,巨噬细胞抗球虫的免疫反应中,细胞因子的显着上调可能与机体抑制球虫发育增殖或清除球虫感染有关。综上所述,本研究发现柔嫩艾美耳球虫子孢子可以入侵巨噬细胞,但在细胞内不能够发育,并且巨噬细胞对子孢子没有消化或其他不良影响,但巨噬细胞产生了大量的细胞因子,为巨噬细胞的抗球虫免疫反应提供了理论依据。
戴玉[2]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究》文中指出柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）是分布最广、致病力最强的几种球虫之一,严重危害养禽业,造成重大的经济损失。目前药物防治是控制球虫病的有效手段,但随着抗球虫株的产生及绿色食品概念的形成,抗球虫新型疫苗的研究成为热点。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1细胞感染模型,通过分泌蛋白质组分析筛选到的一种上调表达蛋白。为探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作为候选疫苗抗原蛋白,本研究对EtSAG13基因进行原核表达,以E.tenella子孢子cDNA为模板进行扩增,按照GenBank的基因序列合成引物,将合成的EtSAG13基因序列连接到pET28a（+）载体上,构建了pET28a-SAG13重组质粒,并将pET28a-SAG13重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导EtSAG13目的基因的表达;用SDS-PAGE及免疫印迹法对表达蛋白进行分析和鉴定。将EtSAG13表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,进行亚细胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同时部分蛋白可以分泌到裂殖子细胞外,具有分泌特性。本研究将pET28a-EtSAG13亚单位疫苗组作为试验组,通过鸡球虫攻毒试验,对EtSAG13蛋白重组亚单位疫苗免疫效果进行了评价。将90只个体差异不大的雏鸡随机分成1组（EtSAG13免疫感染球虫组）、2组（不免疫不感染球虫组）、3（不免疫感染球虫组）,每组30只鸡,以比较pET28a-EtSAG13亚单位疫苗的免疫效果。7日龄时,用完全弗氏佐剂充分乳化后的蛋白对1组进行颈部皮下多点注射,免疫剂量为100μg/只,另外两组注射等量PBS;待14日龄时,用不完全弗氏佐剂等比例乳化EtSAG13蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对1、3组接种2万个新鲜的具有感染活性的E.tenella孢子化卵囊。免疫结果表明:pET28a-EtSAG13亚单位疫苗免疫后,鸡体的CD3+CD4+和CD3+CD8+比例显着升高,表明该免疫能诱导显着性的细胞免疫反应和体液免疫反应;在盲肠病变计分（LS）方面,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡盲肠病变计分显着低于不免疫攻虫组（3组）（p<0.05）;试验组鸡与不免疫攻虫的对照组相比增重明显,且卵囊排出量显着下降,肠道损伤明显减轻;在血清抗体检测中,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡IgG水平显着高于空白对照组和不免疫攻虫组。试验结果表明,EtSAG13蛋白定位在子孢子表面,并能够分泌到细胞外,具有分泌特性;EtSAG13蛋白亚单位疫苗能够对E.tenella感染提供一定的免疫保护力。本研究鉴定了EtSAG13蛋白的分泌特性和免疫原性,为下一步研究EtSAG13蛋白在入侵过程中的具体分子功能和研制新型鸡球虫疫苗提供基础。
赵宁宁[3]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中认为鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
余水兰[4]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
华恩玉[5]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中研究表明鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
张赞[6]（2019）在《递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究》文中提出鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）一种或多种球虫所引发的原虫病,呈全世界性分布。该病危害性大、感染率高,是造成世界范围内家禽业严重经济损失的原因之一。目前该病的防治仍然以化学药物和活疫苗为主,但由此导致的药物残留、耐药性及新抗虫药开发困难等问题越来越严峻。活疫苗存在毒力返强、散毒等安全隐患,所以人们更加重视新型安全疫苗的研发。DNA疫苗具有安全、稳定、易制备的优点,并通常将细胞因子作为佐剂与DNA疫苗共同免疫机体,从而达到增强疫苗免疫效果的目的。乳酸菌作为益生菌具有定殖力强、易于培养、免疫调节等特点,可成为DNA疫苗的理想活载体,通过口服的方式将DNA疫苗递送到机体细胞内,从而引发局部或全身的免疫反应。为了提高乳酸菌对DNA疫苗的递送效率,本研究以新型的真核质粒pValac为表达载体,柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella,E.tenella）的微线体蛋白2（EtMIC2）为保护性抗原,以鸡白介素18（ChIL18）作为佐剂构建出重组质粒,由表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白A（FnBPA）的侵入型乳酸菌为载体递送到鸡体内,提高DNA疫苗的递送效率,并对机体产生的免疫水平及抗E.tenella保护效果进行评价。具体研究内容及结果如下:（1）表达EtMIC2蛋白和ChIL18的DNA疫苗构建及体外验证参考GenBank登录的EtMIC2及IL18序列,优化并常规合成基因EtMIC2-IL18,通过PCR扩增EtMIC2和EtMIC2-IL18基因片段,并分别连接至pValac载体上,双酶切和碱基序列测定结果表明重组质粒pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18构建成功。转染HEK-293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测EtMIC2和IL18蛋白在细胞质中表达。（2）携带DNA疫苗的侵入型乳酸菌的构建及体外侵入能力检测将pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18两种真核质粒,转化至NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA重组乳酸菌感受态中,构建出pValac-EtMIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA四种菌株,经SPPIP诱导剂诱导表达后,通过Western blot检测FnBPA蛋白的表达情况,结果表明转入真核质粒后的侵入型乳酸菌的FnBPA蛋白成功表达。通过与分离的CEF细胞共培养2个小时,洗涤后,室温裂解10min,最后进行菌落计数并计算细胞侵袭率。结果显示pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率达到0.25%,而pValac-EtMIC2/pSIP409作为对照菌株的侵袭率仅为0.09%。同样pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率为0.15%,pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409菌株的侵袭率为0.08%。表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌的细胞侵袭率显着高于非侵入型乳酸菌（P<0.001）。（3）侵入型乳酸菌对雏鸡免疫水平的影响及抗E.tenella保护效果评价健康的1日龄肉雏鸡,随机分为6组,每组20只,分别为生理盐水组（GroupI）、攻虫组（GroupII）、pValac/pSIP409组（GroupIII）、pValac-EtMIC2/pSIP409组（GroupIV）、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA组（GroupV）、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA组（GroupVI）。在1、3、5、12、14、16日龄进行口服免疫,每只免疫剂量为1×109CFU/200μL,并在30日龄进行攻虫（GroupI除外）,攻虫剂量为5×104个/只。对每组雏鸡外周血CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴细胞的发育情况、外周血中淋巴细胞增殖能力、肠道刮取物分泌型抗体SIgA、血清中特异性抗体及细胞因子含量进行检测。并对感染球虫一周后雏鸡的相对增重率、卵囊排出量、盲肠病变积分及抗球虫指数等指标进行统计。动物试验结果表明,在30d（攻虫前）,与GroupI相比,GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD4+T淋巴细胞含量显着较高（P<0.05）;在38d（攻虫后）,GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD4+T淋巴细胞含量均显着高于GroupIII（P<0.01）。同样,在30d测得GroupVI雏鸡外周血中的CD3+CD8+T淋巴细胞含量约35%,显着高于GroupIII（P<0.05）;在38d测得GroupIV、GroupV、GroupVI均显着高于GroupIII（P<0.001）,其中GroupVI含量最高约为43%。对各组雏鸡外周血淋巴细胞增殖能力进行检测,结果表明,攻虫前后GroupVI增殖能力均最强,在30d时GroupVI刺激指数约为1.3,显着高于GroupIII（P<0.001）;在38d时,GroupVI刺激指数约为1.5,同样其增殖水平显着高于GroupIII（P<0.001）。本研究在攻虫前对各组雏鸡血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-18的含量进行了检测,其中GroupVI雏鸡的IFN-γ含量较其他免疫组高,显着高于GroupIII（P<0.01）。GroupVI中IL-18的含量显着高于各组（P<0.001）。GroupVI肠道刮取物中SIgA的分泌量最高,且显着高于GroupV（P<0.05）。攻虫后,GroupV、GroupVI平均体重增长水平较高,相对于GroupI相对增重率分别为79.66%、84.75%。GroupIV、GroupV、GroupVI粪便中卵囊排出量明显减少,其相对于GroupII卵囊减少率分别为67.73%、69.75%、76.16%。攻虫一周后观察发现GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡的盲肠病变明显减轻,平均计分分别为1.3、1.1、0.9。最后得出各组ACI值,GroupIV、GroupV、GroupVI分别为162.27、167.66、174.75,均能达到良好的抗球虫效果,GroupVI效果最佳。本研究基于表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌为载体,携带pValac-EtMIC2-IL18真核质粒递送到宿主体内,并能提高机体的体液免疫和细胞免疫,增强机体对球虫的抵抗能力。以侵入型乳酸菌为载体递送DNA疫苗的方式为球虫的防治提供了新思路和新方法。
谢涛[7]（2019）在《复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响》文中研究说明本文通过研究复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响,筛选出饲粮中复合酸化剂的适宜添加水平;利用此适宜添加水平,研究其单独使用及与柴胡提取物联用对堆状艾美耳球虫攻毒后肉鸡生产性能、肠道健康和免疫功能的影响,探讨其是否复合酸化剂能缓解球虫攻毒引起的肉鸡生产性能下降及可能作用机制。试验一复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响试验采用单因素完全随机试验设计,设5个处理组,分别为球虫疫苗未攻毒组（PC）、球虫疫苗攻毒组（NC）、球虫疫苗攻毒+0.1%复合酸化剂添加组（NCA0.1%）、球虫疫苗攻毒+0.2%复合酸化剂添加组（NCA0.2%）、球虫疫苗攻毒+地克珠利添加组（NCD）。将420只1日龄的罗斯（ROSS）肉公鸡按体重无差异原则随机分到以上5个处理组中,每个处理7个重复,每个重复12只鸡。复合酸化剂由乳酸、富马酸、柠檬酸组成。于15日龄时,所有球虫攻毒组肉鸡灌服球虫疫苗（卵囊数为2.2×104个,包含柔嫩、巨型、毒害、堆型四种艾美耳弱毒球虫）。于21日龄时,采集血清、脾脏和空肠组织用于指标分析。结果显示:（1）与PC组相比,NC组和NCA0.2%组21d肉鸡体重（BW）和15-21d肉鸡体增重（BWG）显着降低（P<0.01）,其他处理组与PC组无显着差异;（2）与PC组相比,NC、NCA0.1%和NCA0.2%组肉鸡血清尿酸含量显着提高（P<0.01）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL）含量显着降低（P<0.05）;（3）与PC组相比,NC组肉鸡血清中白细胞介素-2（IL-2）和一氧化氮（NO）含量显着升高（P<0.001）;与NC组相比,添加酸化剂与地克珠利组降低了肉鸡血清中IL-2（P<0.001）和NO（P<0.05）的含量;（4）与PC组相比,NC、NCA 0.2%和NCD组脾脏IL-2 mRNA表达量显着升高（P<0.001）,NCA 0.2%组白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达量显着升高（P<0.01）,NCA 0.1%组白细胞介素-10（IL-10）mRNA表达量显着降低（P<0.05）;其他处理组脾脏IL-2、IL-6或IL-10 mRNA表达量与PC组无显着差异。（5）与PC组相比,所有球虫攻毒组空肠紧密连接蛋白2（zonula occudens-2,ZO-2）和闭合小环蛋白2（mucin 2,MUC2）mRNA表达量显着降低（P<0.05）;与PC组相比,NC和NCA 0.2%组空肠闭锁蛋白（occludin,OCLN）mRNA表达量显着降低（P<0.05）,但NC0.1%与对照组无显着差异。以上结果表明,添加0.1%的复合酸化剂能缓解球虫疫苗攻毒引起的生长前期肉鸡（15-21d）生产性能下降。试验二复合酸化剂及其与柴胡提取物联用对堆型艾美耳球虫攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响试验采用单因素试验设计,设5个处理组,分别为球虫未攻毒对照组（PC）、球虫攻毒组（NC）、球虫攻毒+0.1%复合酸化剂添加组（NCA）、球虫攻毒+0.1%柴胡提取物添加组（NCB）以及球虫攻毒+0.1%复合酸化剂和0.1%柴胡提取物联用组（NCAB）。将480只1日龄的ROSS 308肉鸡按体重无差异原则随机分到以上5个处理组中,每个处理6个重复,每个重复公鸡、母鸡各8只,共16只鸡。于15日龄时,所有的球虫攻毒组肉鸡灌喂堆型艾美耳球虫（卵囊数为7.8×104个）。于21日龄时,采集肉公鸡全血、血清、脾脏和十二指肠用于指标分析。试验结果显示:（1）未攻毒阶段,添加复合酸化剂显着提高14日龄肉鸡体重（BW）和1-14日龄体增重（BWG）（P=0.001）,降低料重比（P<0.05）。球虫攻毒后,与PC组相比,所有球虫攻毒组15-21d肉鸡BWG（P<0.001）和AFI均有降低（P<0.1）;但与NC组相比,NCA和NCAB组肉鸡的BWG显着增加（P<0.05）。（2）与NC组相比,NCB组降低了球虫攻毒后第5天粪便中的球虫卵囊数（P<0.05）,NCAB组降低了球虫攻毒后第5天和7天粪便中的球虫卵囊数（P<0.01）。（3）与PC组相比,NC、NCA和NCAB组肉鸡血液中CD3+CD4+细胞含量显着增加（P<0.01）;与NC相比,NCB组肉鸡血液中CD3+CD4+与CD3+CD8+细胞含量显着降低（P<0.05）。（4）与PC组相比,NC组肉鸡血清中IL-1β和IFN-γ含量和iNOS酶活显着升高;与NC组相比,NCA、NCB和NCAB组以上3个指标均显着降低（P<0.05）。（5）与PC组相比,NCB和NCAB组肉鸡脾脏IL-6 mRNA表达量显着升高（P<0.001）,NCAB组IL-2 mRNA表达量显着升高（P<0.001）;（6）与PC组相比,所有球虫攻毒组肉鸡十二指肠绒毛高度（P<0.001）和绒隐比均显着降低（P<0.001）,隐窝深度显着增加（P<0.001）。与NC组相比,NCA、NCB和NCAB组隐窝深度显着增加（P<0.001）。（7）与PC组相比,所有球虫攻毒组十二指肠OCLN mRNA表达量降低（P<0.05）,MUC-2 mRNA表达量增加（P<0.001）。与NC组相比,添加酸化剂降低了CLDN1和MUC-2 mRNA表达量（P<0.05）,添加柴胡提取物降低了MUC-2 mRNA表达量（P<0.001）。以上结果表明,添加0.1%的复合酸化剂和/或0.1%的柴胡提取物均能够缓解堆型球虫攻毒引起的生长前期肉鸡（15-21d）生产性能下降,可能与其改变炎症反应和肠道形态结构有关;但二者同时添加未见加和效应。综合以上两个试验的研究结果,0.1%复合酸化剂可以缓解球虫攻毒引起的生长前期肉鸡生产性能下降,这可能与酸化剂改善了肉鸡免疫功能和肠道健康有关。
郝飞飞[8]（2019）在《鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究》文中指出为探讨基因佐剂IL-2、IL-4对鸡球虫病活疫苗的免疫增强效果和安全性,本试验使用SPF雏鸡,以基因佐剂pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP配合鸡球虫病三价四株活疫苗对雏鸡进行免疫攻毒,对基因佐剂的免疫增效作用进行检验;同时对基因佐剂的实验室安全性和体内分布表达情况进行研究。结果表明:（1）各佐剂接种组均能达到疫苗效力检验标准;随给药剂量的增加,免疫攻毒后鸡只的相对增重率（RWG）、抗球虫指数（ACI）升高;但剂量超过250μg/只时,其ACI、RWG反而下降;100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药,50μg/只pCI-chIL-2-EGFP和200μg/只pCI-chIL-4-EGFP联合给药时,ACI值均达到高效。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP联合给药剂量分别为100μg/只、50μg/只和200μg/只。（2）球虫疫苗免疫同时肌注100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP,免疫间隔时间佐剂添加组≥6 d、免疫攻毒组≥7 d时,均可达到良好免疫效果,符合效力检验标准。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可使鸡球虫病活疫苗免疫间隔缩短1 d。（3）口服组（100300μg/只）ACI随接种剂量增加而升高。其中当口服给药为300μg/只时,其ACI（188.41）与肌注100μg/只ACI（190.49）接近,达到高效。表明鸡口服pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可以起到免疫增效作用,但给药剂量为肌注的3倍。（4）佐剂添加组在二免后≥5 d和免疫攻毒组≥6 d攻毒时,符合效力检验标准。表明球虫疫苗配合接种100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP时,免疫产生期缩短1 d。（5）pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP一次单剂量（100μg/只）、重复单剂量、一次超剂量（10倍）肌注组均无鸡死亡;鸡体温均在39.640.7℃之间,符合健康鸡正常体温;实验组平均增重与空白组差异不显着（p>0.05）;各组鸡未见眼观和镜检病变,基因佐剂未在体内的微生物中进行转移整合。表明该佐剂的安全性符合兽用生物制品的要求。（6）以100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP肌注和口服给药鸡,接种部位最先检测到质粒;其次是血液和心脏;肝、脾、肾和肺在最后。其中肌注部位肌肉最长可达21 d;并可从注射后8 h持续表达到14 d。表明基因佐剂通过肌注途径接种可以在体内存在21d,佐剂肌注在体内分布和表达的时间长于口服。
周雪[9]（2019）在《鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白EtCaBP免疫原性研究》文中提出鸡球虫病是鸡球虫寄生在鸡的小肠及盲肠上皮细胞内引起的的专性寄生虫病,给养禽业造成巨大经济损失。目前药物防治和疫苗预防措施均无法使防治球虫病达到理想的效果。因此,寻找抗原性较好的蛋白去研制廉价高效的新型疫苗成为防治球虫病的关键。本研究中ETH00009450是通过蛋白质组学分析筛选出,并分析到该基因在鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）入侵DF1细胞时其表达量上调了1.569倍,本研究选取此基因开展研究。首先对EtCaBP基因进行一系列生物学分析,从该基因的氨基酸序列二级及三级结构的分析显示该基因表达蛋白为钙结合蛋白（CaBP）,具有特征性的EF-hand钙结合结构域,它们能与钙离子发生作用,在细胞内钙信号转导及钙稳态等各种生命活动机制中发挥重要作用。因此推测该基因是否与球虫入侵宿主细胞相关,从而研究该蛋白的免疫原性,为研究防治鸡球虫病新型疫苗提供候选蛋白的筛选。对EtCaBP（Eimeria tenella钙结合蛋白）生物学信息分析后,本研究通过PCR扩增获取基因片段,经再经NcoⅠ和HindⅢ酶切后克隆至原核表达载体pET32a-EtCaBP,转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）菌株中,经IPTG诱导表达并纯化EtCaBP蛋白,制备亚单位疫苗,免疫小鼠后制备出鼠源多克隆抗体。构建酵母表面展示系统将EtCaBP蛋白展示在酵母表面,鉴定制备的多克隆抗体。本研究通过鸡球虫感染试验对EtCaBP亚单位疫苗的免疫效果进行了评价,从而探究EtCaBP蛋白的免疫原性。将120只个体差异不大的雏鸡随机分成A组（EtCaBP免疫接种球虫组）、B（EtCaBP免疫不接种球虫组）、C（不免疫接种球虫组）、D组（不免疫不接种球虫组）,每组30只。7日龄时,用完全弗氏佐剂乳化后的蛋白对A、B两组进行颈部皮下多点注射免疫,免疫量为100ug/只,C、D两组注射等量PBS;14日龄时,用不完全弗氏佐剂乳化蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对A、C两组接种10000个新鲜的E.tenella孢子化卵囊。结果表明EtCaBP蛋白无跨膜区但具有信号肽序列,二级结构预测显示主要以α螺旋为主,含有5个EF-hand钙结合结构,通过三级结构预测发现与CBP40(Physarum polycephalum特异性Ca2+结合蛋白LAV1-2)结构相似,相似度为66%。本研究成功克隆出EtCaBP基因,并构建原核表达载体表达出可溶性蛋白,纯化蛋白成功制备鼠源多克隆抗体。31日龄,整理数据进行结果分析,通过对比组间的体重增长、相对增重率、卵囊排出量、盲肠病值、抗球虫指数、淋巴细胞转化、细胞因子荧光定量分析等指标对EtCaBP亚单位疫苗的免疫保护效果进行了评价。EtCaBP免疫接种组的相对增重率、卵囊值、盲肠病变值和抗球虫指数分别为88.9%、10、23.7、155.20。结果显示EtCaBP蛋白免疫后一定程度上可以减少E.tenella感染对鸡体重增长的抑制作用,减少卵囊排出量和减轻病变程度,抗球虫效果是有效的。综上所述,EtCaBP蛋白具有钙结合蛋白的EF-hand钙结合结构域,具有一定的免疫原性,对鸡感染球虫有一定的免疫保护作用。
贡鑫[10]（2018）在《鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究》文中认为为了提高鸡球虫病活疫苗免疫效果,增强免疫保护力,降低活疫苗副作用,缩短免疫产生期,通过以鸡白介素4（chIL-4）和鸡白介素2（chIL-2）为研究对象,构建新型细胞因子免疫佐剂chIL-4和chIL-2融合基因表达载体,研究该融合基因的佐剂作用。试验结果表明:（1）采用基因合成与双酶切连接技术,经测序鉴定成功构建携带鸡白介素4、鸡白介素2以及二者融合基因的重组真核表达载体pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP。（2）采用HilyMax脂质体介导方法转染小鼠成肌细胞C2C12,对转染条件进行优化,在荧光显微镜下观察,通过IPP软件分析其累计光密度值。结果表明,重组载体pCI-chIL-2-EGFP能在小鼠成肌细胞内正确表达,DNA与Hilymax脂质体比例为1:3时细胞转染率最高（29.65%±2.58%）,转染72h后蛋白表达量达到最高。（3）将构建的 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞,24h-96hmRNA表达量均先升高后降低,48h极显着（P<0.01）高于其他时间段,达到峰值;累积光密度值先升高后降低,72h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于24h和48h,达到峰值,到96h已检测不到;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显着（P<0.01）高于其余三个时间段,达到峰值。转染小鼠成肌细胞24h-96h,mRNA和蛋白表达量均先升高后降低,mRNA 48h和蛋白72h极显着高于其他时间段,达到峰值;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显着（P<0.01）高于其余三个时间段,达到峰值,表明三种重组质粒均能在三种细胞中进行表达,并能持续72h以上,三种重组蛋白均能分泌到细胞外,并在72h达峰值。（4）pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞和小鼠成肌细胞三种细胞24h-96h的上清液均能极显着（P<0.01）促进鸡脾淋巴细胞的增殖,刺激指数均先升高后降低,72h达峰值,表明三种重组蛋白都具有生物学活性;而pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒转染细胞的上清液对鸡脾淋巴细胞的增殖极显着（P<0.01）高于另外两种重组质粒,表明chIL-4-chIL-2融合蛋白的生物学活性显着高于chIL-4重组蛋白或chIL-2重组蛋白。
二、雏鸡感染堆型艾美耳球虫早熟株外周血T淋巴细胞的动态变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、雏鸡感染堆型艾美耳球虫早熟株外周血T淋巴细胞的动态变化（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词英汉对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病及防治现状 |
| 1.1.1 鸡球虫病病原 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病防治现状及最新探索 |
| 1.2 鸡球虫对宿主细胞的入侵 |
| 1.3 鸡球虫细胞培养的研究现状及进展 |
| 1.4 鸡免疫系统 |
| 1.4.1 B淋巴细胞 |
| 1.4.2 T淋巴细胞 |
| 1.4.3 巨噬细胞 |
| 1.4.3.1 鸡巨噬细胞来源 |
| 1.4.3.2 巨噬细胞与寄生虫的相互作用 |
| 1.4.4 NK细胞 |
| 1.5 抗艾美耳球虫的先天性免疫反应和获得性免疫反应 |
| 1.5.1 抗体反应 |
| 1.5.2 细胞免疫 |
| 1.5.3 细胞因子及 NO 在抗球虫感染中的作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫子孢子在HD11细胞中的体外培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 鸡巨噬细胞和虫株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡球虫的复壮与传代 |
| 1.2.2 球虫卵囊的收集与孢子化 |
| 1.2.3 无菌子孢子的提取 |
| 1.2.4 HD11细胞的复苏与培养 |
| 1.2.5 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中的体外培养 |
| 2 结果 |
| 2.1 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中体外培养的研究 |
| 2.1.1 孢子化卵囊和子孢子的收集与纯化 |
| 2.1.2 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中的培养 |
| 2.1.3 柔嫩艾美耳球虫在CEK细胞中的培养 |
| 2.1.4 接种时间的确定 |
| 2.1.5 接种剂量的确定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫感染HD11细胞免疫反应的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 鸡巨噬细胞和虫株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 鸡球虫的复壮与传代 |
| 1.2.2 球虫卵囊的收集与孢子化 |
| 1.2.3 无菌子孢子的提取 |
| 1.2.4 HD11细胞的复苏与培养 |
| 1.2.5 柔嫩艾美耳球虫感染HD11 细胞细胞内NO和 ROS的检测 |
| 1.2.6 细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7表达水平检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 柔嫩艾美耳球虫子孢子感染HD11 细胞后细胞内NO和 ROS的检测 |
| 2.2 柔嫩艾美耳球虫感染相关的8种宿主细胞因子表达水平检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.2 鸡球虫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫分子生物学研究进展 |
| 1.2.2 鸡球虫分泌蛋白研究概况 |
| 1.2.2.1 微线蛋白 |
| 1.2.2.2 蛋白激酶 |
| 1.2.2.3 棒状体蛋白 |
| 1.3 鸡球虫病防治概况 |
| 1.3.1 药物防治 |
| 1.3.2 疫苗研究进展 |
| 1.3.2.1 鸡球虫免疫机制 |
| 1.3.2.2 传统疫苗和商品化疫苗 |
| 1.3.2.3 新型疫苗研究进展 |
| 1.3.3 鸡球虫免疫应答的研究进展 |
| 1.4 EtSAGs家族蛋白 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株和载体 |
| 2.1.2 试验动物与虫株 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 鸡球虫复壮与传代 |
| 2.2.3 鸡球虫的收集与孢子化卵囊的收集 |
| 2.2.4 EtSAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆与转化 |
| 2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR产物的回收 |
| 2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和载体双酶切和胶回收 |
| 2.2.4.4 目的基因酶切产物与pET-28a(+)载体的连接 |
| 2.2.4.5 重组质粒转化入Top10 感受态细胞 |
| 2.2.4.6 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.2.4.7 重组质粒DNA的提取与鉴定 |
| 2.2.4.8 阳性克隆质粒测序鉴定 |
| 2.2.5 EtSAG13 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.5.1 EtSAG13 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.5.2 EtSAG13 重组蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测 |
| 2.2.5.3 重组EtSAG13 蛋白纯化 |
| 2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6.2 EtSAG13 的亚细胞定位分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.7 SAG13 蛋白免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.1 动物试验设计与免疫程序 |
| 2.2.7.2 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.2.1 存活率 |
| 2.2.7.2.2 增重效果 |
| 2.2.7.2.3 卵囊排出量 |
| 2.2.7.2.4 盲肠病变计分 |
| 2.2.7.2.5 抗球虫指数(ACI)评价 |
| 2.2.7.2.6 血清和粘膜抗体检测 |
| 2.2.7.2.7 细胞免疫水平的检测 |
| 2.2.7.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 3.2 EtSAG13 重组克隆载体的测序结果 |
| 3.3 EtSAG13 多克隆抗体的制备及鉴定结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE与 Western Blot验证EtSAG13 蛋白的原核表达 |
| 3.3.2 EtSAG13 原核重组蛋白的大量诱导及纯化 |
| 3.3.3 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定结果 |
| 3.3.4 E.tenella虫体EtSAG13 蛋白间接免疫荧光定位结果 |
| 3.4 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果的评价 |
| 3.4.1 体重增长情况 |
| 3.4.2 盲肠病变计分 |
| 3.4.3 卵囊排出量 |
| 3.4.4 抗球虫指数(ACI)结果 |
| 3.4.5 血清抗体水平检测结果 |
| 3.4.6 粘膜抗体水平检测结果 |
| 3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EtSAG13 重组蛋白分泌蛋白鉴定 |
| 4.2 原核表达EtSAG13 蛋白的意义及其免疫保护效果 |
| 4.3 血液抗体和粘膜抗体以及T淋巴细胞在抗球虫感染免疫保护中的作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（3）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（4）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 鸡球虫种类及生活史 |
| 1.2 鸡体抗球虫的相关免疫保护机制 |
| 1.3 鸡球虫病疫苗的种类 |
| 1.4 细胞因子作为鸡球虫DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 1.5 E.tenella微线体蛋白的研究 |
| 1.6 乳酸菌作为DNA疫苗载体的研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 携带DNA疫苗的侵入型乳酸菌的构建及体外验证 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 侵入型乳酸菌抗柔嫩艾美耳球虫保护效果评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸡球虫病概述 |
| 1.1 鸡球虫病的分类 |
| 1.2 临床症状 |
| 1.3 病理变化 |
| 1.4 药物防治 |
| 2 酸化剂 |
| 2.1 酸化剂的概述 |
| 2.2 酸化剂的分类 |
| 2.3 酸化剂的作用机理 |
| 3 柴胡 |
| 3.1 柴胡及其提取物的研究进展 |
| 3.2 柴胡的作用 |
| 4 酸化剂和柴胡提取物在抗球虫上的应用 |
| 第二章 本研究存在的问题、目的、意义和技术路线 |
| 1 存在的问题、试验目的及意义 |
| 1.1 存在的问题 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 2 技术路线 |
| 第三章 试验一复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响 |
| 1 试验目的 |
| 2 试验材料和方法 |
| 2.1 试验处理与安排 |
| 2.2 动物和饲粮 |
| 2.3 饲养管理 |
| 2.4 样品采集 |
| 2.5 指标测定 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 试验结果与分析 |
| 3.1 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡生产性能的影响 |
| 3.2 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡屠宰性能的影响 |
| 3.3 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡胃肠道pH的影响 |
| 3.4 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡免疫器官指数的影响 |
| 3.5 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡血清生化指标的影响 |
| 3.6 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡血清免疫指标的影响 |
| 3.7 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡空肠紧密连接基因相对表达量的影响 |
| 3.8 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡脾脏炎性因子基因相对表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡生产性能的影响 |
| 4.2 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡血清生化指标的影响 |
| 4.3 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡屠体性能和肠道pH的影响 |
| 4.4 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡免疫功能的影响 |
| 4.5 复合酸化剂对球虫疫苗攻毒肉鸡肠道健康的影响 |
| 5 小结 |
| 第四章 试验二复合酸化剂及其与柴胡提取物联用对堆型艾美耳球虫攻毒肉鸡生产性能和肠道健康的影响 |
| 1 试验目的 |
| 2 试验材料和方法 |
| 2.1 试验处理与安排 |
| 2.2 试验动物与饲粮 |
| 2.3 饲养管理 |
| 2.4 球虫攻毒处理 |
| 2.5 样品采集与制备 |
| 2.6 指标测定 |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 试验结果与分析 |
| 3.1 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡生产性能的影响 |
| 3.2 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡抗球虫效果的影响 |
| 3.3 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡血清生化指标的影响 |
| 3.4 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡全血血常规的影响 |
| 3.5 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡血清淋巴细胞的影响 |
| 3.6 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡血清免疫指标的影响 |
| 3.7 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡免疫器官指数的影响 |
| 3.8 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡十二指肠形态的影响 |
| 3.9 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡十二指肠粘膜紧密连接基因相对表达量的影响 |
| 3.10 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡脾脏炎性因子基因相对表达量的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡生产性能的影响 |
| 4.2 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡血清生化指标的影响 |
| 4.3 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡免疫功能的影响 |
| 4.4 复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡十二指肠肠道健康的影响 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病研究进展 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病免疫机制研究 |
| 1.3 鸡球虫病疫苗研究进展 |
| 2 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.1 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.2 鸡球虫病基因佐剂的分类与作用机制 |
| 2.3 细胞因子基因佐剂在鸡球虫病防控中的应用 |
| 2.3.1 鸡白介素2 |
| 2.3.2 鸡白介素4 |
| 3 鸡球虫病基因佐剂免疫效果的主要影响因素 |
| 3.1 免疫途径 |
| 3.2 免疫剂量 |
| 3.3 免疫次数 |
| 4 基因佐剂体内分布研究 |
| 5 安全性评价 |
| 6 本课题的目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株及球虫 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 质粒制备 |
| 2.1.1 冻存菌活化 |
| 2.1.2 菌液裂解 |
| 2.1.3 质粒纯化 |
| 2.1.4 纯化质粒检测 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选 |
| 2.2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注免疫增效比较 |
| 2.2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性试验 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达鉴定试验 |
| 2.4.1 动物分组及处理 |
| 2.4.2 PCR敏感度测定 |
| 2.4.3 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内分布检测 |
| 2.4.4 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内表达检测 |
| 2.5 检测指标和判定标准 |
| 2.6 数据处理 |
| 试验结果 |
| 1 质粒制备结果 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选结果 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服效果和肌注效果比较 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达试验 |
| 4.1 引物特异性及敏感性测定结果 |
| 4.2 基因佐剂体内分布及代谢鉴定结果 |
| 4.2.1 基因佐剂在体内微生物中的转移情况 |
| 4.2.2 基因佐剂的组织分布结果 |
| 4.3 基因佐剂体内转录鉴定结果 |
| 4.3.1 荧光显微镜观察蛋白表达 |
| 4.3.2 组织中基因佐剂转录结果 |
| 讨论分析 |
| 1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗免疫增效作用研究 |
| 1.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药剂量筛选 |
| 1.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药间隔筛选 |
| 1.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注效果比较 |
| 1.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附图 |
| 致谢 |
（9）鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白EtCaBP免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.2 钙结合蛋白概述 |
| 1.2.1 EF-hand蛋白家族 |
| 1.2.2 EF-hand结构 |
| 1.2.3 EF-hand结构模式 |
| 1.2.4 S100 蛋白家族 |
| 1.2.5 膜联蛋白(Annexin)家族 |
| 1.3 顶复门寄生虫中的钙结合蛋白 |
| 1.4 国内外研究进展 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、虫种和实验动物 |
| 2.1.2 引物、载体、酶和试剂 |
| 2.1.3 相关溶液的配制与培养基的成分 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 EtCaBP基因序列的生物学分析 |
| 2.2.2 EtCaBP基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 EtCaBP鼠源多克隆抗体的制备及检测 |
| 2.2.4 免疫和感染动物 |
| 2.2.5 亚单位疫苗免疫保护力评价 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EtCaBP基因序列生物学分析 |
| 3.2 EtCaBP基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 3.2.1 EtCaBP基因扩增 |
| 3.2.2 EtCaBP基因克隆 |
| 3.2.3 原核表达载体构建 |
| 3.3 EtCaBP蛋白多克隆抗体制备及检测 |
| 3.3.1 SDS-PAGE与 Western检测EtCaBP蛋白原核表达 |
| 3.3.2 原核重组蛋白大量诱导与纯化 |
| 3.3.3 蛋白浓度测定 |
| 3.3.4 多克隆抗体鉴定 |
| 3.4 亚单位疫苗免疫保护效果评价 |
| 3.4.1 体重增长情况 |
| 3.4.2 盲肠病变计分 |
| 3.4.3 卵囊排出量情况 |
| 3.4.4 抗球虫指数 |
| 3.4.5 淋巴细胞转化检测 |
| 3.4.6 CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群分析 |
| 3.4.7 细胞因子水平评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病的研究概况 |
| 1.1 分类 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 流行特点 |
| 1.4 致病性 |
| 2 鸡球虫病免疫预防研究进展 |
| 2.1 免疫原性 |
| 2.2 免疫应答 |
| 3 鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 强毒活疫苗 |
| 3.2 弱毒活疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 4 细胞因子免疫佐剂的研究进展 |
| 4.1 宿主免疫应答 |
| 4.2 细胞因子佐剂的作用 |
| 5 细胞因子融合蛋白研究进展 |
| 6 本课题的目的和意义 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株与质粒 |
| 1.2 试验细胞、鸡胚和鸡 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 阳离子脂质体HilyMax浓度对重组融合蛋白表达质粒转染细胞的影响 |
| 2.3 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒细胞转染和表达效果的测定 |
| 2.4 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒表达分泌蛋白量的测定 |
| 2.5 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒mRNA相对表达量的测定 |
| 2.6 重组融合蛋白分泌活性测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2 阳离子脂质体HilyMax浓度对重组融合蛋白表达质粒转染细胞的影响 |
| 3.3 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒细胞转染和表达效果 |
| 3.4 重组融合蛋白分泌活性 |
| 4 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 攻读硕士期间科研情况 |
| 致谢 |
四、雏鸡感染堆型艾美耳球虫早熟株外周血T淋巴细胞的动态变化（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平[D]. 蒋保余. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [2]鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究[D]. 戴玉. 山东农业大学, 2020(11)
- [3]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [4]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [5]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [6]递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究[D]. 张赞. 吉林农业大学, 2019
- [7]复合酸化剂和柴胡提取物对球虫攻毒肉鸡生产性能和免疫功能的影响[D]. 谢涛. 四川农业大学, 2019
- [8]鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究[D]. 郝飞飞. 山西农业大学, 2019(07)
- [9]鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白EtCaBP免疫原性研究[D]. 周雪. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究[D]. 贡鑫. 山西农业大学, 2018