一、腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展（论文文献综述）
杜文静[1]（2021）在《一种Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶的纯化包覆及催化性能研究》文中研究说明腈水合酶（nitrile hydratase,英文简称NHase）是金属酶的一种,主要应用在催化含有碳氮三键有机官能团的氰基化合物所经过水合成反应生成的对应酰胺类物质。因为该腈水合酶的产物专一性高、常温加压下可操作、副产物少、减少污染等优势,更适合目前绿色化学的发展方向。目前,生物催化技术已逐渐替代传统化学方法应用于化工工业领域、农业领域及医药领域等。但是,游离的腈水合酶在参与催化反应过程中以及其保存过程中存在着稳定性差,难以保存和容易失活等诸多缺陷。因此,探究腈水合酶的催化性能,并通过酶的固定化方式,制成固定化的腈水合酶（纳米生物催化剂）。这种方式既可以在使用方面解决游离酶存在的大部分问题,又可以实现工业上的连续生产,对我国具有很大的经济价值和可持续发展意义。本课题前期工作中发现了一种来源于Rhodococcus erythropolis CCM2595的腈水合酶（ReNHase）,在本研究中进一步探究了该酶学性质及其纯化包覆后的催化性能,主要研究结果如下:（1）成功构建了用于纯化的带有组氨酸标签的ReNHase基因的质粒,并在重组大肠杆菌中进行异源表达,利用AKTA蛋白分离纯化仪纯化了ReNHase。（2）利用高效液相色谱法探究ReNHase的底物谱。发现该ReNHase对二腈类化合物（特别是己二腈）具有显着的催化活性和区域选择性。与全细胞催化相比,纯化的ReNHase对以上底物谱催化时间明显缩短,并显着提高了对单腈类化合物的转化率。（3）检测分析了ReNHase对己二腈的酶促反应动力学常数。ReNHase比酶活为63.107 U/mg,与全细胞催化相比提高了104倍。与己二腈反应的表观Km值为6.6252mmol/L,表明ReNHase与己二腈具有良好的亲和力。反应Kcat为82.77 s-1,Kcat/Km为1.249×104(mol-1*L*s-1),说明ReNHase对己二腈具有较高的转化率。同时检测了腈水合酶的最适反应温度为35℃,最适反应p H为7.4,并且发现在p H 5-9范围内,ReNHase依然可以保持70%以上的催化活性,说明ReNHase具有良好的酸碱稳定性。（4）制备沸石咪唑盐框架ZIF-67及ReNHase@ZIF-67生物催化剂。运用多种表征方法（扫描电子显微镜、热重分析等）对ZIF-67进行表征,实验结果表明ZIF-67成功合成。同时实验测得ZIF-67的孔径为3.49?,根据ReNHase的最大直径为2.65?,初步判断ReNHase@ZIF-67可以通过原位合成的方式进行合成。同时利用催化反应测定初步合成的ReNHase@ZIF-67的催化活性,实验结果表明,ReNHase@ZIF-67相对于纯化的ReNHase依然保持一定的催化活性,但是活性大幅度降低,推测原因有:（1）ReNHase是铁离子型金属酶,可能在纯化过程中金属活性中心与Ni2+-NTA树脂结合,造成部分酶活损失,（2）聚合物-ZIF杂化虽然可以增强酸性条件下ZIF稳定性,但是因为咪唑能与金属发生螯合,也会使酶部分失活。结论:实现了腈水合酶（来源于红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595）的异源表达。该ReNHase具有广泛的底物谱,可在常温中性条件下催化不同腈类化合物,相对于单腈类化合物,ReNHase对二腈（特别是己二腈）具有显着的转化率、底物亲和力和区域选择性,ReNHase与全细胞催化相比,底物谱催化时间明显缩短,并显着提高了对单腈类化合物的转化率。腈水合酶催化剂ReNHase@ZIF-67虽然活性有一定程度的降低,可能是由于（1）ReNHase是铁离子型金属酶,可能在纯化过程中金属活性中心与Ni2+-NTA树脂结合,造成部分酶活损失,（2）聚合物-ZIF杂化虽然可以增强酸性条件下ZIF稳定性,但是因为咪唑能与金属发生螯合,也会使酶部分失活。我们的实验结果希望为ReNHase的固定化提供一定的理论依据。
张兆宇[2]（2020）在《泛生菌来源腈水合酶的大肠杆菌异源表达策略研究》文中研究表明腈水合酶（NHase,EC 4.2.1.84）是一种重要的工具酶,可催化腈类底物通过水合作用生成相应的酰胺。腈水合酶催化过程具有催化效率高、反应条件温和且无副产物等优势,已成为替代传统化学法实现高附加值酰胺化合物绿色高效合成的重要途径,被广泛用于医药、农药中间体等精细化工领域。目前工业上常利用红球菌、假诺卡氏菌、恶臭假单胞菌等产腈水合酶野生菌为生物催化剂,但面临培养周期长、产酶量少和蛋白纯化困难等缺陷。大肠杆菌表达系统具有培养简便、细胞生长速度快和蛋白表达量高等优势,是腈水合酶异源表达的理想宿主。然而,目前大肠杆菌表达腈水合酶常存在表达量低、包涵体严重等问题。本论文通过基因挖掘,筛选获得来源于泛生菌Pantoea sp.At-9b的腈水合酶NHase Ps,并利用大肠杆菌表达系统实现了其异源特异性表达。通过优化翻译起始区m RNA二级结构的方法,增加了β亚基表达量;通过融合标签蛋白策略优化了α亚基的可溶性表达,成功提高了NHase Ps在大肠杆菌中的表达量及活力,主要研究结果如下:（1）以腈水合酶保守区氨基酸序列为模板,利用基因挖掘法从生物信息数据库中挖掘新型腈水合酶基因,最终筛选获得来源于Rhodococcus fascians A76、Williamsia sterculiae strain CPCC 203464、Amycolatopsis thermoflava、Streptomyces thermoautotrophicus、Pantoea sp.At-9b以及Rhizobiales bacterium YIM 77505的6种腈水合酶基因,并利用大肠杆菌Escherichia.coli BL21（DE3）进行异源表达。考察了重组腈水合酶异源表达水平以及对丙烯酰胺的催化活力,其中来源于Pantoea sp.At-9b的腈水合酶NHase Ps酶活最高,为31 U/mg DCW。利用重组NHase Ps催化丙烯腈合成丙烯酰胺,0.3 g/L DCW在6.5 h内催化合成丙烯酰胺累积达到50g/L。（2）对重组腈水合酶NHase Ps在大肠杆菌中的异源表达进行了优化:首先,优化了α亚基和β亚基之间的linker序列,通过软件“RNAstructure”计算不同linker的最小折叠自由能（minimal folding free energy,ΔG）。自由能越高,其m RNA结构越松散,更容易被核糖体翻译。通过筛选不同的linker序列,优化β亚基基因翻译起始区m RNA二级结构,得到一株最高ΔG值的优化子NHase Ps M2（-16.8kcal/mol）。结果表明,NHase Ps M2酶活最高,活力为160 U/mg DCW。其次,设计多重SD序列优化策略,提高核糖体结合效率。以NHase Ps M2翻译起始区中SD-ATG序列为参考,设计不同组合的多重SD序列,得到最佳优化子NHase Ps M2-2,酶活为270 U/mg DCW。最后,考察了融合标签蛋白对α亚基可溶性表达的影响,通过在α亚基N端融合6种标签蛋白,提高α亚基的可溶性表达,其中PGB1 tag融合标签效果最好,融合标签腈水合酶NHase Ps（PGB1α）不仅使α亚基完全可溶性表达,而且提高了α亚基表达量,酶活达到558 U/mg DCW。（3）对腈水合酶NHase Ps（PGB1α）进行了表达条件优化与酶学性质研究,并考察了全细胞催化丙烯腈合成丙烯酰胺的反应进程。结果表明,在诱导温度为26℃,诱导剂IPTG终浓度为1.0 m M,钴离子浓度为0.2 m M时,重组腈水合酶NHase Ps表达最优;进一步考察了重组腈水合酶的酶学性质,发现其最适反应温度为30℃,最适反应p H为7.0,重组腈水合酶在30℃与40℃下半衰期分别为14 h和3.7 h。考察了重组腈水合酶反应动力学,计算得NHase Ps（PGB1α）、NHase Ps M2-2、NHase Ps的Km值分别为34.74、26.86、18.91 m M,Kcat/Km分别为0.108、0.074、0.067。利用全细胞催化底物丙烯腈,在催化剂用量为3.10 g/L DCW浓度时,产物丙烯酰胺终浓度达202 g/L。
蓝瑶[3]（2019）在《基于半理性设计和理性设计的腈水合酶酶活及其热稳定性的改造》文中研究指明腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）是一类催化腈类物质水合生成酰胺类产物的金属酶。酰胺类化合物作为化工原料或医药中间体被广泛应用,由于腈水合酶主导的生物催化法具有操作简单,催化效率高并且无副产物等优点,生物合成法已经取代化学合成法成为工业上生产酰胺类化合物的主要方法。但是大多数工业用腈水合酶酶活较低并且热稳定性不高,这极大限制了腈水合酶在工业上的进一步应用。基于此,本研究对嗜热假诺卡氏菌（Pseudonocardia thermophila JCM3095）来源的腈水合酶（PtNHase）进行分子改造,提升其催化性能。主要研究结果如下:（1）基于半理性设计提高PtNHase酶活。将位于PtNHase底物结合口袋的部分氨基酸残基进行突变,成功筛选到酶活显着提高的突变体M46K,其对于烟腈的比酶活为野生型腈水合酶的5.8倍;通过序列比对筛选到突变体F168Y,该突变体对于烟腈的比酶活为野生型腈水合酶的2.2倍;构建组合突变体M46K-F168Y,进一步将PtNHase对于烟腈的比酶活提高到574.0±17.5 U·mg-1,为野生型腈水合酶的7.5倍。（2）基于理性设计提高PtNHase的热稳定性。以Pt NHase为出发蛋白,通过在线热稳定性组合突变体设计工具Fireprot的辅助,成功获得热稳定性显着提高的组合突变体M10,其在62℃下的半衰期为150分钟,为野生型腈水合酶的7.6倍,酶活也由野生型腈水合酶的77.1±1.8 U·mg-1提高至168.8±5.3 U·mg-1。（3）基于上述获得的优势突变体,为进一步提高PtNHase的催化性能,构建组合突变体M46K-F168Y-M10。该突变体的热稳定性及酶活相对于野生型腈水合酶均有显着提高。组合突变体在62℃下的半衰期为100分钟,为野生型腈水合酶的5.1倍;比酶活为305.4±3.2 U·mg-1,为野生型腈水合酶的4.0倍;同时,突变体的产物耐受性较野生型腈水合酶提高15%。
张颖[4]（2019）在《含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化》文中提出含腈水合酶的细胞能够催化腈水合反应生产酰胺,具有重要的工业用途。但游离细胞在催化过程中容易失活,破裂的细胞影响产品的分离纯化。固定化细胞技术能有效的解决这些问题。但目前已报道的含腈水合酶固定化细胞稳定性普遍较低,或固定化过程中存在一定的毒性,对细胞伤害较大。为解决上述问题,本研究开展含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化研究,选择3-氰基吡啶水合生成烟酰胺作为模型反应,主要结果如下:（1）比较了海藻酸钙、聚丙烯酰胺、卡拉胶、琼脂和DA-F127水凝胶等固定化方法,考察固定化过程的酶活回收率和固定化细胞的批次反应情况。筛选得到两种效果较好的固定化方法,即海藻酸钙固定化法和DA-F127水凝胶固定化法。其中海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到48.08%,DA-F127水凝胶固定化细胞的酶活回收率达到61.28%。两种固定化细胞均可重复使用3个批次以上,酶活损失较小。（2）对海藻酸钙法进行固定化条件优化。确定固定化的最佳条件为:海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度为3%,细胞添加量为17.5mg/g载体,优化后海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到56.73%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃。研究了固定化细胞催化生产烟酰胺的反应工艺,确定了最优条件,最优条件下的海藻酸钙固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成6个批次的转化,与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 4.91倍。（3）对DA-F127水凝胶法进行固定化条件优化,确定固定化的最佳条件为:DA-F127浓度为15%,UV光照射距离为20 cm、光照时间6 min,菌体包埋量为20 mg/g载体,优化后的固定化细胞酶活回收率为89.74%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃对DA-F127固定化细胞催化生产烟酰胺进行初步研究,最优条件下的DA-F127固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成至少9个批次的转化。与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 12倍。
程中一[5]（2019）在《基于半理性设计的腈水合酶底物选择性及热稳定性的改造》文中认为腈水合酶（NHase,EC 4.2.1.84）是一种存在于原核和真核生物中的金属酶,能够催化腈类生成相应的酰胺类产物,而酰胺类产物作为重要的化工原料和有机合成中间体,在大宗化学品生产及医药领域有着广泛的应用。相较于传统的化学催化剂,腈水合酶转化腈类体现出一定的优势,反应条件温和且反应过程中无副产物产生。尽管如此,现阶段已报导的NHase大多底物谱较窄,选择性较差,难以定向高效地合成目标产物;此外,腈水合酶所催化的腈类水合反应为放热反应,而该酶热稳定性往往较差,以上这些因素限制了腈水合酶在更广范围内的应用。本文通过半理性设计,基于生物信息学与蛋白质工程,改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物以及外消旋腈类底物的区域选择性和对映选择性,并通过基因融合技术,提高了腈水合酶的热稳定性,主要研究结果如下:（1）基于序列比对,通过定点突变改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性。以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源的腈水合酶（PpNHase）和睾丸酮丛毛单胞菌Comomonas testosteroni来源的腈水合酶（CtNHase）为对象,研究两者对二氰基底物的催化特点。结果发现,PpNHase主要催化α,ω-二腈中的一个氰基,生成反应中间产物ω-氰基单酰胺,而CtNHase催化己二腈主要生成反应终产物α,ω-二酰胺,即二腈类底物的两个氰基都能被催化。通过比对PpNHase和CtNHase的一级氨基酸序列,发现两者的序列相似度达到95.6%。两者共有17个不同的氨基酸位点,分布于α和β两个亚基上。以Ct NHase为模板,将PpNHase中的上述17个氨基酸突变为CtNHase对应位点上的氨基酸残基,17个突变体中βL37F突变体催化二腈类底物的区域选择性发生了改变,随后对该位点进行了饱和突变,最终得到催化二腈类底物主要生成α,ω-二酰胺的三个突变体,βL37F、βL37W和βL37Y。另外,对CtNHase上β亚基37位的苯丙氨酸残基也进行了定点饱和突变,得到了主要生成ω-氰基单酰胺的两个突变体,βF37L和βF37P。基于Caver软件对底物通道的对比发现,底物通道的瓶颈越大,曲率越小,腈水合酶趋向于催化二腈中的两个氰基,生成二酰胺;而底物通道的瓶颈越小,曲率越大,腈水合酶趋向于只催化二腈中的一个氰基,生成ω-氰基单酰胺。（2）基于分子对接,通过定点突变改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性。构建来源于玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1中低分子量腈水合酶（L-NHase）的蛋白模型,通过分子对接将己二腈,丙二腈,邻苯二腈和对苯二腈与腈水合酶活性中心进行对接,判断构成底物结合口袋的氨基酸残基。对底物结合口袋氨基酸进行饱和突变,得到了βY68T和βW72Y两株单点突变体,他们对于二腈类底物的区域选择性发生了改变,由偏好生成二酰胺变为偏好生成ω-氰基单酰胺。进一步的迭代饱和突变得到只生成氰基单酰胺的双点组合突变体Y68T/W72Y。计算机辅助手段分析显示,Y68T/W72Y组合突变对于氰基单酰胺产物的结合能力变弱,结合自由能增加,导致单酰胺不能被进一步转化成二酰胺,区域选择性发生改变。（3）基于拉伸分子动力学模拟,通过定点突变改变了腈水合酶对于外消旋腈类底物的对映选择性。以L-NHase为研究对象,借助于蛋白建模及拉伸分子动力学模拟,准确定位了影响L-NHase对外消旋扁桃腈对映选择性的四个氨基酸残基,并对这四个氨基酸残基进行饱和突变。突变株对于（S）-扁桃腈的选择性明显提高,其中突变体βF37H表现出96.8%的对映体过剩率,远高于野生型的52.6%。拉伸分子动力学模拟分析发现,突变体增大了对（R）-扁桃腈的空间位阻,从而突变体βF37H偏向于选择（S）-扁桃腈。（4）基于蛋白质融合提高了腈水合酶的稳定性。以L-NHase为研究对象,将一种高热稳定的加帽蛋白TERM融合至L-NHase的C端,得到新的融合型腈水合酶。该融合型腈水合酶在50°C处理20分钟后依然保持80%以上的残余酶活,远高于野生型的40%。透射电子显微镜观测发现融合后的腈水合酶可形成直径约为25 nm的环状纳米结构,蛋白建模结果显示该环状结构可能为L-NHase的多亚基聚集体,多聚体的形成降低了酶分子的比表面积,有利于稳定性的提高。
夏媛媛[6]（2019）在《亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究》文中进行了进一步梳理腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）能够催化腈在常温中性条件下与水化合形成酰胺,是替代高温强酸催化工艺实现酰胺类大宗化学品绿色制造的关键酶种。常见NHase是含?和?亚基的金属酶,酶的成熟遵循亚基自身交换机制。但酶的热稳定性和有机溶剂耐受性较差,难以满足工业化生产对酶学性质的应用要求。因此,亟需发掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依据新发现的领鞭毛虫（Monosiga brevicollis）单肽链腈水合酶的蛋白结构特点,对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668）腈水合酶进行亚基融合重构,大幅提高腈水合酶的热稳定性和产物耐受性;又研究了来源于P.putida 5B和玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶亚基融合突变体的活化机理,揭示了调控蛋白对于融合型腈水合酶的激活机制。主要研究结果如下:（1）对P.putida 5B来源的腈水合酶PpNHase进行亚基融合重构,获得了活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis单链腈水合酶的蛋白结构特点,采用亚基融合策略对PpNHase进行改造,获得了两种活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。其中共表达调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BA）P14K的比酶活比PpNHase提高了54%,而融合了调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BAP14K）的比酶活较PpNHase提高了39%,两者在50°C的半衰期分别为PpNHase的2.8倍和2倍,对烟酰胺的产物耐受性也较PpNHase有一定的提高。（2）基于半理性改造,进一步提高腈水合酶的稳定性。以NHase-（BA）P14K为出发蛋白,通过结合点突变扫描程序和分子动力学模拟手段,建立了一个高效的小型突变库,并从中筛选出三个酶活和稳定性均提高的突变体B-M150C、B-T173Y和B-S189E,其催化效率较出发蛋白提高了1.1倍、1.5倍和2.2倍,在50°C的半衰期分别较出发蛋白提高了32%、7%及107%。（3）解析了融合型腈水合酶的成熟活化机理。通过优化表达策略,获得了来源于P.putida 5B和R.rhodochrous J1的腈水合酶调控蛋白P14K及NhlE。在此基础上对腈水合酶激活机制进行了探究。用单独的调控蛋白在体外与同源的不含钴的融合型腈水合酶进行混合后,获得了活化的成熟酶;此外,用调控蛋白激活不同来源的腈水合酶,也可以实现部分激活。本结果表明,调控蛋白起着类似金属伴随子的作用,协助输送钴离子到腈水合酶中;另外,调控蛋白不仅可以激活同源腈水合酶,也能激活异源腈水合酶,但对于自身来源的腈水合酶有着更高的激活效率。（4）成功表达M.brevicollis来源的单链腈水合酶Mb NHase。以大肠杆菌作为表达宿主对Mb NHase进行了可溶性表达,并测定了其比酶活为88.4 U·mg-1。根据调控蛋白可以激活异源腈水合酶的结论,构建了MbNHase与两种调控蛋白P14K、NhlE共表达的质粒,表达纯化后酶活测定发现,比酶活分别为220.2 U·mg-1和127.0 U·mg-1,是MbNHase的2.5和1.4倍。结果表明,两种细菌来源的调控蛋白可以协助真核来源的天然融合型腈水合酶提高活性。
刘胜先[7]（2020）在《Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的重组腈水合酶的催化性能研究》文中研究指明研究背景:酰胺类物质是重要的精细化工原料和医药中间体。腈水合酶是一种能够催化腈类化合物水合成酰胺类化合物的金属酶,具有很高的工业应用价值。与传统的化学合成法相比,采用腈水合酶生物催化法生产酰胺类化合物具有反应条件温和、专一性强、催化效率高的优势。但目前从自然界土壤取样分离筛选获得野生产酶菌株的方式具有偶然性大、成功率低、酶活力差等局限性,而通过基因克隆手段获得高效表达腈水合酶的基因工程菌具有生物遗传背景清晰、适应性强、发酵周期短、有利于实现大规模培养和工业化生产等优点,符合经济环保的绿色化工发展方向。研究目的:探究红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶的相关性能,以期为工业化生产酰胺类物质提供理论依据。研究方法:（1）设计质粒:通过基因工程技术实现腈水合酶在大肠杆菌中的异源表达;（2）探究腈水合酶的底物特异性:选用静息工程菌细胞与不同腈类底物（丙烯腈、丙二腈、烟腈、己二腈、对苯二腈、苯甲腈）反应,使用气液相色谱检测反应结果;（3）探究静息细胞反应影响因素:从温度稳定性、pH稳定性、最适温度、最适pH、底物耐受性等方面探究对酶活的影响;（4）完成腈水合酶的纯化:添加His标签完善质粒设计并利用亲和层析技术得到纯化酶。研究结果:（1）成功实现腈水合酶在大肠杆菌中的可溶性异源表达;（2）重组菌对单腈催化效果较弱,对二腈有较好的催化活性,并表现出了优异的区域选择性。可在10 min内完全催化20 mM/L己二腈,对5-氰基戊酰胺选择性为95%,酶活可达635 U/g（DCW）;（3）重组菌在催化己二腈反应时的最适温度为35℃、最适pH为7.4且在室温和pH中性条件下具有良好的稳定性,可耐受200 mM/L的己二腈,5 h内将其转化完全;（4）通过在α亚基后添加His标签序列,得到新质粒并完成纯化操作,纯化酶单亚基分子量为27 KDa,催化己二腈反应的比酶活为2917 U/g。结论:红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶在大肠杆菌中实现了功能稳定表达。该腈水合酶具有广泛的底物谱,对二腈的催化活性较为显着,可在常温中性条件下,短时高效地选择性催化己二腈生成5-氰基戊酰胺,同时具有较好的底物耐受性。本实验结果有望为5-氰基戊酰胺的工业生产提供新的思路和方案,为绿色化学的发展添砖加瓦。
李琪,张庆占,刘明辉[8]（2018）在《微生物法生产丙烯酰胺技术》文中认为丙烯酰胺是工业中常用的一项化学材料,丙烯酰胺生产时经常采用微生物法,满足丙烯酰胺的生产需求。微生物法在丙烯酰胺中得到了充分的应用,由此,主要探讨微生物法生产丙烯酰胺的相关技术。
宋阳[9]（2018）在《腈水合酶纳米生物催化剂的制备及性能研究》文中提出当前,酶催化作为一项绿色可持续的催化技术,已被广泛研究并应用于药品、精细化学品及食品等制备领域。利用腈水合酶催化制备酰胺类工业产品,具有选择性高、条件温和、环境污染小等优势,更符合经济和绿色化学的发展方向。然而,游离的腈水合酶在应用过程中具有稳定性差、易失活、难以回收利用等诸多局限性。通过固定化的方式,制成固定化腈水合酶纳米生物催化剂,不仅能够解决以上问题,还能实现工业化的连续生产,具有较大的研究意义。此外,由于金属离子在腈水合酶活性中心的重要作用,所以加入特定的金属离子能够影响腈水合酶的活性,比如Fe2+和Co2+会显着提高腈水合酶的酶活。基于此,本论文从钴离子（Co2+）对钴型腈水合酶（Co-type NHase）活性的促进作用为出发点,致力于制备出含有钴离子的新型纳米载体,同时引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂,来提高腈水合酶的活性和稳定性。该方面研究具有明显的创新性和重要的研究价值。本论文的研究工作有以下三个方面:（1）以钴盐和2-甲基咪唑为原料,制备分散均匀、大小均一的ZIF-67,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@ZIF-67。经优化NHase@ZIF-67的制备条件,确定腈水合酶为3 mg/mL、固定化时间为12 h,此时酶活为180.17 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为167.58 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为95.12%。NHase@ZIF-67的最适温度为40℃,最适pH为7.0。同时,与游离酶相比,NHase@ZIF-67表现出了良好的热稳定性和pH稳定性,拓宽了腈水合酶的应用范围,同时提高了腈水合酶的机械稳定性和储藏稳定性。在重复利用7次后,NHase@ZIF-67仍能保持初始酶活的33.19%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@ZIF-67用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量为12.51 U,反应时间为7 h时,烟酰胺的产率达91.35%。（2）以钴盐和PBS缓冲液为原料,制备分散均匀、大小均一的Co3（P04）2纳米花,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@Co3（PO4）2。Co3（PO4）2纳米花的平均孔径为5.88 nm,孔体积为0.0544 cm3/g;NHase@Co3（PO4）2的平均孔径为4.27 nm,孔体积为0.0356 cm3/g。经优化NHase@Co3（PO4）2的制备条件,确定固定化时间为48 h,此时酶活为238.47 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为214.60 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为96.11%。NHase@Co3（PO4）2的最适温度为40℃,最适pH为6.0。同时,与游离酶相比,NHase@Co3（PO4）2表现出了良好的热稳定性、pH稳定性及抗蛋白酶分解稳定性,拓宽了腈水合酶的应用范围;在重复利用7次后,NHase@Co3（P04）2仍能保持初始酶活的58.92%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@Co3（P04）2用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量14.65 U,反应时间为7 h时,烟酰胺产率达90.96%。（3）以钴盐和胱氨酸为原料,制备粒径分散均匀的BioMOF纳米粒子,即Co-Cys纳米花,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@Co-Cys。经优化NHase@Co-Cys的制备条件,确定腈水合酶为3 mg/mL、固定化时间为3h,此时酶活为139.04 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为95.85 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为92.71%。NHase@Co-Cys的最适温度为40℃,最适pH为6.0。同时,与游离酶相比,NHase@Co-Cys表现出了良好的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性等,对蛋白酶的分解也具有较好的耐受性,拓宽了腈水合酶的应用范围;在重复利用7次后,NHase@Co-Cys仍能保持初始酶活的62.48%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@Co-Cys用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量12.76 U,反应时间为7 h时,烟酰胺产率达86.36%。
庄贤军[10]（2017）在《生物转化法生产丙烯酰胺的研究进展》文中研究指明丙烯酰胺是一种精细化的化工产品,是生产聚丙烯酰胺的单体。聚丙烯酰胺的用途非常广泛,在水处理、采油、造纸、纺织等多个行业都有应用,号称"百业助剂"。生物转化法与化学法相比有许多优点,为了更好地推动丙烯酰胺的工业化生产,本文详细分析生物转化法生产丙烯酰胺的研究进展。
二、腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展（论文提纲范文）
（1）一种Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶的纯化包覆及催化性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 腈及酰胺类化合物概述 |
| 1.1.1 腈类化合物的性质及应用 |
| 1.1.2 腈类物质的催化途径 |
| 1.1.3 酰胺类化合物的性质及应用 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源和分布 |
| 1.2.2 腈水合酶的结构及其特征 |
| 1.2.3 腈水合酶的活性中心与催化机理 |
| 1.2.4 腈水合酶的工业应用 |
| 1.3 重组腈水合酶及分离纯化 |
| 1.3.1 重组腈水合酶 |
| 1.3.2 腈水合酶的分离纯化 |
| 1.4 组氨酸标签蛋白的纯化 |
| 1.4.1 组氨酸标签蛋白的纯化简介 |
| 1.4.2 组氨酸标签蛋白纯化总览 |
| 1.5 酶的包覆概述 |
| 1.5.1 金属有机框架(metal-organic frameworks,MOFs)概述 |
| 1.5.2 金属有机框架对酶的包封 |
| 1.6 论文的研究思路及主要内容 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验菌株和载体 |
| 2.3 培养基和试剂配制 |
| 2.4 蛋白质纯化 |
| 2.5 Bradford法蛋白浓度测定 |
| 2.6 酶活测定 |
| 2.7 表征方法 |
| 2.7.1 扫描电子显微镜(SEM) |
| 2.7.2 X射线衍射(XRD) |
| 2.7.3 热重分析(TGA) |
| 2.7.4 傅里叶红外光谱(FT-IR) |
| 2.7.5 氮气物理吸脱附分析(BET) |
| 3 腈水合酶的纯化及催化性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 质粒设计 |
| 3.2.2 质粒的转化和表达 |
| 3.2.3 腈水合酶的纯化 |
| 3.2.4 腈水合酶的底物探究 |
| 3.2.5 催化己二腈反应 |
| 3.2.6 产物液相标曲 |
| 3.2.7 纯化腈水合酶反应过程 |
| 3.2.8 酶促反应动力学 |
| 3.2.9 催化反应最适温度 |
| 3.2.10 催化反应最适PH |
| 3.3 小结 |
| 4 腈水合酶的包覆及催化性能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 ZIF-67 的合成及表征 |
| 4.3 ZIF-67 表征 |
| 4.3.1 扫描电子显微镜(SEM) |
| 4.3.2 X射线衍射(XRD) |
| 4.3.3 热重分析(TGA) |
| 4.3.4 傅里叶红外光谱(FT-IR) |
| 4.3.5 氮气物理吸脱附分析(BET) |
| 4.4 ReNHase@ZIF-67 的合成及催化 |
| 4.4.1 ReNHase@ZIF-67 的合成 |
| 4.4.2 ReNHase@ZIF-67 催化己二腈 |
| 4.5 ReNHase@ZIF-67 表征 |
| 4.5.1 ReNHase@ZIF-67 催化己二腈 |
| 4.5.2 ReNHase@ZIF-67 扫描电子显微镜(SEM)分析 |
| 4.6 小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A ReNHase-His基因序列 |
| 附录 B 其中包含的α亚基DNA序列 |
| 附录 C 其中包含的β亚基DNA序列 |
| 附录 D 所对应的α亚基氨基酸序列 |
| 附录 E 所对应的β亚基氨基酸序列 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）泛生菌来源腈水合酶的大肠杆菌异源表达策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类与酰胺类化合物 |
| 1.1.1 腈类化合物的分类与生物转化 |
| 1.1.2 酰胺化合物及其生物合成 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶简介 |
| 1.2.2 腈水合酶的结构 |
| 1.2.3 腈水合酶的催化机理 |
| 1.3 腈水合酶的挖掘及异源表达 |
| 1.3.1 腈水合酶的挖掘 |
| 1.3.2 腈水合酶的异源表达 |
| 1.4 本课题的研究背景与意义 |
| 1.5 本课题的研究思路和内容 |
| 第二章 腈水合酶的基因挖掘及异源表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂与工具酶 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 菌种与质粒 |
| 2.2.4 溶液与培养基 |
| 2.2.5 腈水合酶的基因挖掘 |
| 2.2.6 目标基因扩增引物的设计 |
| 2.2.7 转化及菌落PCR |
| 2.2.8 重组腈水合酶的诱导表达 |
| 2.2.9 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.10 细胞干重的测定 |
| 2.2.11 酶活检测 |
| 2.2.12 重组腈水合酶催化合成丙烯酰胺 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组腈水合酶基因的克隆 |
| 2.3.2 腈水合酶的基因挖掘及序列分析 |
| 2.3.3 重组腈水合酶的表达 |
| 2.3.4 重组腈水合酶的酶活比较 |
| 2.3.5 重组腈水合酶催化合成丙烯酰胺 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组腈水合酶的异源表达优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂与工具酶 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 菌种和质粒 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 3.2.5 全质粒PCR |
| 3.2.6 β亚基翻译起始区mRNA二级结构模拟 |
| 3.2.7 β 亚基翻译起始区SD-ATG序列优化子的构建 |
| 3.2.8 β亚基翻译起始区多重SD序列增强子的构建 |
| 3.2.9 融合标签蛋白的构建 |
| 3.2.10 重组腈水合酶的诱导表达 |
| 3.2.11 菌体收集和细胞破碎 |
| 3.2.12 SDS-PAGE蛋白相对表达量分析 |
| 3.2.13 酶活检测 |
| 3.2.14 重组腈水合酶的纯化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 β亚基翻译起始区结构的优化 |
| 3.3.2 β亚基翻译起始区多重SD序列设计 |
| 3.3.3 含标签蛋白表达载体的构建与转化 |
| 3.3.4 融合标签蛋白对腈水合酶表达量的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 重组腈水合酶的酶学性质表征及催化工艺 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种与质粒 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器与设备 |
| 4.2.4 重组腈水合酶诱导条件优化 |
| 4.2.5 重组腈水合酶最适反应条件的优化 |
| 4.2.6 重组腈水合酶的酶学性质 |
| 4.2.7 细胞量对转化过程的影响 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组腈水合酶菌体生长诱导条件优化 |
| 4.3.2 重组腈水合酶的最适反应条件 |
| 4.3.3 重组腈水合酶的酶学性质 |
| 4.3.4 细胞量对转化过程的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文数据集 |
（3）基于半理性设计和理性设计的腈水合酶酶活及其热稳定性的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈水合酶的概述 |
| 1.1.1 腈类化合物 |
| 1.1.2 腈水合酶 |
| 1.1.3 腈水合酶的基因结构 |
| 1.1.4 腈水合酶的活性中心 |
| 1.1.5 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2 腈水合酶的工业应用 |
| 1.3 腈水合酶的改造 |
| 1.3.1 腈水合酶的异源表达 |
| 1.3.2 蛋白质的热稳定性 |
| 1.3.3 蛋白质的酶活 |
| 1.3.4 腈水合酶的底物耐受性和产物耐受性 |
| 1.4 蛋白质的改造策略 |
| 1.5 热稳定性组合突变体的设计 |
| 1.6 同源建模 |
| 1.7 分子对接 |
| 1.8 本课题立题意义及主要研究内容 |
| 1.8.1 本课题立题意义 |
| 1.8.2 本课题主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 培养基种类 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.2 腈水合酶突变库构建 |
| 2.2.1 质粒的提取 |
| 2.2.2 腈水合酶突变点引物设计 |
| 2.2.3 全质粒PCR |
| 2.2.4 全质粒PCR产物的纯化 |
| 2.2.5 E.Coli感受态的制备 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的转化 |
| 2.3 腈水合酶的表达纯化 |
| 2.3.1 诱导表达 |
| 2.3.2 纯化 |
| 2.3.3 腈水合酶蛋白浓度的测定 |
| 2.4 腈水合酶的酶学性质分析 |
| 2.4.1 腈水合酶酶活的测定 |
| 2.4.2 腈水合酶热稳定性的测定 |
| 2.4.3 腈水合酶底物耐受性和产物耐受性测定 |
| 2.4.4 腈水合酶动力学常数的测定 |
| 2.5 腈水合酶的分子动力学模拟 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 半理性设计提高腈水合酶的酶活 |
| 3.1.1 腈水合酶底物结合口袋氨基酸残基的改造 |
| 3.1.2 序列比对筛选高酶活突变体 |
| 3.1.3 组合突变的设计及突变体的纯化和动力学常数的测定 |
| 3.2 理性设计提高腈水合酶的热稳定性 |
| 3.2.1 腈水合酶热稳定性突变体的设计 |
| 3.2.2 Pt NHase组合突变体的预测 |
| 3.2.3 组合突变体的热稳定性表征 |
| 3.2.4 组合突变体耐受性测定 |
| 3.2.5 动力学常数的测定 |
| 3.2.6 野生型腈水合酶及其组合突变体M10 的二级结构分析 |
| 3.2.7 突变体的分子动力学模拟 |
| 3.3 腈水合酶的催化性能的叠加提高 |
| 3.3.1 组合突变体的构建 |
| 3.3.2 组合突变体酶学性质的表征 |
| 3.3.3 组合突变体耐受性的测定 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 烟酰胺 |
| 1.1.1 烟酰胺简介 |
| 1.1.2 烟酰胺的合成方法 |
| 1.1.3 国内外烟酰胺的生产消费概况 |
| 1.2 腈水合酶简介 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源和结构 |
| 1.2.2 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.3 腈水合酶的性质 |
| 1.2.4 腈水合酶的应用 |
| 1.3 腈水合酶固定化技术概况 |
| 1.3.1 腈水合酶固定化方法 |
| 1.3.2 含腈水合酶细胞固定化方法 |
| 1.3.3 其他用于固定化细胞的材料 |
| 1.4 研究思路和研究内容 |
| 第二章 固定化方法的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设备与材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品准备 |
| 2.3.2 酶活的相关数据测定 |
| 2.3.3 固定化腈水合酶材料筛选 |
| 2.3.4 固定化细胞包埋材料筛选 |
| 2.3.5 固定化材料的重复批次实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 腈水合酶的固定化 |
| 2.4.2 含腈水合酶细胞的固定化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 海藻酸钙包埋法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设备与材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 反应体系缓冲液的配制 |
| 3.3.2 海藻酸钙包埋法固定化条件优化 |
| 3.3.3 海藻酸钙固定化细胞催化特性 |
| 3.3.4 海藻酸钙固定化细胞的重复批次实验 |
| 3.3.5 催化反应在去离子水与缓冲液体系中的比较 |
| 3.3.6 最适底物浓度 |
| 3.3.7 底物分批补料 |
| 3.3.8 酶活添加量 |
| 3.3.9 海藻酸钙固定化细胞批次反应催化烟酰胺 |
| 3.3.10 海藻酸钙固定化细胞的储存稳定性 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 海藻酸钙包埋固定化条件优化 |
| 3.4.2 海藻酸钙固定化细胞催化特性 |
| 3.4.3 海藻酸钙固定化细胞催化合成烟酰胺工艺 |
| 3.4.4 海藻酸钙固定化细胞的稳定性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 DA-F127水凝胶包埋法 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设备与材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 反应体系缓冲液的配制 |
| 4.3.2 DA-F127包埋条件的优化 |
| 4.3.3 DA-F127固定化细胞催化特性 |
| 4.3.4 固定化细胞的重复批次实验 |
| 4.3.5 催化反应在去离子水与缓冲液体系中的比较 |
| 4.3.6 DA-F127固定化细胞批次反应催化烟酰胺 |
| 4.3.7 DA-F127固定化细胞的储存稳定性 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DA-F127水凝胶包埋条件优化 |
| 4.4.2 DA-F127固定化细胞催化特性 |
| 4.4.3 DA-F127固定化细胞批次反应催化烟酰胺 |
| 4.4.4 DA-F127固定化细胞的储存稳定性 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）基于半理性设计的腈水合酶底物选择性及热稳定性的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类与酰胺类化合物 |
| 1.1.1 腈类化合物的自然分布与降解 |
| 1.1.2 酰胺类化合物的工业生产 |
| 1.1.3 酰胺类化合物的绿色合成 |
| 1.2 腈水合酶概述 |
| 1.2.1 腈水合酶的分布 |
| 1.2.2 腈水合酶的种类及基因型 |
| 1.3 腈水合酶的翻译后修饰 |
| 1.3.1 腈水合酶的调控蛋白 |
| 1.3.2 亚基交换伴随子 |
| 1.3.3 金属伴随子 |
| 1.4 腈水合酶的催化机理 |
| 1.5 腈水合酶的理化性质 |
| 1.5.1 腈水合酶的区域选择性 |
| 1.5.2 腈水合酶的对映选择性 |
| 1.5.3 腈水合酶的热稳定性 |
| 1.6 酶的半理性改造方法 |
| 1.6.1 蛋白质的同源建模 |
| 1.6.2 小分子与蛋白质的对接 |
| 1.6.3 分子动力学模拟及拉伸分子动力学 |
| 1.7 本论文主要研究内容 |
| 1.7.1 立题依据及研究意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 基于序列比对改造腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验用菌株及载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基及菌体生长诱导条件 |
| 2.2.5 突变体构建 |
| 2.2.6 腈水合酶的纯化 |
| 2.2.7 腈水合酶酶浓度测定 |
| 2.2.8 腈水合酶区域选择性测定方法 |
| 2.2.9 液质联用测定3-氰基丙酰胺 |
| 2.2.10 圆二色谱测定方法 |
| 2.2.11 计算机半理性设计方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同来源的野生型腈水合酶催化脂肪族及芳香族二腈的区域选择性 |
| 2.3.2 不同来源的腈水合酶序列比对及小型突变库的构建 |
| 2.3.3 腈水合酶突变体对于二腈类底物的区域选择性 |
| 2.3.4 腈水合酶区域选择性差异的机制探究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于分子对接改造腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验用菌株及载体 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基及菌体生长诱导条件 |
| 3.2.5 突变体构建 |
| 3.2.6 腈水合酶的纯化 |
| 3.2.7 腈水合酶酶浓度测定 |
| 3.2.8 腈水合酶区域选择性测定方法 |
| 3.2.9 计算机半理性设计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 腈水合酶底物结合口袋氨基酸的确定 |
| 3.3.2 腈水合酶突变库的构建与正向突变的筛选 |
| 3.3.3 腈水合酶突变体的动力学常数测定 |
| 3.3.4 野生型腈水合酶及其突变体的区域选择性机制探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于拉伸分子动力学模拟改造腈水合酶对于外消旋腈类底物的对映选择性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验用菌株及载体 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 培养基及菌体生长诱导条件 |
| 4.2.5 突变体构建 |
| 4.2.6 腈水合酶的纯化 |
| 4.2.7 腈水合酶酶浓度测定 |
| 4.2.8 腈水合酶对映选择性测定方法 |
| 4.2.9 圆二色谱测定方法 |
| 4.2.10 计算机半理性设计方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 腈水合酶与外消旋扁桃腈的分子对接 |
| 4.3.2 拉伸分子动力学模拟精确选取突变位点 |
| 4.3.3 定点饱和突变及正向突变体的筛选 |
| 4.3.4 野生型L-NHase及其βF37H突变体的酶促反应动力学常数 |
| 4.3.5 野生型L-NHase及其βF37H突变体的结构分析 |
| 4.3.6 野生型L-NHase及其βF37H突变体的门闩效应 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于蛋白质融合提高腈水合酶热稳定性 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验用菌株及载体 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 培养基及菌体生长诱导条件 |
| 5.2.5 突变体构建 |
| 5.2.6 腈水合酶的纯化 |
| 5.2.7 腈水合酶酶浓度测定 |
| 5.2.8 腈水合酶酶活测定 |
| 5.2.9 透射电子显微镜样品制备方法 |
| 5.2.10 计算机半理性设计方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 加帽蛋白TERM的结构模拟 |
| 5.3.2 加帽蛋白TERM引导腈水合酶多聚化 |
| 5.3.3 多聚化腈水合酶的热稳定性及酶活测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类化合物 |
| 1.1.1 腈类化合物的作用 |
| 1.1.2 腈类的微生物转化 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶 |
| 1.2.2 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.3 腈水合酶的来源及基因结构 |
| 1.3 翻译后修饰 |
| 1.3.1 亚基自身交换 |
| 1.3.2 金属伴随子 |
| 1.4 腈水合酶的工业应用 |
| 1.5 腈水合酶的改造 |
| 1.5.1 腈水合酶生产存在的问题 |
| 1.5.2 大肠杆菌的异源表达 |
| 1.5.3 腈水合酶稳定性改造策略 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 第二章 亚基融合型腈水合酶的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 |
| 2.2.5 基因操作 |
| 2.2.6 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 钴含量测定 |
| 2.2.9 最适pH测定 |
| 2.2.10 热稳定性测定 |
| 2.2.11 产物耐受性测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 融合型腈水合酶的构建及表达 |
| 2.3.2 融合型腈水合酶的表征 |
| 2.3.3 调控蛋白融合位置的影响 |
| 2.3.4 融合型腈水合酶的理化性质测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 融合型腈水合酶的热稳定性改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株质粒 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 |
| 3.2.4 基因操作 |
| 3.2.5 蛋白表达及纯化 |
| 3.2.6 酶活及动力学参数测定 |
| 3.2.7 动力学及热力学稳定性测定 |
| 3.2.8 同源建模 |
| 3.2.9 计算模拟 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模 |
| 3.3.2 融合型腈水合酶突变体库的构建 |
| 3.3.3 突变体的筛选 |
| 3.3.4 正向突变体的酶学表征 |
| 3.3.5 正向突变体的结构分析 |
| 3.3.6 正向突变体分子间相互作用探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与载体 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 蛋白表达与纯化 |
| 4.2.4 腈水合酶的体外激活 |
| 4.2.5 紫外-可见光扫描 |
| 4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化状态测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 融合型腈水合酶的体外激活 |
| 4.3.2 腈水合酶的紫外—可见光光谱扫描 |
| 4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻译后修饰分析 |
| 4.3.4 融合型腈水合酶成熟机理 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 调控蛋白的金属伴随子功能探究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与载体 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 质粒构建 |
| 5.2.4 蛋白表达与纯化 |
| 5.2.5 酶活与动力学参数测定 |
| 5.2.6 钴离子的光谱扫描及含量测定 |
| 5.2.7 钴离子与调控蛋白的结合 |
| 5.2.8 测定调控蛋白与腈水合酶的结合 |
| 5.2.9 从头建模及分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 调控蛋白对融合型腈水合酶活性的影响 |
| 5.3.2 单独调控蛋白的获取 |
| 5.3.3 单独调控蛋白的表征 |
| 5.3.4 单独调控蛋白对融合型腈水合酶的体外激活 |
| 5.3.5 异源调控蛋白对融合型腈水合酶的体内激活 |
| 5.3.6 钴离子与调控蛋白体外结合的分析 |
| 5.3.7 调控蛋白与脱辅基酶的结合分析 |
| 5.3.8 调控蛋白模型的建立及动力学分析 |
| 5.3.9 调控蛋白钴离子结合位点的分析 |
| 5.3.10 金属伴随子激活模型 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 天然融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与载体 |
| 6.2.2 培养条件 |
| 6.2.3 基因合成及密码子优化 |
| 6.2.4 包涵体的检测 |
| 6.2.5 蛋白表达与纯化 |
| 6.2.6 酶活及热稳定性测定 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的异源表达 |
| 6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表达优化 |
| 6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及热稳定性 |
| 6.3.4 异源调控蛋白对M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 ：作者在攻读博士期间发表的论文 |
（7）Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的重组腈水合酶的催化性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 生物催化 |
| 1.1.1 生物催化概述 |
| 1.1.2 生物催化研究历程 |
| 1.1.3 腈类化合物的生物催化过程 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源和分布 |
| 1.2.2 腈水合酶的结构和特点 |
| 1.2.3 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.4 腈水合酶的应用 |
| 1.3 重组腈水合酶 |
| 1.4 本论文的课题意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验菌株和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 质粒表达验证 |
| 2.2.3 酶的纯化 |
| 2.2.4 酶活测定 |
| 2.2.5 催化性能探究 |
| 2.2.6 相关溶液配制 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 ReNHase质粒的构建与表达 |
| 3.2 腈水合酶的底物特异性 |
| 3.2.1 腈水合酶的底物 |
| 3.2.2 催化己二腈反应 |
| 3.3 重组Re NHase静息细胞催化性能探究 |
| 3.3.1 温度 |
| 3.3.2 pH |
| 3.3.3 底物浓度 |
| 3.4 腈水合酶ReNHase-His的纯化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A ReNHase基因序列 |
| 附录 B ReNHase质粒测序比对 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）微生物法生产丙烯酰胺技术（论文提纲范文）
| 1 生产特点 |
| 2 生产技术 |
| 3 技术发展 |
| 4 结束语 |
（9）腈水合酶纳米生物催化剂的制备及性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 固定化酶 |
| 1.1.1 固定化酶定义 |
| 1.1.2 固定化酶载体 |
| 1.1.3 固定化酶方法 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.3 新型钴型纳米材料的应用 |
| 1.3.1 沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-67 |
| 1.3.2 蛋白-磷酸盐杂化纳米花 |
| 1.3.3 新型纳米生物材料BioMOF |
| 1.4 本论文的选题思路及主要工作 |
| 第二章 腈水合酶-ZIF-67纳米生物催化剂的制备及性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 相关标准曲线的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 载体及固定化酶的表征 |
| 2.3.2 固定化条件的筛选 |
| 2.3.3 固定化酶的酶学性能及稳定性研究 |
| 2.3.4 腈水合酶催化制备烟酰胺 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 腈水合酶-磷酸钴纳米生物催化剂的制备及性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 载体及固定化酶的表征 |
| 3.3.2 固定化条件的筛选 |
| 3.3.3 固定化酶的酶学性能及稳定性研究 |
| 3.3.4 腈水合酶催化制备烟酰胺 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 腈水合酶-BioMOF纳米生物催化剂的制备及性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 载体及固定化酶的表征 |
| 4.3.2 固定化条件的筛选 |
| 4.3.3 固定化酶的酶学性能及稳定性研究 |
| 4.3.4 腈水合酶催化制备烟酰胺 |
| 4.3.5 腈水合酶纳米生物催化剂的催化性能对比 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与主要创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间所取得的相关科研成果 |
| 致谢 |
（10）生物转化法生产丙烯酰胺的研究进展（论文提纲范文）
| 1 丙烯酰胺国内外研究现状 |
| 2 生物转化法在丙烯酰胺生产中的应用现状 |
| 2.1 生产特点 |
| 2.2 腈水合酶的研究进展 |
| 3 生物法生产丙烯酰胺的未来研究方向 |
| 4 结语 |
四、腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展（论文参考文献）
- [1]一种Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶的纯化包覆及催化性能研究[D]. 杜文静. 大连理工大学, 2021(01)
- [2]泛生菌来源腈水合酶的大肠杆菌异源表达策略研究[D]. 张兆宇. 浙江工业大学, 2020(02)
- [3]基于半理性设计和理性设计的腈水合酶酶活及其热稳定性的改造[D]. 蓝瑶. 江南大学, 2019(05)
- [4]含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化[D]. 张颖. 浙江大学, 2019(03)
- [5]基于半理性设计的腈水合酶底物选择性及热稳定性的改造[D]. 程中一. 江南大学, 2019(01)
- [6]亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究[D]. 夏媛媛. 江南大学, 2019(12)
- [7]Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的重组腈水合酶的催化性能研究[D]. 刘胜先. 大连理工大学, 2020(02)
- [8]微生物法生产丙烯酰胺技术[J]. 李琪,张庆占,刘明辉. 化工设计通讯, 2018(09)
- [9]腈水合酶纳米生物催化剂的制备及性能研究[D]. 宋阳. 河北工业大学, 2018(07)
- [10]生物转化法生产丙烯酰胺的研究进展[J]. 庄贤军. 生物化工, 2017(03)