一、HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文文献综述）
赵富熙[1]（2021）在《禽呼肠孤病毒非结构蛋白p17的宿主互作蛋白筛选及PRPS2功能的初步研究》文中提出禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）在鸡群中普遍存在,与病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病相关,并能导致免疫抑制,给养禽业造成严重的经济损失。p17是ARV编码的一种非结构蛋白,可诱导细胞自噬进而促进病毒增殖,与病毒的致病作用关系密切。本研究拟筛选与p17互作的宿主蛋白,探讨其与病毒复制的关系,为深入阐明ARV感染的致病机制奠定基础。1.与ARV p17互作的宿主蛋白筛选以ARV GX/2010/1株感染7日龄SPF鸡,每只鸡的感染量为104.3TCID50。7天后提取鸡肝组织总RNA,应用SmartTM技术构建ARV感染鸡肝组织cDNA文库,文库滴度为2.6×107cfu/mL。构建表达p17的重组诱饵质粒pGBKT7-p17,将其转化至酵母感受态细胞Y2H Gold中,检测显示该质粒无自激活活性并对酵母菌无毒性。利用酵母双杂交系统筛选,并经酵母回补验证,共得到9个与p17互作的宿主蛋白。经测序并与NCBI数据库比对,9个宿主蛋白分别为核糖磷酸焦磷酸激酶2（PRPS2）、γ-干扰素诱导蛋白16（IFI16）、聚谷氨酰胺结合蛋白1（PQBP1）、核仁GTP结合蛋白1（GTPBP4）、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）、羧酸酯水解酶（CES1L2）、成纤维细胞生长因子1（FGF1）、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸合酶（PAPSS2）和钙黏蛋白-2（CDH2）。通过gene ontology（GO）通路注释分析,这9个与p17互作的宿主蛋白参与细胞代谢过程及具有催化活性。其中,PRPS2参与嘌呤代谢和蛋白质的合成,并与抑制细胞增殖、阻滞细胞周期和引发细胞凋亡等密切相关。2.PRPS2与p17互作的鉴定及其对ARV复制的影响本研究进一步验证PRPS2与p17的相互作用并探究PRPS2对病毒复制的影响。分别构建重组质粒pcDNA-Myc-p17和pcDNA-Flag-PRPS2,共转染DF-1细胞,经间接免疫荧光试验,于激光共聚焦显微镜观察发现p17与PRPS2在细胞内具有共定位现象;通过免疫共沉淀检测,PRPS2与p17在细胞内具有相互作用;构建pEGX-6p-1-p17原核表达载体,通过GST pull-down证明p17与PRPS2在细胞外也能够相互结合。ARV感染DF-1细胞,经q-PCR检测在不同时间点PRPS2的mRNA表达水平,发现PRPS2在ARV感染早期表达水平显着上调,推测PRPS2可能参与病毒的增殖过程。将质粒pcDNA-Flag-PRPS2和空白载体pcDNA3.1分别转染DF-1细胞,再感染ARV病毒,分别在感染后不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-PCR检测发现,过表达PRPS2细胞在ARV感染24 h时病毒复制水平达到峰值,比空载体组感染病毒细胞提高了约30%。同样,我们观察到在过表达PRPS2的情况下,ARV p17蛋白的表达量也显着增加。结果表明,过表达PRPS2能显着促进ARV复制。利用si RNA技术敲低PRPS2表达,q-PCR检测显示si-PRPS-1和si-PRPS-2均能显着下调PRPS2的mRNA转录水平。在DF-1细胞中分别转染si-PRPS2-1、si-PRPS-2和Nc-si RNA,再感染ARV,分别在不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-PCR检测发现,在ARV感染6 h、12 h和24 h三个时间点,敲低PRPS2表达可使得ARV复制水平显着下降,并且敲低PRPS2可导致p17蛋白水平明显降低。结果表明,敲低PRPS2可显着抑制ARV的复制。综上所述,本研究首次发现并证实宿主PRPS2蛋白与ARV p17非结构蛋白之间存在相互作用,并且PRPS2对ARV的增殖具有正向调控作用。
周波[2]（2021）在《急性B淋巴细胞白血病circRNA表达分析及XLOC＿011567与增殖、凋亡相关性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积,并浸润其他非造血组织和器官,同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。白血病根据患者不同病型采取不同治疗手段,目前,部分类型白血病已经可以治愈,但急性B淋巴细胞白血病病情重,死亡率高,尚没有有效治疗方法,因此,新的治疗手段及新型药物仍有待研发。环状RNA（CircularRNA,circRNA）是一种呈封闭环状结构的非编码RNA分子,由pre-mRNA通过可变剪切加工产生,不具有传统线性RNA的5’和3’末端。其在人体细胞中广泛表达,具有稳定性、保守性。随着对其研究的不断深入,发现circRNA具有多种功能:1、能够与特异的一个或一组miRNAs结合,从而抑制miRNAs的功能,实现对基因的表达调控;2、能调节pre-mRNA的线性剪接,circRNA和mRNA均来自同一个pre-mRNA剪接,意味着circRNA的产生可能影响余下序列的剪接过程;3、circRNA可调控基因的转录和翻译,有研究发现,某些从线性基因中保留了一部分外显子序列的circRNA,可以通过作用于剪接复合物中的U1组分,将RNA聚合酶Ⅱ招募至线性基因的启动子区域,从而增强该基因的表达。还有研究发现,circRNA在剪接环化的过程中,包含了原基因的起始密码子,则可能导致与circRNA同源的mRNA逃避转录,从而在翻译水平调控基因表达;4、circRNA能与蛋白质的相互作用,通过与RNA结合蛋白质（RNA-binding protein,RBP）结合,调控其靶向RNA分子的功能。此外,du等人发现circRNA可以与激酶抑制蛋白（p21）及细胞分裂蛋白激酶（CDK2）形成复合体,从而抑制了CDK2对细胞分裂的促进作用,阻碍细胞周期进展。5、circRNA具有翻译功能,最近的体外研究显示,circRNA具有编码蛋白质的潜力,比如,果蝇体内核糖体免疫印迹实验清楚地表明,circRNA与翻译多核糖体有关联。由于circRNA具有这些特性,使得circRNA越来越受关注,并成为新型药物潜在的研发方向。目前,circRNA在胃癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤中都开展了广泛的研究,并且在血液病中也扮演着重要角色,有报道称在AML中:PML通过AKT通路促进细胞增殖;circFOXO3影响细胞凋亡;circNPM1能够影响分化,促进白血病发生;circKLHL与病人预后密切相关;circVIM可作为肿瘤生物标志物等。在ALL中:circAF4能够促进白血病发生发展;circPAX5能够促进B细胞成熟。在CLL中:circRPL15可作为生物标志物等,但在急性B淋巴细胞白血病中研究尚少。因此,在急性B淋巴细胞白血病中,筛选表达差异的circRNA并探索其表达机制,对急性B淋巴细胞白血病的治疗具有重要意义。研究目的:建立人类正常B淋巴母细胞系HMy2.CIR及人类急性B淋巴细胞白血病细胞系Ball-1的circRNA表达谱,筛选表达差异的circRNA;分析差异表达circRNA的潜在分子机制。研究方法:1、提取人类B淋巴母细胞细胞系（HMy2.CIR）及人类急性B淋巴细胞白血病细胞系（Ball-1）的总RNA;富集环状RNA并进行预处理后,构建测序文库;将文库变性为单链DNA分子,在Illumina flowcell上捕获,原位扩增为簇（cluster）,通过高通量测序技术得到两种细胞系中circRNA表达谱。2、生物信息学分析HMy2.CIR及Ball-1细胞系中circRNA表达谱。将HMy2.CIR作为正常对照,选取在Ball-1中低表达的且差异显着的7种circRNA进行下一步研究。3、用qRT-PCR方法对HMy2.CIR及Ball-1细胞系及在急性B淋巴细胞白血病患者和非急性B淋巴细胞白血病患者骨髓中上述7种circRNA的表达水平进行检测,最后选择差异最显着的circRNA（XLOC＿011567）进行下一步研究。4、生物信息学方法预测XLOC＿011567的靶基因,分析XLOC＿011567可能参与的信号通路,并分析预测XLOC＿011567的ceRNA调控网络。5、利用质粒在Ball-1细胞中过表达XLOC＿011567,用CCK8法检测细胞增殖情况,用Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,Western-blot方法检测XLOC＿011567可能参与的信号通路中关键蛋白的表达情况。6、在293T细胞中,构建荧光素酶报告基因系统,检测XLOC＿011567与miR＿6760＿5p是否相互作用,同时检测miR＿6760＿5p与TP53I11是否相互作用。7、在Ball-1中,过表达XLOC＿011567,检测TP53I11表达情况;过表达miR＿6760＿5p,检测TP53I11表达情况;同时过表达XLOC＿011567及miR＿6760＿5p,检测TP53I11表达情况。实验结果:1、测序得到人类正常B淋巴母细胞系（HMy2.CIR）及人类急性B淋巴细胞白血病细胞系（Ball-1）的circRNA表达谱。HMy2.CIR中检测到circRNA14720种,Ball-1中检测到circRNA 7516种。将两种细胞系的circRNA进行对比分析,结果显示与HMy2.CIR相比,在Ball-1中有2387种circRNA高表达或表达（其中,未见文献报道的circRNA 1318个）,有12561种circRNA低表达或者不表达（其中,未见文献报道的circRNA 6613个）。2、与HMy2.CIR相比,circ＿SPECC1、LOC105370956（XLOC＿011567）、circ＿ARHGAP10、circ＿RIMBP2在Ball-1细胞系中低表达。与非急性B淋巴细胞白血病患者骨髓相比,XLOC＿011567在急性B淋巴细胞白血病患者骨髓中低表达且差异显着。3、Mi Randa及PITA软件共同预测XLOC＿011567可能结合的miRNA,取交集共有可能结合的miRNA50个。Mi Randa、targetscan、PITA软件预测上述50个miRNA作用的靶基因,取交集共有可能作用的靶基因133118个。4、过表达XLOC＿011567的Ball-1细胞中,细胞增殖率降低,早期凋亡率增加。同时,细胞中P-P38、P-ERK1/2、P-C-Raf、P-Gsk-3β蛋白表达升高;ERK1/2、P-AKT（Ser473）、P-AKT（Thr308）蛋白表达降低;JNK、P38、AKT、P-PTEN、P-PDK1蛋白无明显改变。5、在293T细胞中,荧光素酶报告基因系统验证XLOC＿011567能够与miR＿6760＿5p相互作用,miR＿6760＿5p能够与TP53I11相互作用。6、过表达XLOC＿011567的Ball-1细胞中,TP53I11表达上调;过表达miR＿6760＿5p后TP53I11表达下降;补救实验中,过表达XLOC＿011567同时转染miR＿6760＿5p mimics后,TP53I11升高趋势受到抑制。实验结论:1、在人急性B淋巴细胞白血病细胞系（Ball-1）中及急性B淋巴细胞白血病患者骨髓中,XLOC＿011567低表达。2、在人类急性B淋巴细胞白血病细胞系（Ball-1）中,过表达XLOC＿011567能够抑制细胞增殖,促进细胞早期凋亡。3、与人正常B淋巴母细胞系（HMy2.CIR）相比,人急性B淋巴细胞白血病细胞系（Ball-1）中,PI3K/AK T及MAPK/ERK、MAPK/P38通路发生改变。HMy2.CIR中,XLOC＿011567的表达能够影响AKT的磷酸化,影响细胞增殖及凋亡。4、XLOC＿011567通过XLOC＿011567/hsa＿miR＿6760＿5p/TP53I11机制影响细胞增殖、凋亡。
张丽萌[3]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中研究指明FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
黄梦婷[4]（2020）在《单细胞转录组混合测序研究》文中研究说明随着高通量测序技术的不断进步,人们对于基因表达差异和表型之间的关系有着越来越深刻的理解。传统基于样本整体的转录组信息仅能展现细胞群基因表达的平均水平,掩盖了细胞间基因表达的差异,因此研究样本中单个细胞的转录组数据可以获得更加全面的信息。现有常用的单细胞转录组测序技术根据其建库方法主要可分为两类,逐个细胞建库的测序技术和基于标签混合建库的测序技术,两种方法各有优点,但也存在着一定的局限,前者操作繁琐,成本较高,耗时较长;后者基因检测灵敏度较低,丢失了细胞的来源信息。如何平衡建库费用和基因检测灵敏度之间的关系,用较少的成本,在保留细胞来源的前提下,获得较高灵敏度的检测结果,是单细胞转录组测序面临的挑战,具有十分重要的理论意义和应用价值。本论文在课题组前期工作的基础上,完善优化了单细胞转录组混合测序方案。该方案基于压缩感知理论,利用单细胞转录组数据的稀疏性特征将采样和压缩同时进行,即根据预先设计的测量矩阵对单细胞转录组进行亚采样和混合,通过混合池的测序数据结合测量矩阵重构初始单细胞转录组数据。在此方案下,细胞的来源信息得以保留,同时由于混合池数少于初始单细胞数,所需构建测序文库数量降低,建库成本减少、时间缩短。计算机模拟实验和实际样本测序结果均表明,此方案具有较高的基因检测灵敏度,重构后获得的单细胞表达结果与逐个细胞建库测序的结果具有较高的一致性。本论文的主要研究内容如下:1.单细胞转录组混合测序方案的构建与优化本论文介绍了将压缩感知理论应用到单细胞转录组测序的具体方案,包括实验操作和数据分析流程,其中对前期方案的完善和改进主要体现在:（1）提出了在处理实际情景中的混合池测序数据时,需要根据每个混合池中加入的单细胞样本数量对基因表达矩阵进行测序深度的校正;（2）针对不同稀疏程度的样本采用了不同的正则化模型进行表达数据重构,提升了重构效果。2.基于计算机模拟的细胞表达数据重构本论文采用了两组不同稀疏程度的转录组测序数据集验证了基追踪模型和岭回归模型重构的适应面和有效性,并用t-SNE降维和k-means聚类对重构后的数据进行分析。实验结果表明两种重构方法在采样数足够的情况下在理论上可以保持较高的检测灵敏度。其中,基追踪模型对于稀疏程度较高的数据集有较好的重构效果,但其结果受采样次数和误差扰动的影响相对岭回归模型来说较大;岭回归模型对于稀疏程度较低的数据有较好的重构效果,其求解速度相对较快,对误差扰动的鲁棒性较好。3.单细胞转录组混合测序方案的实验验证本论文培养了七种不同的人类免疫细胞作为实验样本,利用基于Smart-Seq2原理的试剂盒对单细胞转录组进行逆转录、扩增及纯化,得到相应的cDNA样本。根据计算机生成的压缩感知测量矩阵选取单细胞cDNA样本进行亚采样并混合,得到40个cDNA混合池并对其测序。利用混合池测序数据和测量矩阵重构得到单细胞转录组数据,将其与原始54个细胞的转录组数据进行比较,发现本方案基因检测的灵敏度可达到传统Smart-seq2单细胞转录组测序灵敏度的86.46%。由于样本中细胞间相似性程度较高,细胞的表达谱稀疏程度较低,实验结果表明岭回归模型的重构效果显着优于基追踪模型,其重构结果与传统单细胞转录组测序结果具有较高的一致性,细胞间相关系数平均值达到0.891,中位数为0.907。使用本论文构建的扰动模型对实验中的扰动进行评估,本次实验中的扰动为0.310.35,这一研究结果对今后预估转录组测序数据的扰动水平有重要的指示意义。
陈秀珍[5]（2020）在《广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究》文中进行了进一步梳理广藿香（Pogostemon cablin（Blanco）Benth.）是着名的岭南道地药材,十大广药之一,是临床常用的芳香化湿药。从广藿香中提取的广藿香油是医药工业和轻化工业的重要原料,市场需求量大。广藿香是获得广藿香油的唯一天然来源,其最主要的成分是广藿香醇（Patchoulol）,又称为“百秋李醇”,是一种代表性的倍半萜类物质,具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性,更是我国历版药典中用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。因此,广藿香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用,广藿香萜类次生代谢模式和广藿香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明,广藿香醇合酶（Patchoulol synthase,PatPTS）能直接催化法呢基焦磷酸（FPP）生成倍半萜类终产物广藿香醇,对于广藿香醇的合成积累最为关键。目前对广藿香的萜类合成在转录调控方面的研究尚没有报道,特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究,相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此,本研究率先开展了调控广藿香醇生物合成的转录因子的挖掘,采用三代测序技术构建了广藿香全长转录本数据库,结合酵母杂交技术,以PatPTS的启动子作为靶调控位点,通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子,并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究,以阐明广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制,为广藿香优良品种培养及广藿香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析采用PacBio单分子实时测序技术（Singlemolecular real-time,SMRT）构建了广藿香全长转录组参考图谱,重构获得了 82,335个全长转录本,共有65,826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库获得注释,注释率为79.95%。其中注释为萜类生物合成相关途径相关的转录本有103个,共包括广藿香醇合成相关关键酶基因16个,并分析获得3,176个转录因子序列,分别属于90个不同的家族。1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析利用 Invitrogen 的 CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit 构建来广藿香高质量酵母杂交cDNA文库,其库容为8.6×106CFU,重组率为>95%,满足次级文库要求,可用于后续文库筛选试验。2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本,设计引物克隆获得PatPTS基因1,659 bp ORF序列和3,392 bp gDNA序列,以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析,发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件,同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件,还含有JA、ABA、Ethylen（乙烯,ET）等激素响应元件。2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选以PatPTS的启动子为诱饵从广藿香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI、Uniprot等数据库进行候选片段注释分析,从广藿香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体,并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证,结果表明 PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。3转录因子调节PatPTS基因表达参与广藿香醇合成调控的机制3.1广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究（1）据文献报道MYC2转录因子在植物萜类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用,因此本研究还对广藿香中MYC2转录因子进行了克隆,并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广藿香的全长转录组数据库筛选出1 1条注释为MYC的全长转录本,设计引物克隆获得8个MYC编码序列,对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核,均具有转录激活活性,缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT-qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达,低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。（2）在本氏烟中进行的双荧光素酶（Dual-luc）实验和在广藿香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达,同时可激活广藿香醇合成通路PatFPPS、PatIPPI、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广藿香醇的合成积累。3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究（1）Y1H实验中筛选得到的两个AP2/ERF家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,均属于DREB亚家族,具有该亚家族的保守位点,其中PatDREB属于该亚族A-4组,PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达,而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达,且转录表达水平受MeJA诱导,但表达模式有所差异。（2）酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补（BiFC）实验结果表明,PatDREB和PatERF061分别能与茉莉酸信号通路的抑制蛋白PatJAZ4互作,而PatERF061能与PatJAZ4在拟南芥原生质体的细胞核共表达。Dual-luc实验进一步表明,PatDREB和PatERF061能显着激活PatPTS启动子的活性,它们的转录调控功能受PatJAZ4和MeJA水平影响,其中PatJAZ4通过与PatERF061结合而抑制其转录调控功能,而MeJA能够逆转这种抑制作用。外源MeJA能够抑制PatDREB转录调控功能,而PatJAZ4对PatDREB的转录功能影响不大。（3）广藿香叶片瞬时过表达实验表明,PatDREB和PatERF061均能通过激活广藿香醇合成途径的关键酶基因的表达,从而促进广藿香醇的合成积累。PatERF061与PatJAZ4共过表达则抑制广藿香醇的合成积累,与dual-luc结果一致。说明PatDREB和PatERF061是促进广藿香醇合成的重要转录因子,而且是茉莉酸信号通路的重要组分。3.3 MYBrelated转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究（1）Y1H筛选获得的PatSWC4为MYBrelated家族转录因子,含有SANT/Myb-like domain of DAMP 1 和 DNA methyltransferase 1-associated protein 1（DMAP1）两个保守功能域。PatSWC4主要于细胞核定位表达,在广藿香各个组织部位均有表达,且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明,PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性,添加MeJA后,激活作用更显着提高;PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能,而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广藿香叶片中瞬时过表达PatSWC4,能激活广藿香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广藿香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERF061和3个PatMYC2的表达也显着提高,从而促进了叶片中广藿香醇的合成和积累。（2）Y2H 和 Dual-luc 实验表明 PatSWC4 能分别与 PatDREB、PatERF061形成转录复合体,复合体能激活PatPTS的启动子活性,外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合,抑制转录复合体的形成,从而抑制PatPTS启动子的活性,这种作用在施加MeJA后可消除,甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、PatERF061在广藿香叶片中进行瞬时共过表达,也能显着促进广藿香醇的合成和积累。3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究（1）是Trihelix家族SIP1亚家族转录因子,N端有一个Trihelix保守结构域和一个第四α螺旋结构域,C端有一个卷曲螺旋结构域。预测发现在蛋白序列的中、下游共有两个核定位信号（NLS）,PatASIL2在拟南芥原生质体亚细胞定位于细胞核,与预测一致。PatASIL2在不同的组织均有表达,且转录表达水平受MeJA的诱导。Dual-luc实验表明PatASIL2能抑制PatPTS启动子活性,施加MeJA后,PatASIL2则激活PatPTS启动子转录活性。广藿香叶片瞬时过表达PatASIL2能促进广藿香醇的合成和积累,激活广藿香醇合成途径PatFPPS、PatMVD等多数关键酶基因的表达,但抑制PatPTS的表达。（2）Y2H 和 BiFC 实验,表明 PatASIL2 能分别与 PatDREB、PatERF061 在细胞核形成转录复合体。PatASIL2分别与两个DREB瞬时共过表达都能促进广藿香叶片中广藿香醇的合成和积累。说明PatASIL2为广藿香醇合成的重要调控因子,且能与两个DREB形成转录调控复合体。3.5两个锌指蛋白可能调控广藿香醇的合成酵母单杂交筛选获得的PatGATA17和PatGIS2均为锌指蛋白。PatGATA17属于Zf-GATA转录因子家族,主要于细胞核表达;具有转录激活活性。该基因在广藿香根和成熟叶表达量较高,且受MeJA和低温诱导。PatGATA17能够结合PatPTS的启动子并激活其转录活性,进而促进广藿香醇的合成积累。而PatGIS2属于Zf-CCHC基因家族,通过结合PatPTS的启动子并抑制其转录活性,进而抑制广藿香醇的合成积累。综上所述,为挖掘鉴定广藿香醇生物合成的转录调控因子,本研究首先构建了广藿香的全长转录组和酵母杂交文库,根据转录组注释分离克隆了广藿香MYC2转录因子,并研究其在广藿香醇生物合成中的重要作用,以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了 6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广藿香醇生物合成的转录因子,并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERF061、PatSWC4和PatASIL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导,可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子（PatSWC4、PatASIL2）形成转录复合体调控广藿香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广藿香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子,功能分析揭示了其调控广藿香醇生物合成的可能模型,不仅促进从转录调控上揭示广藿香醇的生物合成分子机制,在广藿香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破,而且有助于广藿香及广藿香挥发油的质量控制,为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。
覃杨梅[6]（2019）在《文昌鱼连续胚胎发育时期中可变剪切的发现与功能探索》文中研究指明可变剪切（alternative splicing）赋予了基因表达和功能的多样性,对细胞分化、细胞命运、组织器官发育及其功能维持具有重要的调控作用。区别于基因层面的研究,从isoform水平去开展分析可以了解基因功能的改变。文昌鱼是研究脊椎动物胚胎器官发育的理想动物模型,在文昌鱼胚胎发育过程中开展可变剪切研究,具有其它模式生物不具备的优点。相关研究对脊椎动物的器官胚胎发育和进化起源研究具有积极的参考价值。由于现有基因组注释的不理想,以文昌鱼为模式动物开展胚胎基因表达的动态研究存在着转录本拼接、注释和定量不可靠的问题。为此,本研究以佛罗里达文昌鱼（Brachiostoma floridae,B.floridae）为研究载体,基于16个胚胎发育时期的链特异性转录组测序数据和七个胚胎发育时期混合样品的三代测序数据,开发了一个转录本整合文库计算工作流,构建了一个含有164,603超级转录本（supertranscript）、189,528转录本的佛罗里达文昌鱼转录组参考文库,并利用Annocript流程对文库进行了全面的注释。其中,我们发现了 16,231个基因可变剪切所产生的41,157个isoform。接着,我们以文昌鱼转录组参考文库为模板,对转录组进行表达水平分析,绘制了文昌鱼胚胎发育连续表达谱。基于连续表达谱,我们开展了文昌鱼胚胎发育基因表达模式的系统性分析。首先,我们发现了 28,789个特异性表达基因,24,971个选择性表达基因,21,167个抑制表达基因和2,888个管家基因。基因本体论（Gene Ontology,GO）功能分析表明以上四类模式表达基因在发育中起到重要作用。其次,基于基因表达的速度变化,结合KOG功能注释和基因表达在不同发育时期的变化趋势,我们推测文昌鱼的母体-合子启动在受精后并在256细胞时期结束。此外,利用NCA算法我们预测了 80转录因子在文昌鱼胚胎发育过程中的活性,并描述转录因子之间是如何相互协作保证胚胎发育进程的正常进行。接下来,我们对文昌鱼不同胚胎发育时期的可变剪切进行了系统分析。从可变剪切的角度阐述了文昌鱼在进化的地位,描绘了文昌鱼不同胚胎发育时期转录组的差异。我们发现大规模isoform切换事件发生在256细胞-原肠胚早期,原肠胚早期-原肠胚中期,以及神经胚中期-神经胚晚期,这暗示在这三个时期胚胎通过基因的可变剪切形式进行复杂而又精密的胚胎发育调控。进一步功能分析发现,isoform切换的倾向性为protein-coding向noncoding切换,长ORF向短ORF切换,不同domain之间切换。我们也以KLF4（Kruppel-like factor4）为例,阐述了 isoform切换背后的生物学意义。综上所述,本研究取得了以下几项成果:（1）我们构建了文昌鱼转录组参考库,绘制了文昌鱼胚胎发育基因连续表达谱,为系统开展文昌鱼胚胎发育奠定了数据基础。（2）模式基因和转录因子的分析,为文昌鱼的器官胚胎发育研究提供了潜在的研究靶标。（3）可变剪切在胚胎发育过程中发挥着重要的调控作用。我们从isoform切换角度,阐述了基因在胚胎发育的不同时期是如何通过可变剪切正确地行使功能和发挥作用,为后期的实验验证提供方向以及理论指导。总之,本研究为开展脊椎动物器官胚胎发育分子机制研究提供了基因线索和方法参考,也为文昌鱼的模式化提供了数据支持。
陈明[7]（2019）在《GmCOL4、GmZTL1与顺式元件HSE响应高温高湿以及调控GmSBH1的研究》文中研究指明大豆[Glycine max（L）Merr.]是世界上重要的油料作物,因其种子含有丰富的植物蛋白质,故在我国种植业结构调整中有着举足轻重的地位。在我国南方高温高湿多雨的夏季对春大豆种子生理成熟期有重要的影响,导致种子发生田间劣变,对春大豆的品质和产量造成严重的影响。基因表达的上游调控网络,对植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫的应答具有重要的调控作用。本实验室前期研究表明,大豆基因GmSBH1对高温高湿胁迫响应强烈,转基因植株能显着提高对高温高湿的抗性。以实验室的前期研究为基础开展以下研究:（1）GmSBH1启动子的分离和响应高温高湿核心顺式元件的鉴定;（2）以田间劣变抗性品种湘豆3号的种子为材料,构建高温高湿酵母单杂交cDNA文库;（3）以鉴定的高温高湿核心顺式作用元件（HSE）作为诱饵,筛选高温高湿酵母单杂交cDNA文库;（4）验证顺式作用元件HSE与大豆转录因子GmCOL4互作关系;（5）利用GST pull-down、双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交技术分别从体内外验证GmCOL4与GmZTL1的互作关系;（6）利用荧光定量、转基因功能验证、亚细胞定位等技术阐明GmCOL4与GmZTL1两个基因参与植株的形态建成及种子劣变抗性过程。通过以上研究旨在为GmSHB1参与种子田间劣变的上游调控网络提供理论依据。主要研究结果如下:1、扩增GmSBH1启动子序列（GmSBH1P,2040bp）。具有典型的TATA box和CAAT box;该启动子含有两种热激响应元件HSE和STRE以及其他多种响应生物和非生物胁迫的顺式作用元件。通过对GmSBH1P5’端连续缺失片段驱动GUS基因在大豆子叶节和烟草中的瞬时表达分析发现,-1121到-638 bp是该启动子响应高温高湿必须的。点突变和缺失实验表明HSE是响应高温高湿的核心元件。2、构建高温高湿酵母单杂交cDNA文库,文库的质量较好,文库的转化效率高于1×106,以高温高湿元件HSE作为诱饵序列,与构建好的酵母cDNA文库进行单杂交筛选,初步筛选到169个阳性克隆可能与之互作;经DNA片段测序比对发现这169个阳性克隆属于82种不同的蛋白,大致可分为8类,分别为贮藏蛋白、种子成熟蛋白、防御蛋白、核糖体蛋白、信号转导蛋白、各种酶和蛋白酶抑制剂、其他功能蛋白和未知功能蛋白。3、从82个结合蛋白中挑选了参与发育和逆境胁迫相关基因GmCOL4,根据NCBI数据库公布的GmCOL4核酸序列,从大豆中分离出GmCOL4完整的编码序列,序列分析表明GmCOL4基因的ORF全长930 bp,编码310个氨基酸;进化树表明GmCOL4属于锌指转录因子BBX家族;蛋白结构域分析表明其含有BBOX1,BBOX2和CCT三个结构域;基于基因枪介导的烟草叶肉细胞瞬时表达实验表明,GmCOL4定位在细胞核中。自激活检测表明BBOX2存在自激活活性,而BBOX1能够抑制自激活。通过改变HSE元件串联的数量和点突变进一步在酵母体内验证HSE与GmCOL4的相互作用。4、根据前人的研究和软件分析表明GmCOL4可能与GmZTL1相互作用。因此从大豆中分离出GmZTL1完整的编码序列,该基因的ORF全长为1851bp,编码617个氨基酸;生物信息学分析显示,GmZTL1的氨基酸序列含有三个保守域,分别是PAS domain、F-BOX和Kelch domain;基于基因枪介导的烟草叶肉细胞瞬时表达实验表明,GmZTL1是一个核蛋白。利用酵母双杂交实验、双分子荧光互补实验（BiFC）以及GST pull-down技术从体内外验证了 GmCOL4与GmZTL1能够特异性结合。5、qRT-PCR表明,在抗性品种湘豆3号中,GmCOL4主要在子叶和成熟的豆荚中表达;而在不抗品种宁镇1号中,GmCOL4主要在成熟的种子中表达;无论是抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号中,GmZTL1主要在成熟豆荚和成熟种子中表达。生理成熟期经高温高湿胁迫后,GmCOL4在抗性品种湘豆3号胁迫处理6、12、24和168 h时表达量显着上调,而在不抗品种宁镇1号胁迫处理12 h和96 h后显着上调表达。发现经高温高湿胁迫后,GmZTL1在湘豆3号和宁镇1号中的表达趋势类似于GmCOL4,但处理48 h后,在湘豆3号中GmZTL1显着下调表达,但在宁镇1号中变化不大。6、异源表达结果表明,GmZTL1能够使烟草叶片局部白化。石蜡切片结果显示GmCOL4转基因烟草植株的栅栏细胞排列比野生型更加紧密。在GmZTL1转基因烟草植株正常部分中,栅栏细胞变的短而不规则,在白化部分近轴和远轴的表皮细胞均变大且栅栏细胞和海绵细胞大量减少。另外,透射电镜分析表明,GmOL4转基因株系和GmZTL1转基因株系的正常部分以及野生型的叶肉细胞中均积累了大量的淀粉粒,叶绿体受到严重挤压,这些现象在转基因株系的白化部分中没有发现,但是发现该部分细胞的轮廓变得不规则。叶绿体结构分析表明,GmCOL4转基因株系的基粒片层分布紧密,基质片层变形,在GmZTL1转基因株系白化部分中出现大量嗜锇颗粒。对GmCOL4和GmZTL1转基因烟草植株经高温高湿处理后发现,GmCOL4和GmZTL1过表达烟草植株的损伤程度远低于野生型植株。另外,GmCOL4和GmZTL1过表达烟草植株在高温高湿处理后的发芽率、种子活力和成苗率都明显高于野生型植株。以上的实验结果表明,GmCOL4和GmZTL1在植株的生长发育以及响应高温高湿胁迫过程中有着至关重要的作用。
马跃[8]（2019）在《环状RNA circRIMBP2在急性B淋巴细胞白血病中的表达及功能研究》文中进行了进一步梳理目的:急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）是一种以B淋巴细胞异常增生、聚集及组织浸润为特点的儿童期恶性肿瘤,在成人当中相对少见。目前多数患者可通过多剂联用治疗方案进行治疗,但对于耐药和治疗效果不显着的患者来说预后较差。因此,对B-ALL的发病机制及治疗靶点仍需进一步研究。环状RNA（circRNA）是一类具有单链闭合环状结构的内源性非编码RNA。circRNA分子主要是由来源于前体RNA的外显子和/或内含子通过反向拼接产生的,且其形成受多种蛋白的正性和负性调控。circRNA广泛分布于体内各类组织细胞中,且具有一定的组织、时序和疾病特异性,高保守性及结构稳定性等特点。circRNA可顺式调控亲本基因的表达,可作为miRNA海绵,还可作为疾病的生物标志物而发挥作用。circRNA在多种生理和病理过程中对基因表达起着重要作用,特别是在肿瘤的形成和发展过程中。circRNA在白血病中的研究尚处于起步阶段,仅少数circRNA的差异表达和分子功能在急性髓系白血病中被初步揭示。然而,关于circRNA在急性B淋巴细胞白血病中是否有表达差异及其表达机制尚不清楚。本研究旨在通过探索circRNA在BALL-1细胞中的表达机制,为B-ALL的诊断和治疗提供新的诊断指标及治疗靶点。研究方法:1、提取人B淋巴母细胞Hmy2-cir细胞系和人急性B淋巴细胞白血病BALL-1细胞系的总RNA,构建测序文库。对文库进行circRNA测序,得到两种细胞系的circRNA表达谱。2、对两种细胞系的circRNA表达谱进行生物信息学分析。以Hmy2-cir细胞作为正常对照,发现与正常细胞相比,有12561种circRNAs在BALL-1白血病细胞中表达下调,我们选取表达下调差异最显着的7种circRNAs,使用RT-qPCR检测这7种circRNAs在两种细胞系中的相对表达量,验证其表达趋势是否与circRNA测序结果一致。3、根据RT-qPCR结果及构建过表达载体的难易程度（由circRNA序列长度决定）,筛选出chr12:130884224-130907106-进一步研究,并根据其来源基因将其命名为circRIMBP2。利用腺病毒将circRIMBP2过表达载体转染进BALL-1细胞中,并通过RT-qPCR验证其过表达效果。4、以空白（Control组）和空载（NC组）为对照,通过CCK-8细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验研究过表达circRIMBP2后对BALL-1细胞生物学行为的影响。5、以Control组和NC组为对照,Western-blot检测过表达circRIMBP2后ERK1/2及p-ERK1/2在BALL-1细胞中的表达。结果:1、检测出人类B淋巴母细胞Hmy2-cir细胞系及急性B淋巴细胞白血病BALL-1细胞系的circRNA表达谱,Hmy2-cir细胞中有14720种circRNAs表达,Ball-1细胞中有7516种circRNAs表达。2、挑选出的7种circRNAs在RT-qPCR实验中的结果与circRNA测序结果趋势一致。相比于Hmy2-cir细胞,circRIMBP2在Ball-1细胞中低表达。3、以Control组和NC组为对照,在Ball-1细胞中过表达circRIMBP2后,Ball-1细胞凋亡率升高,细胞增殖能力降低,处于G1期细胞数量增多。4、以Control组和NC组为对照,在Ball-1细胞中过表达circRIMBP2后,ERK1/2的表达无显着变化,p-ERK1/2的表达减少。结论:1、以Hmy2-cir细胞作为正常对照,circRIMBP2在BALL-1细胞中低表达。2、过表达circRIMBP2可显着抑制BALL-1细胞增殖,并促进BALL-1细胞凋亡。3、过表达circRIMBP2可显着抑制MAPK信号通路中p-ERKl/2的表达水平,从而影响BALL-1细胞的增殖和凋亡。
齐晓兰[9]（2018）在《PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用》文中提出CRISPR/Cas9文库介导的全基因组筛选技术简单高效,已经被广泛地应用于病毒宿主因子筛选、肿瘤药物靶点筛选以及免疫因子筛选等多个研究领域。目前CRISPR/Cas9文库转染多数是由病毒载体介导的,而病毒文库在体内直接进行筛选受到诸多限制,因为它存在制备步骤繁琐、对实验条件要求高、具有安全风险、具有免疫原性、转染细胞类型受限等一系列问题。因此,开发一种新型的可以应用于体外和体内筛选的CRISPR/Cas9文库系统对于促进生命科学的发展具有非常重要的意义。本研究将CRISPR/Cas9技术与递送系统piggyBac（PB）转座子进行结合,创建了高效的基因打靶系统,并且在此基础上构建了靶向小鼠全基因组的PB-CRISPR/Cas9文库系统。首先,本研究以打靶小鼠Tet1、Tet2和Tet3基因为例,验证了 PB-CRISPR/Cas9打靶系统的有效性;随后,利用芯片合成技术合成了靶向小鼠全基因组的单链向导RNA（Single guide RNA,sgRNA）序列文库（文库靶向20611个编码基因和1175个microRNAs,针对每个基因设计了 4-6个sgRNAs,此外,文库中还包含1000条无意义的sgRNAs作为筛选成功与否的参考,共计130209条sgRNAs）,将其克隆到PB载体上获得了 PB-CRISPR/Cas9文库系统;对文库进行高通量测序分析发现,构建的文库中sgRNAs的数量占芯片合成文库的94.5%,并且在各染色体上均匀分布。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库构建成功。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库是否可以在体外进行高效稳定的筛选,本研究利用文库系统在小鼠胚胎干细胞中进行了多能性维持负调控因子的筛选。通过对Nanog-GFP报告系统的小鼠胚胎干细胞进行文库转染和严格筛选,获得了可以在分化培养基中长期传代的细胞;多能性因子的免疫荧光染色以及多能性基因表达检测结果表明,这些细胞仍然维持在多能性状态;对这些细胞中sgRNAs进行高通量测序分析发现,5次重复实验均得到了 Tcf7l1、Csnkla1、Socs3和Flcn等与干细胞自我更新维持相关的负调控因子。结果证明本研究创建的PB-CRISPR/Cas9文库能够在体外高效稳定地进行规模化筛选。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库在体内环境下进行筛选的可行性,本研究利用文库系统在小鼠活体内进行了肝脏肿瘤抑制因子的筛选。通过尾静脉注射的方法将文库载体和肿瘤诱导背景载体(hNras（il2V过表达以及Cdkn2a敲除）转入到3-4周龄野生型ICR公鼠的肝脏细胞中,45-60天后实验小鼠产生了肝脏肿瘤;苏木精伊红染色和肿瘤标志蛋白的免疫组化染色结果表明,这些肿瘤大多数为肝内小胆管上皮细胞来源的肝内胆管细胞癌;对肝脏中的sgRNAs进行高通量测序分析,得到了Trp53、Cdkn2b、Parm1和Sel1l2等与肝脏肿瘤发生相关的肿瘤抑制因子。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库可以在体内直接进行筛选应用。综上所述,本研究创建了靶向小鼠全基因的PB-CRISPR/Cas9文库系统,利用该文库系统在小鼠胚胎干细胞中筛选获得了多能性维持负调控因子,并且在活体小鼠肝脏中筛选获得了肝脏肿瘤抑制因子,体外和体内的结果均证明PB-CRISPR/Cas9文库系统筛选高效,应用便捷。这一系统的建立为今后在体内外的筛选提供了新的选择和思路。
孙振[10]（2019）在《CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究》文中研究指明5-甲基胞嘧啶（m5C）作为RNA的一种普遍的修饰近年来得到广泛的关注。越来越多的研究表明,RNAm5C修饰在RNA加工、RNA稳定性、RNA出核转运以及mRNA翻译等过程中起到重要作用。NSUN2（NOP2/Sun domain family,member 2）是哺乳动物RNAm5C甲基转移酶之一,主要负责tRNA和mRNA的甲基化。最近研究表明,NSUN2参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、干细胞分化、脑和睾丸发育以及肿瘤发生等。但对NSUN2在生物体发育和疾病发生中的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。本研究以肾小管上皮细胞系HEK293和肝癌细胞系HepG2为研究模型,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NSUN2基因,观察NSUN2敲除后细胞的表型、基因表达和mRNA m5C修饰的变化,进而阐明NSUN2基因及其RNA m5C修饰的生物学功能和作用。1.利用CRISPR/Cas9技术建立RNA m5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将抗性筛选标记（NeoR和PuroR）及转录终止信号BGH poly（A）整合至NSUN2基因第一外显子上终止NSUN2基因的转录。针对NSUN2基因,设计并筛选出具有高基因编辑效率的gRNA位点。构建出用于沉默NSUN2表达并筛选NSUN2去表达细胞系的Donor载体,NSUN2-PURO-BGH-Donor和NSUN2-NEO-BGH-Donor。通过转染、药物筛选和鉴定等过程,我们最后得到NSUN2基因沉默效率稳定维持在99%和90%的HEK293细胞系及HepG2细胞系,为研究NSUN2基因的功能奠定基础。2.NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞表型影响分析本研究旨在了解NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系生理表型的影响。我们通过绘制细胞生长曲线、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、小管形成实验和流式细胞术等方法检测了 NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞增殖、迁移和转移等能力的影响。结果表明,NSUN2基因敲除能显着抑制HEK293细胞和HepG2细胞的增殖和迁移能力,这一抑制作用能通过重新表达NSUN2来恢复。NSUN2基因参与细胞周期进程调控,基因敲除能影响HepG2细胞周期分布,导致G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多。NSUN2基因还介导肿瘤细胞的转移,NSUN2基因敲除能显着抑制HepG2细胞侵袭能力。此外,我们发现NSUN2基因参与调节肿瘤细胞的血管新生过程,NSUN2基因敲除显着抑制HepG2细胞血管新生能力。3.转录组测序检测NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系基因表达的影响本研究旨在了解NSUN2基因敲除对细胞基因表达谱的影响。我们通过高通量测序研究NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞mRNA的表达谱的影响。结果显示,NSUN2基因敲除后,在HEK293和HepG2细胞中分别筛选到967和2681个差异表达基因。功能分析表明,HEK293细胞差异表达基因通过神经配体-受体互作、蛋白消化和吸收、系统性红斑狼疮、ECM受体互作等信号通路影响细胞黏附、神经系统发育、细胞表面受体信号、细胞分化和细胞增殖等生物过程。HepG2细胞的差异表达基因则与细胞信号转导、迁移、增殖、血管新生、细胞黏附、炎症反应及神经系统发生等生物过程显着相关。其主要富集到Hippo信号通路、癌症通路、神经配体-受体互作、ECM-受体互作、Wnt通路以及MAPK信号通路等。进一步分析表明,ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt信号途径可能参与到NSUN2基因敲除介导的细胞增殖和迁移抑制,其中TGFB1、THBS1、CD44、TGFA和LOXL2等基因可能发挥重要作用。我们结果在分子水平上表明NSUN2基因参与调节的生物进程和影响的信号通路。4.RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除对HEK293和HepG2细胞m5C修饰影响为了解NSUN2基因介导RNA甲基化的功能,我们通过RNA-BisSeq技术检测分析NSUN2基因敲除对基因RNA甲基化影响。结果显示,在HEK293和HepG2细胞中共检测到4052和2192个差异甲基化位点,分布于1185和707个mRNA中。通过BSP法,我们对测序结果进行验证,并证实了结果的可靠性。对差异甲基化基因功能分析发现,在HEK293细胞中,差异RNA甲基化基因功能主要涉及翻译、mRNA加工、mRNA剪接、mRNA出核转运和mRNA稳定性等,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。在HepG2细胞中,差异甲基化基因主要参与翻译调节、mRNA代谢、细胞黏附、蛋白折叠、RNA剪接和细胞周期等生物过程。调节通路则主要涉及核糖体、内质网蛋白质加工、剪接体、非酒精性脂肪肝、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接、PI3K-Akt信号通路和细胞周期等信号途径。综上所述,本研究建立了两个NSUN2基因敲除的细胞系。NSUN2基因敲除能显着抑制细胞增殖和迁移,影响细胞周期,抑制肿瘤细胞血管新生。NSUN2基因敲除导致的差异表达基因功能主要涉及神经系统发育、细胞信号转导、细胞分化、增殖、迁移和血管新生等生物过程,影响神经配体-受体互作、ECM-受体互作、TGF-β和PI3K-Akt等信号途径。NSUN2基因敲除导致的差异RNA甲基化基因则主要涉及转录调节、翻译起始、RNA加工和RNA稳定性等生物过程,调节的通路包括核糖体、剪接体、RNA转运、癌症蛋白聚糖、焦点粘连、紧密连接以及PI3K-Akt等信号途径。
二、HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文提纲范文）
（1）禽呼肠孤病毒非结构蛋白p17的宿主互作蛋白筛选及PRPS2功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒感染的流行状况及其危害 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的基因组结构及编码蛋白的功能 |
| 1.3 禽呼肠孤病毒p17蛋白与宿主蛋白互作的相关研究进展 |
| 1.3.1 p17与宿主蛋白hnRNP A1互作调控其核质穿梭 |
| 1.3.2 p17与宿主蛋白Vimentin互作介导细胞周期阻滞 |
| 1.3.3 p17与宿主蛋白necleoporin Tpr互作促进病毒复制 |
| 第2章 禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡肝组织cDNA文库的构建及插入外源片段的检测 |
| 2.2.2 重组诱饵质粒的构建及自激活性与毒性检测 |
| 2.2.3 目的蛋白的筛选 |
| 2.2.4 回补验证互作蛋白 |
| 2.2.5 GO分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸡肝组织cDNA文库的构建与鉴定 |
| 2.3.2 重组诱饵质粒无自激活活性且对酵母菌无毒性 |
| 2.3.3 目的蛋白的获得与初步鉴定 |
| 2.3.4 候选基因的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 PRPS2与p17互作的验证及其对病毒复制的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要设备仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 重组质粒转染DF-1细胞 |
| 3.2.4 p17和PRPS2的共定位分析 |
| 3.2.5 免疫共沉淀 |
| 3.2.6 GST-pulldown |
| 3.2.7 q-PCR检测ARV感染细胞中PRPS2的表达 |
| 3.2.8 过表达PRPS2对ARV复制的影响 |
| 3.2.9 干扰PRPS2对ARV复制的影响 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 p17与PRPS2在细胞内具有相互作用 |
| 3.3.3 原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.4 p17与PRPS2在细胞外具有相互作用 |
| 3.3.5 PRPS2在ARV感染细胞中的表达量变化 |
| 3.3.6 过表达PRPS2促进ARV复制 |
| 3.3.7 干扰PRPS2抑制ARV复制 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）急性B淋巴细胞白血病circRNA表达分析及XLOC＿011567与增殖、凋亡相关性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:急性B淋巴细胞白血病中circRNA表达分析及临床验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 白血病患者标本 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 提取总RNA方法 |
| 2.2.3 临床样本单核细胞提取步骤 |
| 2.2.4 RNA质控 |
| 2.2.5 文库构建和测序 |
| 2.2.6 反转录合成cDNA |
| 2.2.7 circRNA引物设计 |
| 2.2.8 qRT-PCR反应 |
| 2.2.9 生物信息学分析 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人类正常B淋巴母细胞系(HMy2.CIR)及人类急性B淋巴细胞白血病细胞系(Ball-1)的circRNA表达谱 |
| 3.1.1 RNA琼脂糖凝胶结果 |
| 3.2 人类正常B淋巴母细胞系(HMy2.CIR)及人类急性B淋巴细胞白血病细胞系(Ball-1)的circRNA差异表达分析 |
| 3.2.1 GO分析 |
| 3.2.2 HMy2.CIR与Ball-1细胞中表达差异的circRNApathway分析 |
| 3.3 circ_SPECC1、LOC105370956、circ_ARHGAP10、circ_RIMBP2在Ball-1细胞系中低表达 |
| 3.4 LOC105370956在急性B淋巴细胞白血病患者骨髓中低表达 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:XLOC_011567参与急性B淋巴细胞增殖、凋亡的分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 Western blot相关溶液的配制 |
| 2.1.4 其他常用试剂配制 |
| 2.1.5 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 过表达质粒 |
| 2.2.3 检测转染效率 |
| 2.2.4 CCK8法 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测 |
| 2.2.6 qRT-PCR |
| 2.2.7 Western-blot |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析预测XLOC_011567的ceRNA调控网络 |
| 3.1.1 CircRNA-miRNA靶向预测结果 |
| 3.2 过表达XLOC_011567的Ball-1细胞系细胞凋亡率增加、增殖率降低 |
| 3.3 XLOC_011567通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞增殖,促进细胞凋亡 |
| 3.4 XLOC_011567通过XLOC_011567/hsa_miR_6760_5p/TP53I11机制影响细胞增殖、凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CircRNA的功能和疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.1.2 卵泡发育的调控 |
| 1.1.3 颗粒细胞的功能 |
| 1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
| 1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
| 1.2 FHL2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FHL2基因的结构 |
| 1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
| 1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
| 1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
| 1.3 蛋白质互作研究进展 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
| 1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.3 免疫组化分析 |
| 2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
| 2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
| 2.2.6 细胞定位 |
| 2.2.7 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
| 2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
| 2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
| 2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
| 2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
| 2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
| 2.5 小结 |
| 3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 试验主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
| 3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 试验主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
| 4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
| 4.2.3 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
| 4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
| 4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
| 4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
| 5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
| 5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
| 5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
| 5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
| 5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
| 5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
| 5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 样品来源 |
| 6.1.2 试验主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
| 6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
| 6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
| 6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
| 6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
| 6.2.6 数据统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
| 6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
| 6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
| 6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
| 6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
| 6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 8 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）单细胞转录组混合测序研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 单细胞转录组测序技术的发展 |
| 1.2.1 单细胞分离技术的发展 |
| 1.2.2 逐个细胞建库的单细胞转录组测序 |
| 1.2.3 大规模并行的单细胞转录组测序 |
| 1.3 单细胞转录组测序技术的应用及局限性 |
| 1.3.1 单细胞转录组测序技术的应用 |
| 1.3.2 单细胞转录组测序技术的局限性 |
| 1.4 压缩感知理论 |
| 1.4.1 压缩感知理论的原理 |
| 1.4.2 压缩感知理论的应用 |
| 1.4.3 单细胞转录组数据的稀疏性 |
| 1.5 本论文的研究内容 |
| 第二章 方案的构建与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方案设计及应用步骤 |
| 2.3 对前期方案的完善和改进 |
| 2.3.1 基因表达矩阵的标准化与校正 |
| 2.3.2 基于不同正则化模型的压缩感知重构算法 |
| 2.4 参数设置与评价指标 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 计算机模拟实验验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验数据 |
| 3.3 实验过程及结果 |
| 3.3.1 对稀疏程度较高的数据进行重构 |
| 3.3.2 对稀疏程度较低的数据进行重构 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 单细胞转录组的获取与亚采样 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 单细胞转录组的获取与亚采样 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验中的注意事项 |
| 4.2.3 细胞复苏、培养与冻存 |
| 4.2.4 单细胞的分离 |
| 4.2.5 逆转录反应及扩增 |
| 4.2.6 cDNA的纯化 |
| 4.2.7 单细胞样本的亚采样 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 纯化后cDNA浓度检测 |
| 4.3.2 纯化后cDNA的完整性检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 单细胞基因表达矩阵的重构 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 传统单细胞转录组测序数据的处理 |
| 5.3 单细胞基因表达矩阵的重构 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 测序结果的基本信息 |
| 5.4.2 检测的灵敏度分析 |
| 5.4.3 相关系数分析 |
| 5.4.4 基追踪模型和岭回归模型重构结果的比较 |
| 5.4.5 误差分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文的主要内容和研究成果 |
| 6.2 进一步的工作计划和应用展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士阶段发表的文章和专利 |
（5）广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 广藿香和广藿香油 |
| 1.2 广藿香萜类生物合成的研究概况 |
| 1.3 植物萜类次生代谢的转录调控研究概况 |
| 1.4 转录因子调控药用植物萜类代谢物合成的研究进展 |
| 2 立题依据及研究思路 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究思路 |
| 2.3 技术路线 |
| 第二章 广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析 |
| 1 基于PacBio三代测序的转录本识别和分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 2 酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 广藿香醇合酶(PatPTS)启动子克隆及其转录调控因子的初步筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香醇合酶(PatPTS)及其启动子的克隆分析 |
| 2.2 结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 调控广藿香醇生物合成的转录因子的表达及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2. 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究 |
| 2.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究 |
| 2.3 MYB related转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究 |
| 2.5 两个参与调控广藿香醇合成的锌指蛋白 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 综合讨论 |
| 2.1 两个DREB功能和调控机制差异 |
| 2.2 广藿香MYC2转录因子的结构与功能 |
| 2.3 转录复合体在广藿香醇生物合成的复杂调控机制 |
| 2.4 茉莉酸信号介导的广藿香醇合成转录调控机制探讨 |
| 2.5 参与调控广藿香醇合成转录因子在植物代谢工程的利用 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 miRNA前体预测结果 |
| 附录2 萜类合成通路相关转录本汇总表 |
| 附录3 本研究所用引物列表 |
| 附录4 全长转录组中PatPTS全长转录本 |
| 附录5 MYC转录因子同源比对 |
| 附录6 GIS2的同源蛋白 |
| 附录7 图表目录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详情摘要 |
（6）文昌鱼连续胚胎发育时期中可变剪切的发现与功能探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 可变剪切及其研究意义 |
| 1.1.1 可变剪切及其类型 |
| 1.1.2 可变剪切的机制 |
| 1.1.3 可变剪切的研究方法 |
| 1.1.4 可变剪切的研究意义 |
| 1.2 文昌鱼是开展胚胎发育研究的理想动物模型 |
| 1.2.1 文昌鱼的胚胎发育 |
| 1.2.2 文昌鱼作为胚胎发育模型的研究意义 |
| 1.3 本研究的目的以及研究思路 |
| 2 文昌鱼转录组参考文库的构建 |
| 2.1 研究材料和研究方法 |
| 2.1.1 研究材料 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 文昌鱼转录组参考库的构建 |
| 2.2.1 转录组测序与数据处理结果 |
| 2.2.2 转录组参考库构建流程 |
| 2.2.3 转录组参考库再精简与表达水平定量 |
| 2.2.4 转录组参考库的注释 |
| 2.3 文昌鱼转录组参考文库网站数据库的搭建 |
| 2.3.1 网站数据库设计和平台配置 |
| 2.3.2 网站数据库实现 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 文昌鱼胚胎发育过程中的模式表达 |
| 3.1 研究方法 |
| 3.1.1 模式基因 |
| 3.1.2 基因模式表达谱 |
| 3.1.3 NCA算法 |
| 3.2 文昌鱼胚胎发育过程中的模式基因 |
| 3.2.1 胚胎发育中的模式基因及其分布 |
| 3.2.2 模式基因在胚胎发育的作用 |
| 3.3 文昌鱼母体-合子过渡 |
| 3.3.1 母体-合子过渡 |
| 3.3.2 文昌鱼胚胎发育母体-合子过渡推断 |
| 3.4 文昌鱼胚胎发育的驱动信号 |
| 3.4.1 文昌鱼胚胎发育时期转录因子的活跃度推测 |
| 3.4.2 转录因子的活跃度变化暗示特殊的调控模式 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 文昌鱼胚胎发育中的可变剪切 |
| 4.1 研究方法 |
| 4.1.1 经典剪切事件分析 |
| 4.1.2 可变剪切描述和定量 |
| 4.1.3 Isoform切换挖掘 |
| 4.1.4 Isoform切换功能分析 |
| 4.2 文昌鱼胚胎发育中的isoform、剪接因子和经典剪切 |
| 4.2.1 文昌鱼胚胎发育中的isoform |
| 4.2.2 文昌鱼胚胎发育中的剪接因子 |
| 4.2.3 文昌鱼胚胎发育中的经典剪接事件 |
| 4.3 文昌鱼不同发育时期可变剪切的多样性 |
| 4.3.1 不同胚胎发育时期转录组可变剪切 |
| 4.3.2 不同胚胎发育时期可变剪切差异 |
| 4.4 文昌鱼不同胚胎发育时期isoform切换 |
| 4.4.1 文昌鱼不同发育时期isoform切换 |
| 4.4.2 Isoform切换所引起的功能变化 |
| 4.5 示例:KLF4在胚胎发育中的isoform切换 |
| 4.5.1 关于KLF4基因 |
| 4.5.2 文昌鱼中的KLF4基因 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）GmCOL4、GmZTL1与顺式元件HSE响应高温高湿以及调控GmSBH1的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物高温高湿胁迫的研究进展 |
| 1.1 植物生理生化机制研究进展 |
| 1.1.1 种子活力的变化 |
| 1.1.2 酶活性的变化 |
| 1.1.3 有毒物质积累 |
| 1.2 植物分子机制研究进展 |
| 2 植物启动子的研究进展 |
| 2.1 植物启动子的结构 |
| 2.2 植物基因启动子的类型 |
| 2.3 诱导型启动子的研究进展 |
| 2.4 植物基因启动子的克隆方法 |
| 2.5 植物基因启动子的功能分析方法 |
| 2.5.1 生物信息学分析 |
| 2.5.2 启动子活性分析 |
| 3 植物锌指转录因子BBX家族的研究进展 |
| 3.1 BBX蛋白的基本特征及分类 |
| 3.2 BBX转录因子的进化 |
| 3.3 BBX家族基因的功能研究 |
| 3.3.1 BBX蛋白参与幼苗的光形态建成 |
| 3.3.2 BBX蛋白调节植物开花 |
| 3.3.3 BBX蛋白参与避荫反应 |
| 3.3.4 BBX蛋白参与非生物胁迫 |
| 4 植物ZTL蛋白的研究进展 |
| 4.1 ZTL蛋白参与光周期反应 |
| 4.2 ZTL蛋白参与生物节律 |
| 4.3 ZTL蛋白对开花的调控 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 GmSHB1启动子的功能鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 载体以及植物材料 |
| 1.1.2 试剂和药品 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.1.4 溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 大豆叶片DNA的提取 |
| 1.2.2 GmSBH1P序列的分离 |
| 1.2.3 GmSBH1P序列分析 |
| 1.2.4 瞬时表达载体的构建 |
| 1.2.5 农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.2.6 GUS组织化学染色和荧光分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大豆总DNA检测 |
| 2.2 GmSBH1启动子(GmSBH1P)的分离 |
| 2.3 GmSBH1P顺式作用元件的分析 |
| 2.4 GmSBH1P响应高温高湿胁迫核心顺式元件的鉴定 |
| 2.4.1 GmSBH1P能够响应高温高湿胁迫 |
| 2.4.2 GmSBH1P响应高温高湿胁迫的核心区域 |
| 2.4.3 HSE是GmSBH1P中响应高温高湿胁迫的核心顺式作用元件 |
| 3 讨论与结论 |
| 第三章 顺式作用元件HSE结合蛋白的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 cDNA文库构建的材料及处理 |
| 1.1.2 载体和菌株 |
| 1.1.3 试剂和药品 |
| 1.1.4 溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 种子总RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 转化酵母均值 |
| 1.2.4 诱饵载体构建 |
| 1.2.5 质粒转化酵母细胞 |
| 1.2.6 cDNA文库的转化 |
| 1.2.7 酵母质粒DNA的提取与序列比对 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湘豆3号种子总RNA的提取 |
| 2.2 双链cDNA的合成以及纯化 |
| 2.3 构建cDNA文库 |
| 2.4 湘豆3号种子cDNA文库质量的鉴定 |
| 2.4.1 cDNA文库转化酵母的效率 |
| 2.4.2 cDNA文库滴度的计算 |
| 2.4.3 cDNA文库重组比的测定 |
| 2.5 酵母单杂交诱饵载体的构建 |
| 2.6 诱饵序列自激活检测 |
| 2.7 酵母单杂交文库的筛选 |
| 2.8 结合蛋白分析 |
| 3 讨论和结论 |
| 3.1 高温高胁迫酵母cDNA文库的构建 |
| 3.2 诱饵DNA序列自激活检测 |
| 3.3 酵母筛选结果分析 |
| 第四章 GmCOL4的亚细胞定位、自激活检测及与HSE的结合验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料、载体和菌株 |
| 1.1.2 试剂和药品 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 种子总RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 1.2.3 GmCOL4基因的分离 |
| 1.2.4 GmCOL4的生物信息学分析 |
| 1.2.5 GmCOL4的亚细胞定位 |
| 1.2.6 GmCOL4的自激活检测 |
| 1.2.7 酵母单杂交实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大豆叶片总RNA的提取和cDNA质量检测 |
| 2.2 GmCOL4基因的分离 |
| 2.3 GmCOL4的生物信息学分析 |
| 2.3.1 进化树分析 |
| 2.3.2 氨基酸多序列比对 |
| 2.4 GmCOL4的亚细胞定位 |
| 2.4.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 2.4.2 GmCOL4的亚细胞定位 |
| 2.5 GmCOL4的自激活检测 |
| 2.5.1 自激活载体的构建 |
| 2.5.2 GmCOL4的自激活和β-半乳糖苷酶活性检测 |
| 2.6 酵母单杂交实验 |
| 3 讨论和结论 |
| 3.1 GmCOL4的基本特征分析 |
| 3.2 GmCOL4的亚细胞定位分析 |
| 3.3 GmCOL4的自激活活性分析 |
| 3.4 酵母单杂交实验分析 |
| 第五章 GmCOL4与GmZTL1蛋白互作方式研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料、载体和菌株 |
| 1.1.2 试剂和药品 |
| 1.1.3 引物设计 |
| 1.1.4 溶液的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 种子总RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 1.2.3 GmZTL1的生物信息学分析 |
| 1.2.4 GmZTL1的亚细胞定位 |
| 1.2.5 酵母双杂交实验 |
| 1.2.6 BiFC实验 |
| 1.2.7 GST pull-down实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大豆叶片总RNA的提取和cDNA质量检测 |
| 2.2 GmZTL1基因的分离 |
| 2.3 GmZTL1的生物信息学分析 |
| 2.3.1 进化树分析 |
| 2.3.2 氨基酸多序列比对 |
| 2.4 GmZTL1的亚细胞定位 |
| 2.4.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 2.4.2 GmZTL1的亚细胞定位 |
| 2.5 酵母双杂交验证GmCOL4和GmZTL1互作 |
| 2.6 BiFC验证GmCOL4和GmZTL1互作 |
| 2.6.1 BiFC载体的构建 |
| 2.6.2 BiFC验证GmCOL4和GmZTL1互作 |
| 2.7 GST pull-down验证GmCOL4和GmZTL1互作 |
| 2.7.1 原核表达载体的构建 |
| 2.7.2 重组蛋白的原核表达 |
| 2.7.3 GST pull-down验证GmCOL4和GmZTL1互作 |
| 3 讨论和结论 |
| 3.1 GmZTL1的基本特征分析 |
| 3.2 GmZTL1的亚细胞定位分析 |
| 3.3 GmZTL1和GmCOL4的互作方式分析 |
| 第六章 GmCOL4与GmZTL1两个基因的表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 材料的培养和处理 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 引物设计 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 不同组织总RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 1.2.3 荧光定量PCR |
| 1.2.4 数据处理和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GmCOL4基因的组织特异性表达 |
| 2.2 高温高湿胁迫下GmCOL4基因表达特性 |
| 2.3 GmZTL1基因的组织特异性表达 |
| 2.4 高温高湿胁迫下GmZTL1基因表达特性 |
| 3 讨论和结论 |
| 3.1 GmCOL4和GmZTL1组织表达分析 |
| 3.2 GmCOL4和GmZTL1应答高温高湿胁迫的分析 |
| 第七章 GmCOL4与GmZTL1两个基因的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 材料的培养和处理 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 引物设计 |
| 1.1.5 溶液的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转基因载体的构建 |
| 1.2.2 烟草苗的无菌培养 |
| 1.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 1.2.4 转基因植株的阳性鉴定 |
| 1.2.5 转基因植株的表型观察 |
| 1.2.6 烟草叶片的石蜡切片 |
| 1.2.7 烟草叶片透射电镜 |
| 1.2.8 烟草叶片叶绿素含量的测定 |
| 1.2.9 烟草种子活力的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GmCOL4和GmZTL1转基因载体的构建 |
| 2.2 转基因植株的阳性鉴定 |
| 2.3 转基因植株的表型观察 |
| 2.4 转基因植株的微观结构观察 |
| 2.5 高温高湿胁迫下转基因株系种子活力分析 |
| 3 讨论和结论 |
| 3.1 GmCOL4基因功能分析 |
| 3.2 GmZTL1基因功能分析 |
| 全文总结 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 序列信息 |
| 附录2 相关试剂配置 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）环状RNA circRIMBP2在急性B淋巴细胞白血病中的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA质控结果 |
| 3.2 circRNAs在急性B淋巴细胞白血病中的表达 |
| 3.3 circRNA测序数据的验证 |
| 3.4 差异表达circRNAs的生物信息学分析 |
| 3.5 circRIMBP2 过表达效率检测 |
| 3.6 circRIMBP2 过表达可抑制Ball-1 细胞增殖 |
| 3.7 circRIMBP2 过表达可影响Ball-1 细胞周期 |
| 3.8 circRIMBP2 过表达可促进Ball-1 细胞凋亡 |
| 3.9 circRIMBP2 过表达可显着抑制MAPK信号通路中p-ERK1/2 表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 全基因组突变筛选方法概述 |
| 1.1.1 DNA诱变介导的全基因筛选方法 |
| 1.1.2 插入突变介导的全基因组筛选方法 |
| 1.1.3 RNAi介导的全基因组筛选方法 |
| 1.1.4 cDNA文库介导的全基因组筛选方法 |
| 1.2 CRISPR/Cas9全基因组筛选技术的研究进展 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9技术简介 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9筛选技术发展概述 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术在体外筛选中的应用 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9技术在体内筛选中的应用 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas9筛选技术与其它筛选技术的比较 |
| 1.3 规模化筛选的递送系统概述 |
| 1.3.1 逆转录病毒介导的递送系统 |
| 1.3.2 慢病毒介导的递送系统 |
| 1.3.3 腺相关病毒介导的递送系统 |
| 1.3.4 piggyBac转座子作为递送系统的应用潜力 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验结果分析软件和网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态细胞的制备与测定 |
| 2.2.2 质粒的提取 |
| 2.2.3 细胞系的建系、培养与转染 |
| 2.2.4 细胞克隆的核型鉴定、免疫荧光染色及AP染色 |
| 2.2.5 小鼠水动力尾静脉注射 |
| 2.2.6 细胞、组织基因组提取与打靶情况检测 |
| 2.2.7 Southern Blot检测 |
| 2.2.8 细胞、组织RNA提取与反转录及荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.9 蛋白的提取与Western Blot鉴定 |
| 2.2.10 肿瘤组织切片制备及H&E染色与免疫组化染色 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 PB介导的CRISPR/Cas9文库的创建 |
| 3.1.1 PB-CRISPR/Cas9基因打靶系统的构建及有效性验证 |
| 3.1.2 PB-CRISPR/Cas9文库的构建 |
| 3.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在小鼠胚胎干细胞中进行筛选 |
| 3.2.1 表达Cas9的Nanog-GFP报告系统的小鼠胚胎干细胞系的建立 |
| 3.2.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在分化培养条件中筛选获得多能性干细胞 |
| 3.2.3 候选多能性维持负调控因子的分析与验证 |
| 3.3 利用PB-CRISPR/Cas9文库在小鼠肝脏细胞中进行筛选 |
| 3.3.1 在小鼠肝脏中进行全基因筛选的可行性分析 |
| 3.3.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在活体小鼠肝脏中进行全基因组筛选 |
| 3.3.3 候选肝脏肿瘤抑制因子的分析与验证 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 PB-CRISPR/Cas9全基因组筛选文库系统的高效性 |
| 4.2 小鼠ES细胞多能性维持负调控因子的筛选及验证 |
| 4.3 小鼠肝脏肿瘤抑制因子的筛选及验证 |
| 4.4 PB-CRISPR/Cas9文库在其它组织器官中进行筛选的潜力 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 表S1 本论文中所用引物序列 |
| 表S2 18个肝脏肿瘤高通量测序结果分析 |
| 个人简历 |
（10）CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 RNA修饰研究进展 |
| 1.1 假尿苷修饰 |
| 1.2 肌苷(Ⅰ)修饰 |
| 1.3 N7-甲基鸟嘌呤(m7G)修饰 |
| 1.4 2'-O-甲基(Nm)修饰 |
| 1.5 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰 |
| 1.6 N1-甲基腺嘌呤(m1A)修饰 |
| 1.7 5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)修饰 |
| 1.8 5-甲基胞嘧啶(m5C)修饰 |
| 2 RNA m5C研究进展 |
| 2.1 RNA m5C的分布 |
| 2.2 RNA m5C的检测方法 |
| 2.3 RNA m5C甲基转移酶 |
| 3 NOP2/Sun RNA甲基转移酶NSUN2研究进展 |
| 3.1 NSUN2的表达与调控 |
| 3.2 NSUN2介导的RNA甲基化功能 |
| 4 CRISPR/Cas9基因编辑系统 |
| 4.1 CRISPR/Cas系统 |
| 4.2 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 4.3 CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用 |
| 5 本研究的目的意义和主要内容 |
| 5.1 本研究的目的意义 |
| 5.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9技术建立RNAm5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系及质粒载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 NSUN2基因gRNA靶点的设计及sgRNA载体构建与筛选 |
| 3.2 Donor载体的构建 |
| 3.3 HEK293和HepG2细胞药筛浓度测定 |
| 3.4 细胞转染 |
| 3.5 单克隆细胞株筛选 |
| 3.6 荧光定量PCR检测NSUN2 mRNA表达 |
| 3.7 筛选细胞株基因型鉴定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 成功构建针对人NSUN2基因的sgRNA |
| 4.2 同源重组Donor载体鉴定 |
| 4.3 确定HEK293和HepG2细胞抗生素筛选浓度 |
| 4.4 成功构建NSUN2基因去表达的HEK293细胞系 |
| 4.5 成功构建NSUN2基因去表达的HepG2细胞系 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 NSUN2基因敲除对HEK293细胞和HepG2细胞表型影响分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系与载体 |
| 2.2 试剂及耗材 |
| 2.3 实验器材 |
| 3 方法 |
| 3.1 NSUN2基因过表达载体构建 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 NSUN2基因过表达效率的验证 |
| 3.4 MTT法细胞活力检测 |
| 3.5 克隆形成试验 |
| 3.6 伤口愈合试验 |
| 3.7 流式细胞术检测细胞周期 |
| 3.8 Matrigel细胞侵袭试验 |
| 3.9 小管形成试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NSUN2基因敲除抑制HEK293细胞的增殖 |
| 4.2 NSUN2基因敲除抑制HEK293细胞的迁移 |
| 4.3 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞增殖 |
| 4.4 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的迁移 |
| 4.5 NSUN2基因敲除影响HepG2细胞周期 |
| 4.6 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的侵袭能力 |
| 4.7 NSUN2基因敲除抑制HepG2细胞的血管新生能力 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 转录组测序检测NSUN2基因敲除对HEK293细胞系和HepG2细胞系基因表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 转录组测序 |
| 3.2 数据分析 |
| 3.3 转录组测序结果的验证 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 RNA样品质量控制 |
| 4.2 测序数据与基因组比对结果 |
| 4.3 基因表达水平分布 |
| 4.4 RNA-Seq相关性 |
| 4.5 差异表达基因筛选 |
| 4.6 差异表达基因聚类分析 |
| 4.7 HEK293细胞差异表达基因GO富集分析 |
| 4.8 HEK293细胞差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.9 HepG2细胞差异表达基因功能富集分析 |
| 4.10 HepG2细胞差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 4.11 RNA-Seq结果验证 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除对RNA m5C修饰的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 细胞总RNA的提取 |
| 3.2 去除rRNA |
| 3.3 重亚硫酸盐转化RNA |
| 3.4 RNA亚硫酸盐转化效率检测 |
| 3.5 cDNA文库构建 |
| 3.6 cDNA文库质控 |
| 3.7 测序 |
| 3.8 数据分析 |
| 3.9 RNA BisSeq测序结果验证 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 RNA质检结果 |
| 4.2 RNA样本亚硫酸盐转化效果验证 |
| 4.3 文库质检结果 |
| 4.4 差异甲基化位点分析 |
| 4.5 HEK293细胞差异甲基化基因功能分析 |
| 4.6 HepG2细胞差异甲基化基因功能分析 |
| 4.7 BSP(Bisulfite sequencing PCR)法验证 RNA-BisSeq结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文总结、创新点和研究展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间研究成果 |
四、HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文参考文献）
- [1]禽呼肠孤病毒非结构蛋白p17的宿主互作蛋白筛选及PRPS2功能的初步研究[D]. 赵富熙. 扬州大学, 2021
- [2]急性B淋巴细胞白血病circRNA表达分析及XLOC＿011567与增殖、凋亡相关性的研究[D]. 周波. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [4]单细胞转录组混合测序研究[D]. 黄梦婷. 东南大学, 2020(01)
- [5]广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制研究[D]. 陈秀珍. 广州中医药大学, 2020(06)
- [6]文昌鱼连续胚胎发育时期中可变剪切的发现与功能探索[D]. 覃杨梅. 厦门大学, 2019(01)
- [7]GmCOL4、GmZTL1与顺式元件HSE响应高温高湿以及调控GmSBH1的研究[D]. 陈明. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]环状RNA circRIMBP2在急性B淋巴细胞白血病中的表达及功能研究[D]. 马跃. 中国医科大学, 2019(02)
- [9]PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用[D]. 齐晓兰. 中国农业大学, 2018(02)
- [10]CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究[D]. 孙振. 扬州大学, 2019