一、大肠杆菌不耐热肠毒素对狂犬病病毒减毒疫苗株粘膜免疫效应的增强作用（论文文献综述）
施金谷[1]（2013）在《大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究》文中研究指明口服免疫是一种简单而有效诱导粘膜免疫的免疫方式,但由于缺乏良好的运输系统和吸收系统,很大程度上限制了口服疫苗的发展。大肠毒素不耐热肠毒素B亚单位（LTB）是一个强有力的调节免疫的信号和载体分子,因而通常被作为佐剂应用于口服疫苗。为了研究LTB对罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫增强效果,本研究通过对已构建的LTB重组酵母进行诱导表达,探索重组LTB最佳表达时间并检测其安全性,并建立罗非鱼抗体检测间接ELISA方法,为罗非鱼抗体的检测奠定了基础,最后将LTB与链球菌口服疫苗联合口服免疫罗非鱼,研究LTB对罗非鱼的免疫增强效果,为链球菌口服疫苗免疫佐剂开发利用提供数据参考。本实验通过对已构建的重组LTB KM71毕赤酵母进行诱导表达以及LTB毒性实验,探讨重组LTB的最佳表达时间以及表达量,检测了LTB对罗非鱼的安全性。实验显示,重组LTB在毕赤酵母中得到有效表达,最佳的表达时间为96h,表达量为2.716mg/mL。LTB对罗非鱼在灌胃初期具有轻微刺激性,但能够作为罗非鱼肠道粘膜佐剂使用。在罗非鱼血清及粘膜抗体水平间接ELISA检测方法建立的实验中发现,罗非鱼血清抗体间接ELISA检测的最佳反应温度为22℃,抗原包被浓度为5.5μg/mL,待测血清、多抗的稀释度和酶标二抗的稀释度分别为1/400、1/2000和1/8000。在对LTB的免疫增强效果研究的试验中,以罗非鱼链球菌口服疫苗0.2×109cells/尾、0.2×108cells/尾和0.2×107cells/尾三个口服剂量水平以及LTB口服剂量1.68μg／尾、0.84μg／尾和0.17μg／尾3个处理水平设计联合疫苗,并通过口服免疫罗非鱼,评价LTB的免疫增强效果及联合疫苗相对保护率。结果表明,LTB能够促进血清以及肠道粘膜抗体水平,对链球菌口服疫苗有佐剂效应。当疫苗口服剂量为0.2×108cells/尾,LTB口服剂量为0.84μg／尾的组合时达到最佳免疫效果,该组合能在免疫后期稳定持续高效的提高血清和肠道粘膜抗体应答水平,并且使罗非鱼在免疫后第10d、20d和30d相对保护率分别达到65.00%、68.42%和64.71%。肠道粘膜抗体水平和LTB的含量成正比,但在免疫期内同一LTB含量实验组的抗体水平波动幅度较大。检测LTB对罗非鱼非特异性免疫效应的影响,发现LTB可显着提高溶菌酶和碱性磷酸酶水平,对酸性磷酸酶无显着影响,但对超氧化物歧化酶表现出抑制作用。实验结果表明,LTB虽然对罗非鱼灌胃前期具有微弱刺激性,但总体可提高鱼体的免疫力,与罗非鱼链球菌口服疫苗联合时,可明显提高50g～60g罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫效果,提高血清和肠道粘膜免疫水平,是一种具有潜力的口服疫苗免疫佐剂。
李丹丹[2]（2013）在《大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究》文中指出犊牛大肠杆菌性腹泻是牛场常发且危害严重的一种细菌性传染病，主要表现为肠炎或败血症，是新生犊牛死亡的主要病因之一，给养牛业带来巨大的经济损失。目前尚无有效预防该病的商品化疫苗，因此，研制有效的针对该病的疫苗对预防该病的发生具有重要意义。引起犊牛腹泻的大肠杆菌主要毒力因子有肠毒素（包括LT、ST）、志贺毒素和粘附素。LT和LTB具有很强的免疫原性并且具有免疫佐剂的功效，是近些年来疫苗研究的热点。志贺毒素引起的犊牛腹泻的死亡率最高，它有两个型，1型和2型，2型志贺毒素的毒性强于1型，是产志贺毒素大肠杆菌的重要毒力因子，其B亚基无毒且具有免疫原性。ST单独不具有免疫原性，而粘附素的抗原类型又过多，因此，将大肠杆菌不耐热肠毒素和志贺毒素作为疫苗抗原是研制犊牛大肠杆菌疫苗的主要策略。本研究旨在探索ltb和stx2b融合编码基因的构建，在原核系统中表达，以及表达蛋白诱导小鼠体液免疫的情况，为犊牛大肠杆菌疫苗的研究奠定技术基础和提供实验依据。本研究将PCR扩增出的ltb和stx2b基因用一段柔性linker序列连接后插入pMD18T simple载体中，经序列分析鉴定后，再通过酶切，连接，转化宿主菌Rossetta，分别构建了Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B和Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B融合基因原核表达系统。经表达条件优化和对表达产物分析，最终选择表达系统Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B进行后续研究。SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示，表达系统Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B所表达的重组蛋白量约占菌体蛋白的1/5。同时还构建了表达stx2b基因的原核表达系统Rossetta/pColdI-Stx2B。SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示，该重组蛋白同样获得了高效表达。随机将昆明鼠分为5组（A、B、C、D、E组），每组正常鼠、妊娠鼠各5只，E组为对照组。将重组蛋白LTB-Stx2B、重组蛋白Stx2B、重组大肠杆菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B灭活菌、重组大肠杆菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B灭活菌超声波裂解液与矿物油佐剂1:1混合，经腹腔免疫AD组正常鼠及妊娠鼠，免疫2次，间隔2周，对正常鼠、母鼠及仔鼠采血检测血清抗体。ELISA检测结果显示，重组蛋白LTB-Stx2B能够诱导免疫小鼠产生抗LTB和抗Stx2B的特异性抗体，二免疫后10d两种抗体滴度均达到1:10000以上，高于重组蛋白Stx2B免疫组及其他免疫组，并且产生的特异性抗体能够传递给子代小鼠。二免后10d分别对各组小鼠腹腔注射5LD50的LT和5LD50的Stx2进行体内中和试验，结果显示，AD组小鼠均获得了不同程度的针对LT或Stx2的保护作用，其中，以重组蛋白LTB-Stx2B免疫组小鼠获得的保护率最高（5/5健活）。用二免后各组高效价小鼠血清系列稀释后进行Stx2对Vero细胞的毒性的体外中和试验，结果显示，A组小鼠血清的中和效价为1:52，B组为1:11，C组为1:7，D组为1:9。本研究利用基因工程技术表达了重组蛋白LTB-Stx2B，实验证明该蛋白对实验动物具有良好的免原性和免疫保护性，为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗研究奠定了基础。
魏晓曼[3]（2013）在《猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株ΔVP8*蛋白免疫原性分析及其联合免疫佐剂研究》文中研究表明猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PRV）是导致仔猪发生病毒性腹泻的主要病原之一。仔猪轮状病毒腹泻危害我国养猪业,每年造成的经济损失巨大。现行疫苗在控制本病的发生与传播上效果不佳,因此,开发新型猪轮状病毒疫苗是兽医工作者义不容辞的责任。VP4是轮状病毒的主要抗原蛋白,决定了病毒的P型。它能和VP7一样独立地诱导中和抗体,其中VP4经胰酶裂解后形成的VP8*片段,含有VP4的主要中和性抗原表位,皆为线性且较为保守。理论上同一P型的轮状病毒疫苗可以诱导抗不同G型的异型免疫,而从各大洲腹泻仔猪身上分离到的轮状病毒大都是类Gottfried型（P[6]型）或者类OSU型（P[7]型）。所以我们基于轮状病毒P型的研究策略,并根据VP8*抗原表位图谱,克隆和表达猪轮状病毒Gottfried株（基因型G4P[6]）和SB-1A株（基因型G4P[7]）截短的VP8*基因（△VP8*,64-223位氨基酸）。同时分别向两种△VP8*基因的上游引入编码破伤风毒素T细胞表位P2（破伤风毒素的830844位氨基酸）的序列,原核克隆表达P2-△VP8*基因。将四种重组蛋白的可溶性部分纯化后分别与氢氧化铝佐剂混合,免疫6到8周龄雌性Balb/c小鼠,共进行三次免疫,中间间隔两周。用ELISA检测血清特异性抗体水平,比较四种蛋白的免疫原性,评价T细胞表位P2的免疫原性增强作用,以期筛选出效果最佳的猪轮状病毒亚单位疫苗候选抗原。经上述试验得到免疫原性最好的重组蛋白P2-SB-1A△VP8*后,我们研究了联合佐剂对其免疫效果的影响。利用重叠PCR的方法定点突变编码大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）第63位氨基酸的密码子,构建无毒突变体LTK63,并进行原核克隆表达及纯化。将不同的联合佐剂CpG ODN2006+LTK63+Al（OH）3、CpG ODN2006+Al（OH）3、LTK63+Al（OH）3与P2-SB-1A△VP8*一起免疫6到8周龄雌性Balb/c小鼠,三次免疫,中间间隔两周。ELISA检测血清中特异性抗体水平和亚类抗体IgG1与IgG2a,MTT法检测各组免疫后小鼠的脾脏中T淋巴细胞转化程度。所有检测指标显示,CpG ODN2006+Al（OH）3是最为有效的联合佐剂,该组小鼠的几何平均抗体滴度（GMT）高达1:55153.5,显着高于仅免疫P2-SB-1A△VP8*+Al（OH）3的对照组（1:8444.9）,P2-SB-1A△VP8*+CpG ODN2006+LTK63+Al（OH）3和P2-SB-1A△VP8*+LTK63+Al（OH）3实验组的GMT分别为1:14367.5和1:11403.5。且P2-SB-1A△VP8*+CpG ODN2006+Al（OH）3实验组小鼠血清中的亚类抗体以IgG2a为主,IgG2a/IgG1的比值为2.15,对照组仅为0.21,另两组约为1.0;该组小鼠脾脏中T淋巴细胞增殖刺激指数（SI）为2.65,显着高于对照组（1.503）,另两组在2.0左右。由此可见,联合佐剂CpG ODN2006+Al（OH）3能全面提高机体的体液免疫与细胞免疫水平,二者表现出明显的协同效应。
黄钧,施金谷,陈明,黄艳华,温华成,彭民毅,王瑞,梁万文[4]（2012）在《鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展》文中提出免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用,能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性,但其本身不具备抗原特性的物质。文章对鱼用口服疫苗免疫佐剂的作用机理以及霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）、细胞因子等几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂的应用情况进行综述,发现鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究应用过程中仍存在作用机理研究相对滞后、忽略肠道黏膜免疫机理特殊性、使用成本过高、安全性等问题,建议今后加强对鱼类肠道黏膜免疫机理以及口服疫苗免疫佐剂作用机理的研究,优化口服疫苗免疫佐剂的免疫剂量和程序,降低生产成本,研发出更为广泛、廉价的口服疫苗免疫佐剂,提高其安全性等,以促进水产养殖业的健康发展。
黄佳佳[5]（2012）在《大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达及其对粘膜免疫效果的影响》文中进行了进一步梳理不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin,LT）是由产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）产生的六聚体型蛋白,是引起人和动物腹泻的主要致病因子。因其具有很强的免疫原性以及能够辅助其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异性抗体,而被认为是良好的粘膜免疫佐剂,但因其具有较强的毒性而限制了LT在临床上的使用。因此,制备无毒而又保留佐剂活性的LT,将其开发为优秀的粘膜免疫佐剂,有着重要的医学价值和经济价值。为获得无毒且保留佐剂活性的LT蛋白,我们以产肠毒素大肠杆菌S462212株为材料,根据已发表的LT基因序列,设计了特异性引物,用重叠延伸PCR方法获对LT的A亚单位基因进行定点突变,成功将A亚单位第63位编码Ser的密码子（TCT）突变为编码Lys的密码子（AAA）,成功获得突变基因LTS63K,并将其克隆入原核表达载体pET-30a（+）中,在E.coli BL21中成功表达出约50KD的目的蛋白,与预期结果一致,表明重组菌pET-LTS63K构建成功,为研究其佐剂效应奠定了基础。相关研究表明,原核表达的CTLA-4胞外区具有靶向提呈抗原的功能,我们将LT突变蛋白与CTLA-4胞外区在大肠杆菌中融合表达以研究融合蛋白的免疫佐剂效应。将研究中构建的LT突变基因片段,克隆入重组载体pET-CTLA-4IgV,获得重组表达质粒pET-CTLA-LTS63K,将其转化BL21（DE3）大肠杆菌。经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示出预期约60KD的蛋白条带。Western-blotting结果显示,突变蛋白LTS63K和融合蛋白CTLA-LTS63K均能被LT抗血清识别,证明表达的重组蛋白具有较好的反应原性。为了研究突变体蛋白LTS63K与融合蛋白CTLA-LTS63K对灭活疫苗免疫效果的影响,用获得的蛋白溶液与禽流感灭活疫苗同时肌肉注射雏鸡。将160只7日龄健康非免疫雏鸡平均分为6组,第1、2组用不同剂量的LTS63K蛋白与疫苗同时免疫；第3、4组用不同剂量的CTLA-LTS63K融合蛋白与疫苗同时免疫；第5组只用疫苗免疫,不加蛋白；第6组为阴性对照组,不做任何处理。于首免后每隔7天采取血清样品和粘膜样品,分别测定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗体水平。结果显示,两种蛋白对灭活疫苗的佐剂效果不明显,与第5组检测结果无显着性差异。为了研究突变体蛋白LTS63K与融合蛋白CTLA-LTS63K对粘膜免疫的影响,我们用获得的蛋白溶液作为稀释液稀释IBDV弱毒疫苗,口服免疫雏鸡,3周龄加强免疫一次；将240只7日龄健康非免疫雏鸡平均分为8组,第1、2、3组的稀释液中含有不同剂量的LTS63K蛋白；第4、5、6组的稀释液中含有不同剂量的CTLA-LTS63K融合蛋白;第7组用生理盐水作为稀释液,不加蛋白；第8组为阴性对照组,不做任何处理。于首免后每隔7天采取血清样品和粘膜样品,分别测定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗体水、平结果显示,突变蛋白及融合蛋白通过粘膜免疫途径均能增强IBDV弱毒苗的免疫效果,提高血清IgG和粘膜IgA抗体水平。
郭恒[6]（2011）在《利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究》文中指出狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒（Rabies virus,RV）引起的可导致高致死率的危害严重的人兽共患病。我国人的狂犬病主要由患病犬咬伤或通过粘膜接触所致,对犬群的大规模免疫接种是控制狂犬病的最佳途径。目前我国使用的兽用狂犬病疫苗主要弱毒活疫苗及灭活细胞培养疫苗两种,前者在使用过程中存在毒力返祖的安全隐患,国际上对家养动物禁用狂犬病活疫苗;而后者主要依靠进口,供应量不足、价格昂贵,无法满足我国目前大规模免疫接种的需求。2010年我国农业部虽然批准首个灭活国产兽用狂犬病疫苗可以进行生产,但目前尚无价格低廉的产品上市。同时上述两种疫苗采用多次注射进行免疫,免疫程序繁冗,使用不便,限制在野生动物及犬群中的使用。沙门氏菌（Salmonella）血清型繁多,是人兽共患病原菌,其中鼠伤寒菌（Salmonella Typhimurium）对小鼠及犬类动物均易感。沙门氏菌为细胞内寄生菌,具有黏膜组织或抗原提呈细胞的亲嗜性,可经口服粘膜自然感染途径将重组基因直接呈送给抗原递呈细胞,有刺激抗原特异性体液和细胞免疫、诱导细胞凋亡的功能,含自身佐剂CpG基序,是最早用作活疫苗载体实验模型的工具菌之一,也是目前遗传背景最清楚、应用最广泛的活菌疫苗载体。减毒沙门氏菌携带异种抗原运送效率高、免疫方法简单、激发免疫应答全面,至今已介导40余种的病毒、细菌、寄生虫和与肿瘤治疗相关基因的表达。狂犬口服免疫具有简便、易行、群众易接受的特点,适合对犬群及野生动物的大规模免疫,口服免疫也是世界各国学者推崇的有效接种途径。狂犬病毒糖蛋白（glycoprotein,GP）是激发中和抗体的唯一有效抗原,而核蛋白（nucleoprotein,NP）可激发细胞免疫应答,促进中和抗体的产生。为此,本研究构建了以沙门氏菌为运载体携带狂犬病毒GP基因和NP基因的新型口服疫苗新型口服疫苗,进行了如下系列实验研究:1.为增强构建质粒的稳定性,PCR方法扩增pBR322克隆载体中rop基因调控片段定向插入pVAX1载体中,构建中低拷贝真核表达载体pR。Realtime PCR显示改造后的pR载体较pVAX1拷贝数降低约13倍。RT-PCR法扩增中国狂犬病毒人用疫苗株CTN-1的GP和NP基因,基因重组技术分别克隆至pVAX1载体中构建单基因表达载体pV-G和pV-N;重叠PCR法将破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin Fragment C,TTc）与GP基因串联,两基因间设（G4S）2柔性linker,构建双基因串联融合表达载体pV-GT和pR-GTTc。构建的2个串联表达载体转染BHK-21细胞,间接免疫荧光及Western blot检测到融合蛋白的表达。2.构建的pV-G、pV-N、pV-GT、pR-GT真核表达质粒电转化入鼠伤寒沙门氏菌phoP/phoQ疫苗株（简称PQ）中,分别构建重组沙门氏菌PQ-VG、PQ-VN、PQ-VGT和PQ-RGT。重组菌体外无抗生素下连传100代,PQ-RGT中质粒滞留率较PQ-VGT高18%。于第1、3、14天以1x1010CFU剂量重组菌口服免疫11-13g雌性昆明鼠,末次免疫35天后发现PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组可抵抗12 LD50的CVS-24脑内致死性攻击,小鼠的保护率为65%,明显优于PQ-VG、PQ-VGT、PQ-RGT的单一细菌免疫组（保护率分别为25.0%、33.3%和43.8%）及PQ-VGT、PQ-VN混合免疫组（53.3%）。所有接种PQ的对照鼠CVS-24脑内攻击后3-14天内均出现典型狂犬病症状并最终死亡。3.为增强外源蛋白在沙门氏菌中表达的稳定性,以原核低拷贝克隆载体pGB2为基础进行构建重组表达载体。选取GP中含多个线性表位的179-281aa肽段（命名为Gepi）化学合成沙门氏菌偏嗜性密码子优化后的肽段Gopt。克隆丁香假单胞菌的冰核蛋白的N端截短区（INPn）和沙门氏菌PQ的体内厌氧诱导启动子PnirB及强转录终止子序列rrnbT1T2,根据特异酶切位点的粘性末端体外按PnirB、INPn、Gopt和rrnbT1T2顺序连接构建重组表达载体pGnirB-I-Gopt及未进行密码子优化的重组载体pGnirB-I-Gepi。重组质粒经电转化转入PQ中并分别命名为PQ-IGO和PQ-IG。菌落印迹和间接免疫荧光显示重组菌可经厌氧诱导肽段的表达,并可将其展示于细菌表面。重组菌PQ-IGO用于PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组的第3次的prime-boost,小鼠保护率为75.0%,略低于商品化疫苗腹腔注射prime-boost加强组,优于之前的非prime-boost免疫组及未进行密码子优化组。4.重组菌联合免疫激发的抗狂犬病毒中和抗体、抗破伤风毒素及沙门氏菌IgG,细胞因子IL2、INFγ以及Treg调节T细胞和CD4+CD8+T细胞含量等被检测,结果表明三种质粒联合应用可有效诱发针对狂犬、破伤风毒素及沙门氏菌的多价体液和细胞免疫应答,并可对75%以上的小鼠产生保护。本实验成功构建了以减毒伤寒菌为运载体的兼顾破伤风梭菌及鼠伤寒沙门氏菌免疫防治的多价狂犬病口服疫苗的实验模型。我国犬数量庞大,种群增殖快,并且交易频繁。由于目前狂犬病流行的自然宿主还不十分清楚,野生动物狂犬病疫情病原流行病学调查数据还不详实,新型口服狂犬病疫苗的研发将对深化我国狂犬病免疫防治现状具有重要意义。本课题以减毒伤寒菌为运载体,为安全有效的适合犬、猫及野生动物使用的新型暴露前预防性口服疫苗的研究奠定了基础。国内相关研究多为病毒活载体疫苗及基于反向遗传技术的弱毒活疫苗,本研究的成功可为狂犬口服疫苗的研制提供一种成本更加低廉的备选方案。
赵飞骏[7]（2011）在《梅毒螺旋体膜蛋白DNA疫苗的优化及免疫策略的初步研究》文中研究指明梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）是人类性传播疾病（sexually transmitted disease, STD）梅毒的病原体。梅毒在STD中的致死性仅次于艾滋病,其不仅可严重损害成人人体的多个器官引起全身性损害,还可由母体经胎盘垂直传播给胎儿,引起胎儿全身性器官组织系统感染,导致早产、流产、死胎、畸胎或胎传梅毒,严重影响了出生人口质量。此外,梅毒与艾滋病的传播途径相同,还可大大增加感染、传播成人艾滋病和胎传艾滋病的危险性。尽管Tp的临床耐药株极其罕见,但近年来,梅毒发病率却居高不下,我国的梅毒感染率和发病率也呈直线上升趋势,近几年一直位于STD的前三位。因此,如何有效控制和预防梅毒,已成为全世界普遍关注的公共卫生问题,而制备出具有完全保护作用的梅毒疫苗则是其中的关键。目前,国内外对Tp疫苗成分的研究主要集中于Tp重组外膜蛋白。Tp外膜蛋白既在Tp毒力中具有重要作用,也是宿主保护性免疫的主要靶标。由于Gpd和Tp92外膜蛋白序列高度保守且与其它致病性密螺旋体有高度的同源性,以及其较强的免疫原性和保护性,均被认为是研究Tp疫苗的最佳候选蛋白之一。本研究是在我们首次完成Tp单基因DNA疫苗筛选构建及免疫活性初步研究工作的基础上,将具有显着免疫佐剂效应的IL-2基因插入已真核表达重组体pcDNA3.1（+）/Gpd中,融合构建多价DNA疫苗,用壳聚糖（CS）纳米颗粒包被后导入新西兰兔体内,利用CS纳米颗粒高效的基因转导能力及IL-2的佐剂效应诱导动物细胞表达免疫原性更强的融合蛋白,强化免疫应答；同时采用核酸疫苗初免、含CpG序列的寡脱氧核苷酸（CpGODN）-Tp膜蛋白黏膜免疫加强的疫苗接种策略,以期全面激发机体免疫系统,尤其黏膜免疫,建立高效抗Tp感染的动物模型,为研制人用的高效疫苗预防梅毒打下基础。目的：1.在筛选Tp外膜蛋白基因Gpd和Tp92的单基因核酸疫苗在新西兰兔体内免疫活性的基础上,进一步构建Tp Gpd-IL-2基因融合壳聚糖纳米核酸疫苗,证实该类疫苗能否有效转染动物细胞,表达融合蛋白,诱导机体产生特异性免疫应答；证实细胞因子佐剂hIL-2和CS纳米颗粒能否有效辅佐疫苗强化免疫应答。2.构建CpG ODN-Tp Gpd-IL-2重组膜蛋白黏膜疫苗；在上述基础上,应用核酸疫苗肌注初免-CpG ODN-蛋白黏膜疫苗加强免疫的接种策略,验证该策略能否全面激发机体免疫应答,特别是黏膜免疫应答。3.建立Tp感染的新西兰兔动物模型,确切评价核酸疫苗肌注初免-CpG ODN-蛋白黏膜疫苗加强免疫的接种策略的免疫保护效果,为最终建立能完全有效抗Tp感染的动物模型,研制人用的高效疫苗打下良好基础。方法：1. Tp Nichols的传代与基因组提取：将低温冻存兔睾丸室温解冻后剪碎置于无菌生理盐水,让睾丸内保存的Tp Nichols株复苏、释放,再接种活兔睾丸传代,恢复毒力及活性后用于Tp感染实验及TpDNA基因组提取。2.真核与原核表达重组体的构建：PCR钓取目的基因TpGpd、Tp92和hIL-2,与真核载体融合构建pcDNA3.1（+）/Gpd、 pcDNA3.1（+）/IL-2及pcDNA3.1（+）/Gpd-IL-2多价真核表达重组体；将目的基因IL-2与已成功构建的原核表达重组体（pET28a/Gpd）融合构建多价原核表达重组体（pET28a/Gpd-IL-2）;测序鉴定。3.真核与原核表达重组体的表达与鉴定：免疫印迹法鉴定pcD/TpGpd、pcD/Tp92、pcD/IL-2及pcD/Gpd-IL-2真核表达重组体在体外哺乳动物细胞内的表达；pET28a/TpGpd-IL-2原核表达重组体的蛋白表达、纯化、鉴定；将纯化的重组蛋白抗原免疫动物获取多抗。4. pcD/TpGpd和pcD/Tp92单基因核酸疫苗免疫活性与保护性研究：将实验用兔随机分为pcD/Tp92疫苗组、pcD/TpGpd疫苗组、pcD空质粒对照组和PBS对照组4个小组；肌肉多点注射免疫,每2w免疫1次,共免疫3次。并于初次免疫后第8w每组随机取3只兔无菌分离脾细胞培养,MTT法检测兔脾淋巴细胞增殖水平,ELISA试剂盒检测脾细胞培养上清IL-2及IFN-γ诱导水平,在免疫及感染期间不同时间点分别采用ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平；第10w各实验组兔皮下接种TpNichols标准株进行皮肤感染实验,在感染后0-60d期间每隔3d观察记录感染部位皮损Tp阳性率及溃疡病灶发生率。5.多基因疫苗的制备：制备CS纳米颗粒包裹核酸疫苗；制备CpG ODN-Gpd-IL-2蛋白黏膜疫苗。6.壳聚糖纳米包裹核酸疫苗在新西兰兔中免疫活性及保护性研究：实验用兔随机分为12组,6个疫苗组（pcD/Gpd-IL-2+CS和pcD/Gpd-IL-2, pcD/Gpd+pcD/IL-2+CS和pcD/Gpd+pcD/IL-2, pcD/Gpd+CS和pcD/Gpd）,6个对照组（pcD/IL-2+CS, pcD/IL-2, pcD+CS, pcD, CS和PBS组）,肌肉多点注射免疫,每隔2w加强免疫一次共3次,并于初次免疫后第8w每组随机取3只兔无菌分离脾细胞培养,MTT法检测兔脾淋巴细胞增殖水平,ELISA试剂盒检测脾细胞培养上清IL-2及IFN-γ诱导水平,在免疫及感染期间不同时间点分别采用ELISA检测免疫兔特异性TpGpd抗体产生水平；第10w各实验组兔皮下接种TpNichols标准株进行皮肤感染实验,在感染后0-60d期间每隔3d观察记录感染部位皮损Tp阳性率及溃疡病灶发生率。比较、综合分析各类疫苗诱导的免疫应答水平及免疫保护效果。7.核酸疫苗初免—蛋白黏膜疫苗加强免疫的接种策略评价：采用核酸疫苗肌注初免-CpGODN-蛋白黏膜疫苗加强免疫的疫苗接种策略,检测新西兰兔体内细胞免疫和体液免疫应答水平,评价免疫活性。对比评估核酸疫苗肌注初免—蛋白黏膜免疫加强的疫苗接种策略的抗Tp感染免疫保护效果。结果：1.成功复苏、传代Tp Nichols标准株并维持其良好的感染活性,可用于疫苗免疫后感染实验；成功制备Tp基因组DNA用于下一步研究。2.构建的真核重组质粒pcD/Gpd-IL-2、pcD/Gpd、pcD/IL-2和pcD/Tp92经酶切和测序鉴定证实插入片段为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致,均能在HeLa细胞内有效表达靶蛋白；构建的原核重组质粒pET28a/Gpd-IL-2能在Rosetta表达菌有效表达一个相对分子量（Mr）约60KD的融合蛋白。3.pcD/TpGpd和pcD/Tp92单基因疫苗均能在免疫兔体内诱生比对照组（pcDNA3.1（+）,PBS对照组）更高的抗TpGpd或Tp92特异性IgG抗体水平（P<0.001）,刺激更高的IL-2、IFN-γ细胞因子分泌（P<0.001）及更强的脾细胞增殖分化（P<0.001）。4.pcD/Gpd-IL-2疫苗组和pcD/Gpd+pcD/IL-2联合疫苗组均能在兔体内诱生比pcD/Gpd单基因疫苗组更高的TpGpd特异性抗体水平（P<0.05）,刺激更高的IL-2、IFN-γ细胞因子分泌（P<0.05）及更强的脾细胞增殖分化（P<0.05）。5.CS纳米颗粒对pcD/Gpd+pcD/IL-2联合疫苗组、pcD/Gpd-IL-2疫苗组及pcD/Gpd单基因疫苗的包裹未能显着促进相应疫苗组在兔体内诱生更高的的特异性抗体水平（P>0.05）,未能刺激更高的IL-2、IFN-γ细胞因子分泌（P>0.05）及更强的脾细胞增殖分化（P>0.05）。6.Tp的兔皮肤感染导致感染期内各对照组特异性抗体水平及脾细胞增殖分化较之感染前有着显着升高（P<0.05）,对各疫苗组有一定促进作用；IL-2基因佐剂对各Tp Gpd DNA疫苗在感染期兔体内特异性抗体水平及脾细胞增殖分化的长久促进及维持有显着作用,而CS纳米颗粒对各Tp Gpd DNA疫苗的包裹未能显着提高在感染期阶段兔体内特异性抗体水平及脾细胞增殖分化。7.各Tp Gpd DNA疫苗相比各对照组均能显着降低Tp感染部位皮损Tp阳性率及溃疡病灶形成率（P<0.001）,显示出较强的免疫保护效应；pcD/IL-2基因佐剂较之CS纳米颗粒更能增强pCD/TpGpd疫苗的免疫保护效果；两者联合使用可达到较之其它疫苗组更好的免疫效果。8.在各实验组兔背部皮肤8个位点皮内Tp感染后0-60d同比观察比较,用CS+pCD/Gpd+pcD/IL-2联合疫苗和pCD/Gpd+pcD/IL-2联合疫苗,CS+pcD/Gpd-IL-2疫苗和pcD/Gpd-IL-2疫苗免疫兔后感染位点皮损红肿相对其它实验组直径最小,溃疡形成率最少,也最早愈合（42-45d）,各组间差异不显着；PcD/Gpd和CS+pcD/Gpd疫苗组兔后感染位点皮损皮损红肿直径同比中等大小,两组间差异不显着；各对照组（CS+pcD/IL-2,pcD/IL-2,CS+pcD, pcD, CS+PBS,PBS对照组）感染位点皮损红肿直径最大,溃疡病灶形成数最多,也最晚愈合（>60d）。9.采用pcD/Gpd-IL-2疫苗肌注初免,CpGODN+Gpd-IL-2蛋白鼻饲加强免疫的接种策略既能刺激较强的体液和细胞免疫效应,与pcD/Gpd-IL-2疫苗肌注免疫组无显着差异,还能刺激较高的黏膜免疫效应,导致最低Tp感染部位皮损Tp阳性率（0%）及溃疡病灶形成率（3.33%）从而达到更有效地保护作用。结论：1.Tp92和TpGpd单基因DNA疫苗组经肌肉注射免疫新西兰兔均可诱生较强的体液免疫和细胞免疫应答,产生较好的保护作用。2.IL-2基因与Tp Gpd抗原基因无论是融合表达还是非融合表达均能显着增强TpGpd单基因疫苗的免疫效应和免疫保护作用。3.CS纳米颗粒包裹Tp Gpd DNA疫苗对疫苗的体液及细胞免疫效应及抗Tp皮肤感染有一定促进作用,但效果不显着。而CS纳米颗粒包裹加上IL-2基因佐剂的联合应用则能刺激pcD/Gpd疫苗产生更强的免疫效应及更好的抗Tp皮肤感染效果。4.采用pcD/Gpd-IL-2疫苗肌注初免,CpGODN+Gpd-IL-2蛋白鼻饲加强免疫的接种策略,既能刺激机体产生较强的体液和细胞免疫效应,还能刺激较强的黏膜免疫效应,激发更有效的免疫保护作用。
刘娟[8]（2011）在《减毒沙门氏菌运载重组G-LTB狂犬疫苗口服免疫小鼠的研究》文中认为狂犬病毒G基因能够表达分子量为67 kd的由524个氨基酸组成的糖蛋白,糖蛋白是唯一诱导机体产生中和抗体和保护性免疫应答的主要结构蛋白,其免疫作用与全病毒疫苗相当。膜外区决定狂犬病毒糖蛋白的抗原性、组织亲嗜性及毒力。它既是有效的保护性抗原,也能诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫。热不稳定大肠杆菌肠毒素（LT）由一个A亚单位和一个经5个非共价键连接形成的五聚体B亚单位构成。研究表明,LTB是一种良好的黏膜免疫佐剂,具有很强的免疫调节作用,当与其他抗原共刺激机体后,LTB可促使机体产生特异的针对共刺激抗原的抗体而表现出佐剂活性。近年来,诸多研究已证实鼠伤寒沙门氏菌可作为细菌,病毒,寄生虫和肿瘤疫苗抗原的理想载体,其所携带外源基因能够高效表达并能全面激发机体的体液与细胞免疫。因此,以鼠伤寒沙门氏菌为基础的载体在疫苗研究领域备受国内外众多学者的关注。本研究利用生物信息学软件对狂犬病毒糖蛋白基因以及热不稳定肠毒素B亚单位基因进行生物信息学分析。从GenBank调取G和LTB基因序列并根据Oligo-6设计2对引物,以pMD-G和pMD-LTB为模板,通过PCR的方法分别扩增G-linker-片段,-linker-LTB片段,然后又以其PCR产物为模板,采用重叠延伸PCR的方法扩增出G-LTB的融合基因,然后将该融合基因经T-A连接反应连接到pMD18-T克隆载体上。质粒pMD-G-LTB和pVAX1、pVAX1-ori载体经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,将所获得的G-LTB融合基因和载体经T4DNA连接酶连接。经PCR、酶切鉴定结果正确,测序鉴定表明,外源基因核酸序列没有发生变异,和Genbank上公布的基因序列一致。将获得的重组质粒pVAX1-G-LTB和pVAX1-ori-G-LTB转化到大肠杆菌JM109中,质粒提取,转染BHK-21细胞中。培养48h后,进行间接免疫荧光检测分析,结果表明,真核表达质粒在BHK-21中表达了狂犬病病毒G-LTB融合蛋白。Western blot检测可发现一条68.8kd左右的目的带,证明了本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-G-LTB和pVAX 1-ori-G-LTB载体。为了进一步检测G-LTB融合基因的免疫原性,将pVAX1, pVAX1-G, pVAX-1-G-LTB, pVAX1-ori-G-LTB电转化减毒沙门氏菌突变株phoP/phoQ中,构建的重组株,均以1010 CFU的剂量口服免疫6-8周龄的雌性BALB/C小鼠。间隔10天免疫一次,共免疫两次。狂犬病毒IgG抗体检测实验表明phoP/phoQ（pVAX1-G-LTB）和p-hoP/phoQ（pVAX1-ori-G-LTB）免疫组的抗体水平明显高于控制组。中和抗体检测表明抗体水平大于0.5IU/mL,而对照组和PBS组均低于0.5IU/mL。动物保护性试验表明phoP/phoQ（pVAX1-G-LTB）和phoP/phoQ（pVAX1-ori-G-LTB）组分别达到了50%、60%的保护率。IL-2水平检测结果同上,统计学分析差异明显。本研究结果表明,以减毒沙门氏菌为载体运载G-LTB基因的口服疫苗能诱导小鼠产生抗狂犬病毒的体液和细胞免疫应答。同肌肉注射或基因枪等免疫方式相比口服疫苗省时、方便、价廉、易于群体免疫,是研制低成本、实用化口服DNA疫苗的一条新途径。因此本研究将为进一步研发出基于粘膜免疫途径的新型狂犬口服疫苗奠定了基础。
张德庆[9]（2011）在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究表明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
陈东强[10]（2009）在《猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析》文中研究指明猪瘟病毒是通过粘膜—消化道和呼吸道途径感染动物体,因此如果通过局部粘膜接种疫苗,则可利用抗原与粘膜受体结合的占位作用,有效阻断野毒经粘膜途径感染,达到事半功倍的免疫预防效果。本研究以现有猪瘟疫苗为基础,通过与粘膜佐剂配合,探讨猪瘟疫苗经粘膜途径免疫接种的可行性。本研究通过重组菌株发酵,获得了大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白LTKG、 LTRG.利用亲和层析法纯化重组蛋白,经BCA方法定量,蛋白浓度分别为：750μg/ml和660μg/ml。猪瘟脾淋巴苗分别与LTKG、LTRG蛋白佐剂混合,采用滴鼻、灌胃/口服、肌注三种途径免疫小鼠,间隔10-15天进行二免、三免。每次免疫后,采血,收集鼻洗液和粪便。经间接ELISA检测血清抗体IgG及局部粘膜抗体IgA。结果显示,三免前滴鼻组和灌胃组之间IgG水平相当,无显着差异（P>0.05）,但都低于肌注组；三免后,LTRG滴鼻免疫组和灌胃免疫组小鼠血清抗体IgG高于其它组,且高于疫苗肌肉注射组,LTRG滴鼻免疫组与疫苗滴鼻免疫组差异显着（0.01<P<0.05）。局部粘膜抗体IgA检测结果显示,三免后灌胃途径免疫的小鼠各组IgA均高于其他各组,且疫苗+LTRG灌胃、疫苗+LTKG灌胃小鼠IgA显着高于滴鼻免疫组小鼠（P<0.01）,同时显着高于肌注疫苗组（P<0.01）,即疫苗与佐剂LTRG、LTKG共免疫组获得了最佳局部粘膜免疫效果。猪瘟脾淋巴苗分别与LTKG、LTRG蛋白佐剂混合,通过滴鼻、灌胃/口服、肌注三种途径免疫仔猪,间隔10-15天二免、三免。采血,收集鼻洗液和粪便。经间接ELISA检测血清抗体IgG及局部粘膜抗体IgA。整个免疫过程中,血清IgG一直保持较高的抗体水平。三免后14天,口服疫苗+LTKG的猪血清抗体IgG显着高于疫苗经肌注和滴鼻免疫的猪（0.01<P<0.05）；三免后28天,口服疫苗+LTKG组IgG水平最高。三免后局部粘膜抗体IgA水平,用疫苗+LTRG.疫苗+LTKG经滴鼻、口服免疫组显着高于肌注疫苗组（0.01<P<0.05）,其中滴鼻疫苗+LTKG组IgA水平最高,与疫苗滴鼻免疫组显着差异（0.01<P<0.05）。采用MTT法分析猪外周血T淋巴细胞增殖情况,各试验组均检测到一定程度的淋巴细胞增殖活化,其中疫苗+LTKG滴鼻免疫组T淋巴细胞的增殖反应强于疫苗滴鼻组；疫苗+LTKG口服组强于疫苗口服组,且对淋巴细胞增殖作用滴鼻免疫途径较口服免疫途径好。上述试验结果表明,猪瘟脾淋巴苗分别与LTRG和LTKG粘膜佐剂经粘膜免疫途径共免疫小鼠、猪,均可诱导机体产生较好的体液免疫和细胞免疫反应,以及局部粘膜免疫反应。尤其是粘膜分泌型抗体的产生,为在局部中和野毒感染提供了保护屏障,能更有效发挥机体免疫预防机能。
二、大肠杆菌不耐热肠毒素对狂犬病病毒减毒疫苗株粘膜免疫效应的增强作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌不耐热肠毒素对狂犬病病毒减毒疫苗株粘膜免疫效应的增强作用（论文提纲范文）
（1）大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 人用口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.2 兽用口服疫苗的研究进展 |
| 1.1.3 水产口服免疫研究进展 |
| 1.2 水产口服免疫佐剂 |
| 1.2.1 口服疫苗免疫佐剂作用机理 |
| 1.2.2 几种主要的水产口服免疫佐剂 |
| 1.2.3 细胞因子 |
| 1.2.4 其他口服免疫佐剂 |
| 1.3 LTB的研究进展 |
| 1.3.1 LT的结构和组成 |
| 1.3.2 LT的免疫原性及机理 |
| 1.3.3 LTB的佐剂作用 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化及其毒性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂及材料 |
| 2.1.5 主要试剂及培养基的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化 |
| 2.2.2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的毒性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组LTB蛋白的最佳表达时间 |
| 2.3.2 重组LTB的纯化浓缩结果 |
| 2.3.3 LTB的毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 LTB的表达 |
| 2.4.2 LTB的毒性 |
| 3 罗非鱼抗体检测间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验鱼 |
| 3.1.2 细菌 |
| 3.1.3 疫苗 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂及材料 |
| 3.1.6 主要溶液的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 罗非鱼IgM的纯化及多克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 罗非鱼抗体间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 提纯后IgM的浓度 |
| 3.3.2 罗非鱼提纯IgM SDS-PAGE电泳以及Westen Blotting结果 |
| 3.3.3 抗原浓度测定结果 |
| 3.3.4 最适反应温度 |
| 3.3.5 抗原最适包被时间 |
| 3.3.6 抗原及待测血清浓度的最佳稀释度 |
| 3.3.7 兔抗罗非鱼及酶标二抗的最佳稀释度 |
| 3.3.8 粘膜抗体检测抗体检测条件的优化 |
| 3.3.9 最终ELISA优化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于罗非鱼IgM的提纯 |
| 3.4.2 ELISA方法的建立 |
| 4 LTB对罗非鱼链球菌疫苗的免疫增强效应研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验鱼 |
| 4.1.2 LTB |
| 4.1.3 联合疫苗的制作 |
| 4.1.4 细菌 |
| 4.1.5 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 罗非鱼的免疫 |
| 4.2.2 免疫保护率的检测 |
| 4.2.3 血清及粘膜抗体采集及检测 |
| 4.2.4 血清非特异性免疫指标检测 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫保护率结果 |
| 4.3.2 血清抗体检测结果 |
| 4.3.3 肠道粘膜抗体检测结果 |
| 4.3.4 溶菌酶活力检测结果 |
| 4.3.5 LTB对超氧化物歧化酶(SOD)的影响 |
| 4.3.6 LTB对酸性磷酸酶(ACP)的影响 |
| 4.3.7 LTB对碱性磷酸酶(AKP)的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 LTB的佐剂活性 |
| 4.4.2 关于LTB的非特异性免疫效应研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犊牛腹泻概述 |
| 1.1.1 病毒性腹泻 |
| 1.1.2 细菌性腹泻 |
| 1.1.3 寄生虫性腹泻 |
| 1.2 犊牛大肠杆菌性腹泻 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.2.3 临床症状及病理变化 |
| 1.2.4 防治 |
| 1.3 大肠杆菌毒力因子 |
| 1.3.1 粘附素 |
| 1.3.2 肠毒素 |
| 1.3.3 志贺毒素 |
| 1.4 大肠杆菌疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 核酸疫苗 |
| 1.4.4 活载体疫苗 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ltb 与 stx2b 融合基因的构建 |
| 2.2.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达与鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白纯化 |
| 2.2.5 实验动物分组及免疫 |
| 2.2.6 免疫抗体检测 |
| 2.2.7 体内中和试验 |
| 2.2.8 体外中和试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ltb-stx2b 融合基因的构建 |
| 3.1.1 ltb 基因的扩增 |
| 3.1.2 stx2b 基因的扩增 |
| 3.1.3 ltb-stx2b 基因扩增 |
| 3.1.4 ltb-stx2b 重组基因序列的测定 |
| 3.2 重组蛋白 LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.2.1 重组 E.coli Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.2.2 重组 E.coli Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B 的表达 |
| 3.3 重组蛋白 Stx2B 的表达与鉴定 |
| 3.3.1 stx2b 基因的扩增 |
| 3.3.2 stx2b 重组基因序列的测定 |
| 3.3.3 重组表达质粒 pCold I-Stx2B 的鉴定 |
| 3.3.4 重组 E.coli Rosetta/pCold-I-Stx2B 的表达与鉴定 |
| 3.4 免疫原的制备 |
| 3.5 免疫抗体的检测 |
| 3.6 体内中和试验 |
| 3.6.1 LT 和 Stx2 对小鼠的 LD50 的测定 |
| 3.6.2 LT 的小鼠体内中和试验 |
| 3.6.3 Stx2 的体内中和试验 |
| 3.7 体外中和试验 |
| 3.7.1 Stx2 对 Vero 细胞的毒性作用 |
| 3.7.2 Stx2 对 Vero 细胞 CD50 测定 |
| 3.7.3 Stx2 的中和效价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合 PCR 技术 |
| 4.2 不同免疫原的免疫效力评价 |
| 4.3 初乳对新生犊牛的重要性 |
| 4.4 亚单位疫苗在牛病上的应用研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株ΔVP8*蛋白免疫原性分析及其联合免疫佐剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪轮状病毒感染概述 |
| 1.2 轮状病毒的结构和主要抗原蛋白 |
| 1.3 轮状病毒疫苗的研究进展 |
| 1.4 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）作为黏膜免疫佐剂的研究进展 |
| 1.5 CpG ODN的研究进展 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 第二章 猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株△VP8*基因的原核表达、蛋白纯化及动物免疫试验 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 联合免疫佐剂对猪轮状病毒△VP8*蛋白免疫效果的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（4）鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 鱼类口服疫苗免疫佐剂作用机理 |
| 2 几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂 |
| 2.1 霍乱毒素（CT) |
| 2.2 大肠杆菌不耐热肠毒素（LT) |
| 2.3 细胞因子 |
| 2.4 其他口服疫苗免疫佐剂 |
| 3 展望 |
（5）大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达及其对粘膜免疫效果的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 大肠杆菌概述 |
| 2. LT的结构与性质 |
| 3. LT的粘膜免疫研究进展 |
| 4. LT突变体及其研究进展 |
| 研究一：大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 研究二：LT突变蛋白与鸡CTLA-4胞外区的融合表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 研究三：LT突变蛋白及其融合蛋白对灭活疫苗免疫效果的影响 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 研究四：LT突变蛋白及其融合蛋白对弱毒疫苗免疫效果的影响 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病毒和狂犬病 |
| 1.1 病毒结构 |
| 1.2 病原学特点 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 发病机理 |
| 1.5 狂犬病毒的生活史 |
| 1.6 宿主细胞对狂犬病毒感染的应答 |
| 1.7 结语 |
| 第2章 狂犬病疫苗的研究进展 |
| 2.1 疫苗生产使用毒株简介 |
| 2.2 人用疫苗发展概况 |
| 2.3 兽用疫苗发展概况 |
| 2.4 新型狂犬病实验室疫苗模型研究进展 |
| 2.5 结语 |
| 第3章 沙门氏菌活载体疫苗研究进展 |
| 3.1 基于沙门氏菌的疫苗诱发保护性免疫应答的方法 |
| 3.2 沙门氏菌作为异源抗原的运载体研究进展 |
| 3.3 沙门氏菌作为DNA 疫苗运载体研究进展 |
| 3.4 沙门氏菌作为高级免疫调节单元研究进展 |
| 3.5 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 狂犬CTN 株抗原基因的克隆及真核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 重组沙门氏菌的构建及免疫组合方式的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第3章 GP 线性表位肽段表面展示载体的构建及效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 异源PRIME-BOOST 免疫策略的评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
（7）梅毒螺旋体膜蛋白DNA疫苗的优化及免疫策略的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语英文索引 |
| 第一章 梅毒螺旋体Nichols标准株的复苏、传代及TpDNA基因组的制备 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法与步骤 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 梅毒螺旋体膜蛋白Tp92、TpGpd核酸疫苗的构建及其免疫保护性的初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 IL-2基因佐剂增强梅毒螺旋体TpGpd核酸疫苗的免疫活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 壳聚糖纳米包裹强化IL-2与TpGpd核酸疫苗联合免疫减轻兔梅毒感染模型病损发展的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 CpG ODN增强pcD/Gpd-IL-2核酸疫苗诱导的粘膜免疫效应研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（8）减毒沙门氏菌运载重组G-LTB狂犬疫苗口服免疫小鼠的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病口服疫苗研究进展 |
| 1.1 口服狂犬病毒疫苗毒株 |
| 1.2 减毒活疫苗 |
| 1.3 转基因植物口服疫苗 |
| 1.4 重组活载体疫苗 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 减毒活细菌载体的研究进展 |
| 2.1 细菌作为抗原运载系统 |
| 2.2 细菌介导的异源抗原的运载 |
| 2.3 细菌介导的DNA运载 |
| 2.4 减毒细菌疫苗载体 |
| 2.5 人使用的候选活细菌载体 |
| 2.6 鼠伤寒沙门氏菌为口服DNA基因疫苗运载体的优化 |
| 2.7 沙门氏菌运载可在生物体内扩增的质粒 |
| 2.8 沙门氏菌为基因表达的体内远程控制 |
| 2.9 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 减毒沙门氏菌运载的RV G-LTB双基因口服DNA疫苗的构建与鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组沙门氏菌免疫效力及动物保护性评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 核酸疫苗的构成 |
| 1.1.1.1 抗原编码基因 |
| 1.1.1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.1.2 核酸疫苗的分类 |
| 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制 |
| 1.1.4 核酸疫苗的免疫 |
| 1.1.4.1 靶细胞的选择 |
| 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理 |
| 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量 |
| 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择 |
| 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂 |
| 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂 |
| 1.1.4.5.3 补体佐剂 |
| 1.1.4.5.4 免疫刺激序列( |
| 1.1.4.5.5 霍乱毒素(choleratoxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素( |
| 1.1.4.5.6 蛋白转换域( |
| 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用 |
| 1.1.5 核酸疫苗的应用 |
| 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗 |
| 1.1.5.2 细菌核酸疫苗 |
| 1.1.5.3 病毒核酸疫苗 |
| 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望 |
| 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展 |
| 1.2.1 补体系统的组成 |
| 1.2.1.1 补体固有成分 |
| 1.2.1.2 补体调节蛋白 |
| 1.2.1.3 补体受体 |
| 1.2.2 补体的激活 |
| 1.2.2.1 经典激活途径 |
| 1.2.2.2 旁路途径 |
| 1.2.2.3 凝集素途径 |
| 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1.2.3.1 C3d 的产生 |
| 1.2.3.2 C3d 的分子结构 |
| 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2 |
| 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点 |
| 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法 |
| 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联 |
| 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联 |
| 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用 |
| 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响 |
| 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响 |
| 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响 |
| 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用 |
| 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响 |
| 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈 |
| 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟 |
| 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达 |
| 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| 1.2.7 不同动物C3d 的研究 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性 |
| 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构 |
| 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质 |
| 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构 |
| 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白 |
| 1.3.2 PRRSV 的免疫特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展 |
| 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4.2 抗原检测方法 |
| 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断 |
| 1.3.4.4 血清学诊断 |
| 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展 |
| 1.3.5.1 核酸疫苗 |
| 1.3.5.2 重组多肽疫苗 |
| 1.3.5.3 活载体疫苗 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液及配制 |
| 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆 |
| 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建 |
| 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序 |
| 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析 |
| 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n(n=2，4，6)的构建 |
| 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增 |
| 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.3.3 数据处理和分析 |
| 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建 |
| 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.4.4 数据处理和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果 |
| 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列 |
| 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析 |
| 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆 |
| 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 3.3.1 GP5 表达结果 |
| 3.3.2 安全性检验结果 |
| 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.3.3.1 抗体水平检测结果 |
| 3.3.3.2 中和抗体测定结果 |
| 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果 |
| 3.3.3.4 IL-4 含量的测定 |
| 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 invH 表达结果 |
| 3.4.3 安全性检验结果 |
| 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.4.4.1 invH 抗体水平结果 |
| 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量 |
| 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆 |
| 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建 |
| 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义 |
| 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（10）猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 猪瘟疫苗的研究进展 |
| 1 猪瘟病毒的概述 |
| 2 猪瘟疫苗 |
| 3 猪瘟新型疫苗制剂研发的必要性 |
| 参考文献 |
| 第二章 大肠杆菌热敏性肠毒素作为粘膜佐剂的研究进展 |
| 1 LT的佐剂功能 |
| 2 LT突变体的研究 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 大肠杆菌热敏性肠毒素突变体发酵表达及纯化 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 猪瘟疫苗与LT突变体免疫小鼠试验 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 猪瘟疫苗与LT突变体免疫猪试验 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、大肠杆菌不耐热肠毒素对狂犬病病毒减毒疫苗株粘膜免疫效应的增强作用（论文参考文献）
- [1]大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究[D]. 施金谷. 广西大学, 2013(03)
- [2]大肠杆菌LTB-Stx2B融合蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究[D]. 李丹丹. 东北农业大学, 2013(S1)
- [3]猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株ΔVP8*蛋白免疫原性分析及其联合免疫佐剂研究[D]. 魏晓曼. 黑龙江八一农垦大学, 2013(05)
- [4]鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展[J]. 黄钧,施金谷,陈明,黄艳华,温华成,彭民毅,王瑞,梁万文. 南方农业学报, 2012(06)
- [5]大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达及其对粘膜免疫效果的影响[D]. 黄佳佳. 扬州大学, 2012(01)
- [6]利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究[D]. 郭恒. 吉林大学, 2011(05)
- [7]梅毒螺旋体膜蛋白DNA疫苗的优化及免疫策略的初步研究[D]. 赵飞骏. 中南大学, 2011(12)
- [8]减毒沙门氏菌运载重组G-LTB狂犬疫苗口服免疫小鼠的研究[D]. 刘娟. 吉林大学, 2011(09)
- [9]C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学, 2011(08)
- [10]猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析[D]. 陈东强. 南京农业大学, 2009(06)