一、应用ELISPOT试验测定重组卡介苗诱导的T细胞应答（论文文献综述）
岳涛涛[1]（2021）在《旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究》文中研究表明肺癌是当前死亡率最高的癌症,发病率、死亡率持续上升,发病年龄逐渐年轻化。目前,肺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物免疫疗法。生物免疫疗法主要包括抗体疗法、细胞疗法和肿瘤疫苗。研究发现细菌活载体疫苗具有明显的抗肿瘤效应,其中乳酸菌是益生菌,具有免疫调节能力和一定的抗肿瘤活性,已有研究表明乳酸菌可作为疫苗载体用于宫颈癌的防治。近年来,人们发现旋毛虫可抑制骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的生长。本实验室前期发现旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原sHSPs抗血清具有良好的抗肺癌作用。因此,本试验构建相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌,研究其对Lewis肺癌的作用,以期为肿瘤防治提供新思路,并为肿瘤疫苗的研发及应用提供实验数据。旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建扩增出sHSPs基因,连接真核质粒pValac,转染293T细胞验证表达,将验证后的重组质粒转化重组侵入型植物乳杆菌NC8/FnBPA,筛选出阳性克隆命名为NC8-sHSPs。对重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性、黏附、侵袭、定植能力及安全性进行检测。结果表明成功扩增出相关抗原基因sHSPs,构建的重组质粒pValac-sHSPs在真核细胞内可以表达。生长特性分析表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的生长特性无明显改变,能以活菌的形式通过人工胃液,并可在人工肠液中繁殖。定植试验表明NC8-sHSPs在体外可黏附、侵入小鼠mode-k细胞,在小肠内也可定植。安全性检测表明NC8-sHSPs对mode-k细胞增殖无明显影响,体内、外均未引起IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子的过量释放,也未引起小鼠体重的明显改变和组织器官的明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用首先经口免疫1×109 cfu NC8-sHSPs,二免后7 d皮下注射2×106个Lewis肺癌细胞荷瘤,荷瘤后14 d,处死小鼠,剥离肿瘤,计算抑瘤率。通过ELISA和流式细胞术检测免疫学指标。CCK-8、LDH试验研究体外重组sHSPs对脾淋巴细胞增殖的影响及诱导CTL杀伤Lewis肺癌细胞的能力。最后对病理组织学损伤进行观察。结果表明重组植物乳杆菌NC8-sHSPs可明显抑制Lewis肺癌生长,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为62.36%和68.37%。免疫学检测发现重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,增加CD8+T淋巴细胞的数量,表明免疫NC8-sHSPs可激活宿主的体液免疫,增强细胞免疫和黏膜免疫抑制Lewis肺癌的生长。淋巴细胞增殖试验表明重组sHSPs可促进小鼠脾淋巴细胞增殖,联合IL-2可诱导产生直接杀伤Lewis肺癌细胞的CTL。免疫组化表明肿瘤内PCNA的表达降低,病理组织学观察未见明显损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗作用首先皮下注射2×106 Lewis肺癌细胞建立荷瘤小鼠模型,然后用1×109 cfu NC8-sHSPs连续治疗15 d,治疗结束剥离肿瘤,计算抑瘤率。使用ELISA检测免疫学指标,最后对组织器官进行HE染色观察病理组织学损伤。结果表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗可抑制Lewis肺癌生长,延长荷瘤小鼠生存时间,平均肿瘤体积和重量抑制率分别为40.76%和44.22%。免疫学检测结果表明重组植物乳杆菌可诱导sHSPs特异性IgG,提高血清中IL-12、TNF-α、IFN-γ、总sIgA以及肠道灌洗液中总sIgA的水平,表明重组植物乳杆菌治疗可诱导体液免疫,增强黏膜免疫和细胞免疫杀伤Lewis肺癌。组织器官HE染色表明重组植物乳杆菌NC 8-sHSPs治疗后未出现明显的病理损伤。
傅羽佳[2]（2021）在《PD-1与TIGIT分子对结核特异性IFN-γ分泌影响研究》文中进行了进一步梳理对获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染者的活动性结核感染诊断目前仍是一个挑战。伽马干扰素释放实验（IGRA）是一种检测结核分枝杆菌（Mtb）感染的一种免疫学检测方法,可以有效对Mtb单感染者进行检测。TB特异性IFN-γELISPOT实验是伽马干扰素释放实验的一种检测方法,但该方法检测HIV合并活动性结核感染者（HIV/a TB）的检测灵敏性显着下降,从而导致该方法无法有效应用于HIV感染者的活动性结核感染的诊断。发表的数据表明在HIV单感染或a TB单感染者外周血单核细胞（PBMC）的T细胞表面上调表达的免疫检查点分子PD-1、LAG3及TIGIT等对损伤的HIV或TB特异性细胞免疫反应有所贡献。在本研究中我们研究免疫检查点PD-1和TIGIT对TB特异性IFN-γELISPOT实验检测TB单感染和HIV/a TB共感染者检测灵敏性的影响。为了有效体评价PD-1和TIGIT对TB特异性IFN-γ分泌的影响,本研究首先利用微米磁珠建立了一种快速、灵敏、经济地检测PD-1和TIGIT抑制剂（或称为阻断性抗体）阻断活性的方法。该方法在评价TIGIT抑制剂活性时与标准的以稳定表达TIGIT的细胞为基础的配体结合检测法相比较检测灵敏性提高两倍,且对于两个TIGIT抑制剂的相对抑制活性与细胞配体结合检测法基本完全相同;该方法在评价PD-1抑制剂活性时对于纳武抗体（Nivolumab）的检测灵敏性比发表的各种检测方法相比检测灵敏性至少提高8倍。同时该方法可以在90分钟以内以相对于功能ELISA方法1/10试剂的用量快速、经济对完成对TIGIT和PD-1抑制剂阻断活性的检测。通过该方法我们从两个TIGIT抑制剂和两个PD-1抑制剂中鉴定出TIGIT抑制剂A15153G和PD-1抑制剂纳武抗体具有最强的TIGIT和PD-1抑制作用。在分PD-1和TIGIT对TB单感染者和HIV/TB合并感染者结核特异性IFN-γ分泌影响时发现与健康人群相比,PD-1和TIGIT在TB单感染者和HIV/TB合并感染者外周血T细胞表面显着上调表达。且HIV/a TB共感染者相对于TB单感染者相比,PD-1和TIGIT均表现出进一步上调表达。免疫酶联斑点实验中,加入经前面实验筛选出的相对较强阻断活性的PD-1和TIGIT的抑制剂（分别为纳武抗体和A15153G）可显着提高TB单感染者和HIV/TB合并感染者PBMC细胞样品的IFN-γ阳性斑点数。不仅如此,对于HIV/TB合并感染者细胞样品,联合加入PD-1抑制剂和TIGIT抑制剂使TB阳性检出率从33%显着提高到66%。。这些研究结果表明联合应用PD-1和TIGIT抑制剂可以显着提高IFN-γ免疫酶联斑点方法对HIV/TB合并感染患者细胞样品的TB检出率
陶思雨[3]（2021）在《HLA限制性下结核重组重叠肽在结核诊断中的作用》文中提出目的:特异性细胞免疫应答在结核的病理反应中起重要作用。伴有HLA限制性的抗原提呈机制存在于细胞免疫中,具有不同HLA遗传背景的患者对不同的结核抗原多肽产生不同的反应。本研究通过结核患者HLA基因型的鉴定、利用化学合成结核特异性多肽检测结核患者T细胞反应,探究结核患者基因型与疾病的相关性,以及与提呈肽段的相关性。为获得低成本、制备简易的结核抗原刺激物（结核重组重叠肽蛋白）,通过比较其与市面销售的化学合成结核肽对结核患者的检测结果,希望进一步证明生物合成的结核重组重叠肽蛋白在运用于结核检测中是否具有抗原转移现象。方法:1.利用重组质粒导入感受态细胞中进行生物合成结核重组重叠肽蛋白;发酵扩培得到变性包涵体蛋白,运用SDS-PAGE检测目标蛋白;在蛋白层析仪上进行蛋白纯化;运用高pH值、低尿素溶液复性结核重组重叠肽蛋白;送出公司鉴定结核重组重叠肽蛋白。2.化学固相合成多肽查阅序列后,送往公司制备。3.严格按照纳入和排除标准,筛选出符合条件的43例受试者,签署知情同意书后,收集一般信息资料,采集受试者肝素抗凝外周血约15ml,取10ml分离出PBMC,利用ROP-TB、结核肽刺激进行ELISPOT检测,另取1ml抗凝全血送往公司对受试者基因型HLAⅠ类（-A、-B、-C）、HLAⅡ类（-DRB1、-DQB1）进行高通量、高分辨率鉴定。结果:1.检测抗原生产制备:生物合成结核重组重叠肽蛋白在制备成本低、合成期间质量控制便捷,不涉及毒性物质产生的方面均优于化学合成结核多肽。2.HLA遗传背景与结核相关性:将43例结核受试者分为总体结核受试者组、性别组、地域组、民族组,各组表达人数大于10人的基因型与正常人对照组比较,比较差异具有统计学意义的基因型如下:（1）43例总体结核受试者:HLAⅠ-B*15、HLAⅠ-B*46、HLAⅠ-C*01、HLAⅠ-C*03、HLAⅠ-C*07、HLAⅡ-DRB1*04、HLAⅡ-DRB1*08、HLAⅡ-DRB1*12、HLAⅡ-DRB1*15、HLAⅡ-DQB1*03、HLAⅡ-DQB1*06;（2）25例男性基因型HLAⅠ-B*46、HLAⅠ-C*01;（3）18例女性基因型:HLAⅡ-DQB1*06;（4）25例大理地区基因型HLAⅠ-B*46、HLAⅠ-C*01、HLAⅡ-DRB1*08、HLAⅡ-DQB1*06;（5）18例常州地区基因型:无;（6）18例白族基因型HLAⅠ-C*01、HLAⅡ-DQB1*06;（7）23例汉族基因型:HLAⅠ-B*15,所有以上结果与正常人对照比较,P值均≤0.001,按照α=0.05水准,差异极具有统计学意义。3.在43例受试者中8条肽段中,T细胞反应对P5阳性反应率最高,其对应的基因型表达结果:HLAⅠ-A*02表达率为30.56%;HLAⅠ-B*46表达率为19.44%;HLAⅠ-C*01表达率为30.56%;HLAⅡ-DRB1*08表达率均为27.78%;HLAⅡ-DQB1*03表达率为36.11%。4.结核重组重叠肽蛋白ELISPOT与T-SPOT两种检测方法比较,P>0.05,按照α=0.05水准,证明结核重组重叠肽抗原作为检测试剂盒与市场金标准试剂盒检测结果一致。结论:1.结核患者部分HLA基因型分布与正常人基因型分布有显着差异。2.所有病人均有针对结核抗原的T细胞反应,但是不同的HLA遗传背景的病人其T细胞反应针对不同多肽。3.生物合成结核重组重叠肽蛋白比化学合成结核混合肽更适用于试剂盒生产。4.结核重组重叠肽蛋白没有抗原转移现象。
韩江媛[4]（2021）在《IL-7促进老龄小鼠T细胞免疫记忆及胸腺T细胞发育的机制研究》文中进行了进一步梳理结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的一种慢性传染性疾病。近年来,在逐渐加速的全球老龄化进程中,老年人如何预防结核分枝杆菌感染成为难题。由于老年人的胸腺的萎缩退化,免疫功能紊乱和降低等因素,使得适用于婴幼儿的BCG（Bacillus Calmette-Guérin）不能在老年人群中发挥提供有效的免疫保护作用。因此开发针对老年人群体的疫苗对于结核病的防治具有重要意义。本实验室长期致力于结核亚单位疫苗的研究,前期构建的结核融合蛋白MTB10.4-Hsp X（MH）和ESAT6-Rv2626c（LT29）联合佐剂DDA和Poly I:C（DP）的临床前实验研究结果表明其能够产生较强的细胞免疫和体液免疫反应。如何将这些结核融合蛋白能够用于老年人群,是本课题探索的方向之一。本课题旨在通过改善老年人的中央型记忆T细胞(Central memory T cell,TCM),进而提高老年人对亚单位疫苗的免疫效果。白细胞介素7（Interleukin 7,IL-7）具有促进胸腺细胞、初始T细胞和记忆T细胞增殖和维持记忆T细胞存活的作用,推测其可以促进结核亚单位疫苗在老年人体内产生长期免疫应答。因此,本研究利用老龄小鼠模型,探讨IL-7辅助结核亚单位疫苗促进老龄个体产生长期免疫记忆并探索其机制。细胞因子和转录因子在中央型记忆T细胞(Central memory T cell,TCM)的产生和维持中发挥重要作用。其中,转录因子Id3、Bcl6和Bach2促进记忆T细胞形成,Blimp1促进效应T细胞终末分化。为了进一步研究IL-7对免疫记忆的调控机制,我们利用6-8周龄小鼠模型,探讨IL-7对免疫记忆分化相关转录因子的调控机制。年龄增长导致的胸腺逐渐萎缩最终导致胸腺输出的初始T细胞减少,外周初始T细胞的减少使得接种疫苗后活化的T细胞减少,疫苗的效力下降。年龄增长也会引起DNA甲基化的显着变化,其中,DNA甲基化水平通常随着年龄的增长而显着上升,启动子区发生DNA甲基化修饰会促使基因的转录抑制或表达。为了进一步研究IL-7对老龄小鼠中枢免疫系统中胸腺细胞发育的影响,我们采用老龄小鼠模型,探讨IL-7对胸腺细胞不同发育阶段的影响,并从表观遗传修饰角度探索其机制。第一章IL-7促进老龄小鼠结核亚单位疫苗免疫产生长期免疫记忆目的:研究IL-7辅助结核亚单位疫苗促进老龄小鼠产生T细胞免疫记忆及其机制。方法:（1）制备结核亚单位疫苗（MH+LT29）/DP。（2）应用腺相关病毒包装系统构建和包装r AAV-IL-7。（3）免疫方案。（1）6-8周龄小鼠和老龄小鼠（40-42周龄）接种（MH+LT29）/DP。（2）老龄小鼠接种（MH+LT29）/DP+r AAV-IL-7。接种时间为0、2和4周。实验小鼠均为C57BL/6品系小鼠。（4）免疫检测:末次免疫后25周进行免疫检测。此时,主要反映TCM介导的免疫应答。检测内容如下:（1）ELISA检测抗原刺激脾脏淋巴细胞后分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的水平。（2）两次抗原重复刺激后,流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ能力,反映最初形成TCM的功能。（3）特异性抗原刺激后,Ed U标记法检测CD4+记忆T细胞的增殖能力。（4）ELISA检测血清中抗原特异性抗体Ig G的水平。以上指标检测主要评价IL-7对老龄小鼠免疫记忆的促进作用。（5）通过ELISA法检测6-8周龄小鼠和老龄小鼠接种疫苗后血清IL-6的水平,分析衰老对炎症的影响。（6）通过Multi-analyte flow assay试剂盒检测6-8周龄小鼠、老龄小鼠、r AAV-IL-7作用老龄小鼠和IL-7缺失（IL-7-/-）鼠中血清细胞因子谱变化。分析IL-7在细胞因子水平上对老龄小鼠的作用。结果:（1）结核亚单位疫苗在6-8周龄小鼠体内诱导形成长期存活的记忆T细胞,但在老龄小鼠（40-42周龄）体内不能诱导形成长期存活的记忆T细胞,主要表现为老龄小鼠脾脏淋巴细胞在特异性抗原刺激后分泌IL-2和TNF-α的能力显着降低（P<0.05）,两次抗原重复刺激后,CD4+和CD8+记忆T细胞产生的IFN-γ显着减少（P<0.01）,CD4+记忆T细胞的增殖能力显着降低（P<0.05）,血清中抗原特异性Ig G的水平降低。（2）r AAV-IL-7促进老龄小鼠产生长期免疫记忆:脾脏淋巴细胞在特异性抗原刺激后分泌TNF-α和IFN-γ的能力显着升高（P<0.05）,两次抗原重复刺激后CD4+和CD8+记忆T细胞产生的IFN-γ显着增加（P<0.01）,CD4+记忆T细胞的增殖能力显着增强（P<0.05）,抗原特异性Ig G的水平升高。结果提示IL-7可显着增加老龄小鼠接种结核亚单位疫苗产生长期存活的记忆T细胞并增强长期免疫应答。（3）血清细胞因子谱的研究发现:（1）老龄小鼠血清中IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-22和GM-CSF水平显着降低,IL-6水平显着升高;r AAV-IL-7作用老龄小鼠后,血清中IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-12p70和GM-CSF水平显着上升（P<0.05）。（2）IL-7缺失后,血清中IL-12p70、IL-22、和GM-CSF显着降低,IL-1α和IFN-γ显着上升（P<0.05）。以上结果说明IL-7促进老龄小鼠分泌IL-12p70和GM-CSF。结论:老龄小鼠对结核亚单位疫苗诱导的长期免疫应答较6-8周龄明显减弱;IL-7可以增强老龄小鼠产生长期存活记忆T细胞,提高抗原特异性抗体产生;IL-7上调血清细胞因子IL-12p70和GM-CSF水平,促进老龄小鼠产生T细胞免疫记忆。第二章IL-7、Id3和Bcl6促进小鼠产生结核亚单位疫苗长期免疫记忆目的:探讨IL-7和转录因子辅助结核亚单位疫苗对长期存活记忆T细胞形成的作用。方法:（1）制备结核亚单位疫苗（MH+LT70）/DP。其中,LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64（190-198）-Mtb8.4-Rv2626c)和MH（Mtb10.4-Hsp X）由本实验室前期构建。（2）应用腺相关病毒包装系统构建和包装r AAV-IL-7。应用慢病毒包装系统包装r LV-Id3、r LV-Bcl6、r LV-Bach2和r LV-Blimp1。（3）免疫方案:（MH+LT70）/DP+r AAV-IL-7、r LV-Id3、r LV-Bcl6、r LV-Bach2和r LV-Blimp1分别与（MH+LT70）/DP免疫C57BL/6小鼠。免疫时间为0、2和4周。（4）免疫检测。末次免疫后的第25周进行免疫检测。此时间点的免疫检测主要反映TCM介导的免疫应答。主要检测内容如下:（1）TCM（CD62L+CD44+）表型检测。（2）两次抗原重复刺激后,胞内因子染色法检测CD4+和CD8+记忆T细胞产生IFN-γ能力,反映最初形成TCM的功能。（3）Ed U标记法检测CD4+和CD8+记忆T细胞的增殖能力。（4）抗原表位五聚体技术检测TB10.4特异性CD8+记忆T细胞的变化。（5）ELISA检测血清中抗原特异性抗体Ig G、Ig G1和Ig G2c的水平。通过以上指标检测评价IL-7和转录因子对长期存活记忆T细胞的促进作用。在此基础上,进一步探索IL-7对转录因子的调控作用,揭示IL-7促进免疫记忆产生的分子机制。（5）r AAV-IL-7与疫苗接种后的3、5和7天,使用RT-PCR分析CD4+T细胞和CD8+T细胞中转录因子Id3、Bcl6、Bach2和Blimp1的表达变化。结果:（1）r AAV-IL-7促进结核亚单位疫苗产生TCM并增强TCM介导的免疫应答,主要表现为中央型CD4+记忆T细胞显着增加（P<0.01）,CD4+和CD8+记忆T细胞的增殖能力显着增强（P<0.05）,CD8+T细胞和CD4+T细胞在两次抗原重复刺激后产生的IFN-γ增加（P<0.05）和TB10.4特异性CD8+记忆T细胞的数量增加（P<0.05）。此外,血清中抗原特异性Ig G的水平升高。（2）r AAV-IL-7在免疫后第3天显着促进CD8+T细胞中的Id3和Bcl6及CD4+T细胞中的Id3、Bcl6和Bach2表达升高（P<0.05）。（3）过表达Id3和Bcl6促进结核亚单位疫苗产生长期免疫记忆。主要结果有:中央型CD8+记忆T细胞增多（P<0.01）,CD8+和CD4+T细胞的增殖能力增强（P<0.05）,TB10.4特异性CD8+记忆T细胞增加（P<0.05）,CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ能力在两次抗原重复刺激后分别显着增加（P<0.01）和血清中抗原特异性抗体产生增加。（4）过表达Bach2对辅助结核亚单位疫苗诱导产生长期免疫记忆无显着作用。结论:IL-7促进结核亚单位疫苗产生TCM及长期免疫应答。IL-7通过促进转录因子Id3和Bcl6调控免疫记忆,Id3和Bcl6有促进结核亚单位疫苗产生长期免疫记忆的作用。第三章IL-7对老龄小鼠胸腺DN3细胞中DNA甲基化修饰的调节作用研究目的:通过老龄小鼠模型分析r AAV-IL-7对老龄个体胸腺双阴（Double negative,DN）细胞的增殖作用,并进一步分析与增殖相关基因Bcl2和c-Myc的DNA甲基化作用及其机制。方法:用在线软件Meth Primer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）预测Bcl2和c-Myc基因启动子区的CPG岛,在Cp G岛区设计甲基化特异性引物。将r AAV-IL-7作用C57BL/6老龄小鼠,通过流式细胞术（FCM）检测胸腺双阴（DN）细胞不同时期的DN1、DN2、DN3和DN4、双阳（DP）、单阳（SP）CD4/CD8细胞在7天和15天的变化。用流式细胞分选仪分选胸腺DN3细胞,提取基因组DNA和RNA。亚硫酸氢盐测序PCR分析6-8周龄小鼠和r AAV-IL-7作用老龄小鼠（50-52周龄）后胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc基因启动子区域中DNA甲基化水平变化。最后通过RT-PCR分析Bcl2和c-Myc在DN3细胞中的表达变化。结果:（1）衰老导致胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc启动子区域的DNA甲基化水平升高。（2）r AAV-IL-7降低老龄小鼠胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc启动子区域的DNA甲基化水平。（3）r AAV-IL-7促进老龄小鼠胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc的表达升高,而且与启动子区的甲基化水平呈负相关关系。（4）r AAV-IL-7作用老龄小鼠后显着增加胸腺中总的淋巴细胞、DN细胞和DN2-DN3-DN4细胞的细胞数。结论:衰老导致胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc基因启动子区域的DNA甲基化水平升高;IL-7促进Bcl2和c-Myc基因启动子区域发生去甲基化修饰,Bcl2和c-Myc表达升高,促使老龄小鼠胸腺DN3细胞的数量增加。
宁唤唤[5]（2021）在《结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用》文中提出研究背景结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的呼吸道传染病。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是目前唯一批准使用的结核病疫苗,但对成人结核病的保护效果不完善,可能与BCG在减毒传代过程中丢失了一些编码保护性抗原的基因序列有关,例如:差异编码区1（region difference,RD1）。因此,新型疫苗的研发有助于更好地防控结核病。6k Da早期分泌靶抗原（6 k Da early secretory antigenic target,ESAT-6）是Mtb与BCG的差异抗原。研究发现,ESAT-6能够诱导机体产生抗Mtb感染的保护性免疫应答,被广泛用于结核病疫苗研究。目前,包含ESAT-6及其他抗原的四种疫苗已进入临床试验。此外,ESAT-6作为毒力因子与Mtb的致病性有关,且参与调控Mtb感染宿主的免疫应答。因此,ESAT-6是结核病疫苗研究中有潜能的候选抗原之一。然而,课题组前期研究发现,ESAT-6抗原诱导的机体免疫应答水平不高。研究发现,细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP）不仅调控细菌生理功能,还能诱导宿主固有免疫应答,且作为黏膜佐剂能够增强抗原诱导的特异性免疫应答。因此,本研究旨在探究ESAT-6的免疫学特性,评价ESAT-6亚单位疫苗及以c-di-AMP为佐剂黏膜接种对Mtb感染的保护作用,为ESAT-6用于结核病黏膜疫苗的研制提供理论与实验依据。研究目的探究Mtb ESAT-6同系物Ms ESAT-6在快速生长型分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms）调控免疫应答中的作用;探究Mtb的重组ESAT-6蛋白对巨噬细胞固有免疫的调控作用;明确基于Mtb ESAT-6的亚单位疫苗以c-di-AMP为佐剂经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答特点,评价ESAT-6为基础的亚单位疫苗抗Mtb感染的保护效率。方法与结果（1）耻垢分枝杆菌ESAT-6敲除株的免疫学特性1)Ms ESAT-6是Mtb ESAT-6在Ms中的同系物,二者氨基酸序列相似性为72%。采用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ms ESAT-6敲除株MsΔE6（ΔE6）,并构建了互补菌株ΔE6 C。生长及染色特性结果显示,敲除ESAT-6对细菌生长有一定影响,但不影响细菌抗酸染色特性。2)建立Ms体外感染巨噬细胞模型,发现ESAT-6在Ms感染诱导巨噬细胞产生炎症因子、诱导炎症小体活化以及自噬中发挥作用,但影响水平有限。3)细菌胞内存活结果显示,敲除ESAT-6的菌株在巨噬细胞内复制减少,说明ESAT-6与Ms在巨噬细胞内存活有关。（2）ESAT-6在调节巨噬细胞固有免疫中的作用1)建立巨噬细胞体外刺激模型,发现c-di-AMP促进了Mtb ESAT-6重组蛋白诱导的I型IFN应答;ESAT-6和c-di-AMP在处理早期可诱导巨噬细胞自噬起始,二者长时间处理主要表现为抑制自噬降解,该过程受m TOR调控但不依赖于IL-17。2)ESAT-6可诱导巨噬细胞炎症因子应答,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的炎症因子应答。3)Mtb胞内存活结果显示,在感染早期ESAT-6和c-di-AMP以协同的方式限制了Mtb的复制;随着感染时间延长,抑制Mtb生长的作用逐渐不明显。（3）ESAT-6亚单位疫苗的免疫学特性1)以ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经鼻黏膜接种小鼠,体液免疫应答检测结果显示,ESAT-6可诱导机体系统性和黏膜局部特异性抗体产生,c-di-AMP为黏膜佐剂增强了ESAT-6诱导的体液免疫应答。2)细胞免疫应答检测结果显示,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的系统性Th1/Th2/Th17型以及炎症因子应答;同时促进了黏膜局部的Th17型和炎症因子应答。3)肺组织免疫细胞亚群分析结果显示,ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP接种导致CD8+T细胞和巨噬细胞比例减少;同时,c-di-AMP为黏膜佐剂促进了ESAT-6诱导的固有淋巴样细胞ILC1和NK细胞的分化。（4）ESAT-6亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率1)ESAT-6免疫小鼠Mtb感染后黏膜免疫应答增强,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答。2)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP免疫小鼠Mtb感染后,Th1型（IFN-γ）、Th2（IL-10）、Th17（IL-17）以及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的产生均减少。3)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经黏膜接种小鼠提供了抗Mtb感染的保护作用,且c-di-AMP为佐剂在一定程度上提高了ESAT-6的免疫保护作用。研究结论Ms ESAT-6在Ms感染诱导的宿主固有免疫中发挥一定的作用,影响细菌胞内存活,整体上作用有限。Mtb ESAT-6与免疫调节子c-di-AMP协同激活I型IFN,调控细胞自噬,诱导炎症应答,促进了巨噬细胞清除Mtb感染。ESAT-6经黏膜接种,可诱导体液免疫应答,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答以及Th1/Th2/Th17型细胞免疫应答。ESAT-6经黏膜免疫可提供对Mtb感染的保护力,且c-di-AMP在一定程度上可提高ESAT-6的免疫保护效率。
谢涛[6]（2021）在《基于流感病毒样颗粒载体的结核亚单位疫苗LV20的制备与免疫原性研究》文中认为由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）引起的结核病（Tuberculosis,TB）是全球主要的健康问题之一。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）是目前临床上唯一批准使用的预防性结核疫苗,可预防严重的儿童结核病,但其对成人结核病的保护作用不佳。由于卡介苗提供的保护有限,所以我们急需开发一种能够预防儿童和成人结核病的新型疫苗。在新型疫苗中,病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）作为一种特殊类型的亚单位疫苗,在多种病毒疫苗中研制成功并为人类提供了有效的保护。特别是近年来以病毒样颗粒为载体平台,融合外源表位的嵌合病毒样颗粒广泛应用于疫苗研发。目的:将结核分枝杆菌细胞壁抗原HBHA和菌毛抗原MTP细胞外肽片段构建的融合蛋白HBHA109-170-MTP27-89（HM）展示于流感病毒样颗粒表面,构建基于流感病毒样颗粒为载体的结核亚单位疫苗LV20,并以小鼠为模型,评价疫苗的免疫原性。方法:1.构建昆虫杆状病毒表达载体系统（Insect baculovirus expression vector system,IBEVS）的穿梭载体Bacmid-HM-MS。选择带有双启动子的p Fast Bac Dual质粒,在PPH和Pp10启动子后分别连接流感基质蛋白M1 DNA序列和HA的部分（跨膜区和胞外信号肽区）DNA序列,得到p Fast Bac Dual-MS质粒;设计引物,通过基因工程将HM DNA序列连接在p Fast Bac Dual-MS质粒上,通过PCR和测序验证重组质粒p Fast Bac Dual-HM-MS;p Fast Bac Dual-HM-MS转化至DH10BacTM感受态细胞,通过转座酶作用后,再经过蓝白斑筛选和PCR分析,验证重组杆粒Bacmid-HM-MS。2.嵌合病毒样颗粒LV20的表达、纯化和鉴定。提取Bacmid-HM-MS,转染Expi Sf9?昆虫细胞得到P0代杆状病毒,后续扩大感染得到P1代杆状病毒。病毒感染Expi Sf9?细胞后在增强剂作用下大量表达嵌合病毒样颗粒LV20;利用超速离心收集并通过蔗糖密度梯度离心纯化LV20;纯化后的嵌合病毒样颗粒通过Western blot和电子显微镜验证病毒样颗粒的表达和组装情况。3.嵌合病毒样颗粒LV20的免疫原性检测。在第0、2、4周分别用PBS、BCG、LV20、LV20联合DDA-Poly I:C佐剂（DP）、HBHA联合DP佐剂免疫小鼠三次。末次免疫6周后,通过流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞分泌抗原特异性的IL-2和IFN-γ的水平,再应用ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体（Ig G、Ig G1、Ig G2c）分泌的程度。结果:1.流感载体质粒p Fast Bac Dual-MS经华大基因公司合成后并测序验证;再通过基因工程,成功将HM DNA序列克隆至p Fast Bac Dual-MS质粒,经PCR验证和DNA测序验证,构建获得p Fast Bac Dual-HM-MS质粒;p Fast Bac Dual-HM-MS质粒转座后,经筛选和PCR验证获得阳性转座菌落,提取杆粒获得Bacmid-HM-MS。2.在昆虫细胞中表达了嵌合病毒样颗粒,经Western blot验证,流感基质蛋白M1和结核蛋白HM成功表达,并通过电子显微镜观察到了80-100纳米的颗粒,成功制备了基于流感病毒样颗粒的结核亚单位疫苗LV20。利用蔗糖密度梯度离心法对其进行了纯化。3.LV20结合DP佐剂和单独LV20免疫过的小鼠脾脏淋巴细胞,与BCG和HBHA联合DP佐剂组相比,在结核分枝杆菌抗原刺激后产生的IFN-γ和IL-2较高;LV20联合DP佐剂组免疫过的小鼠,血清中产生的结核抗原特异性抗体Ig G、Ig G1和Ig G2c高于BCG组。结论:我们成功地以流感病毒样颗粒为载体构建了一种表面展示结核抗原(HBHA109-170-MTP26-89)的嵌合病毒样颗粒LV20,该嵌合病毒样颗粒免疫小鼠后可有效地诱导抗原特异性细胞免疫和体液免疫,有望成为一种新的结核病候选疫苗。
张慧[7]（2020）在《重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10变态反应原的临床效用的评价及其相关统计方法研究》文中研究表明研究目的结核病（Tuberculosis,TB）是严重危害人类健康的慢性传染病之一,我国结核病负担很重,是全球30个结核病高负担国家之一。结核菌素（Purified protein derivative,PPD）皮肤试验常用于TB的临床辅助诊断和筛查,但特异性差。近年来,以T细胞为基础的T-SPOT检测因其高度的灵敏度和特异度而得到快速发展用于TB的辅助诊断和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染的筛查,但试剂价格昂贵,操作很难自动化,不适用于偏远地区TB的辅助诊断和大范围人群的筛查。因此,研发特异性强、价格合理、方便使用的皮试试剂是TB控制的重要前提。基于我国结核病的流行现状和MTB特异性抗原早期分泌抗原靶点6（Early secretory antigenic target 6,ESAT6）和培养滤液蛋白10（Culture filter protein 10,CFP10）,我国自主研发了重组融合蛋白EC（ESAT6-CFP10）皮试试剂进行临床试验研究。本研究的目的:1.评价EC皮试的灵敏度和特异度。2.评价EC皮试、PPD皮试以及T-SPOT三种检测方法的关联性和一致性;3.评价EC皮试的临床有效性;4.评价EC皮试的安全性。研究对象与方法对EC与PPD皮试以及EC皮试与T-SPOT检测的灵敏度差值及特异度差值设定原假设、备择假设、非劣效和优效的界值,重复试验求得检验效能,迭代增加求得样本量。随后在临床大样本数据的条件下,得出两种方法灵敏度差值和特异度差值的标准差,计算可信区间。2015年10月至2018年03月,共选取1090例患者入组。患者研究由上海市公共卫生临床中心、天津市海河医院、武汉市结核病防治所、北京胸科医院、重庆医科大学附属第一医院、无锡市第五人民医院、福州肺科医院、镇江市第三人民医院、安徽省立医院及深圳市第三人民医院协同完成。2016年01月至2016年06月,共选取1564名健康人入组。健康人群研究由江苏省疾病预防控制中心完成。对受试者的人口学特征及临床特征等进行统计学描述。采用成组t检验对年龄、身高、体重、血压、体温在三阴人群（T-SPOT检测、PPD皮试及EC皮试均为阴性的健康人群）中卡介苗组和安慰剂组间的差异进行统计学检验,采用c2检验/Fisher确切概率检验对性别、民族、合并疾病和用药情况在三阴人群中两组间的差异进行统计学检验。分别计算以硬结和红晕作为EC皮试诊断标准的灵敏度、特异度、与临床诊断结果的一致率、约登指数（Youden index,YI）和Kappa值;计算硬结和红晕的阳性检出率,两者之间的阳性符合率、阴性符合率、一致率和Kappa值;计算四种指标之间的灵敏度、特异度及与临床诊断结果的一致率。所有率组间比较采用c2检验。各类受试人群之间EC皮试阳性反应率的比较采用c2检验。计算EC皮试、PPD皮试及T-SPOT检测结果的灵敏度、特异度、与临床诊断结果的一致率、YI和Kappa值。三种检测方法之间的灵敏度、特异度及与临床诊断结果的一致率比较采用c2检验。在各类受试人群中,计算EC皮试、PPD皮试和T-SPOT检测两两之间的一致率,两两之间检测结果比较采用配对c2检验。将受试人群分为结核病患者组、非结核病组,构建配对四格表。在结核病患者人群中分别计算两种诊断方法的灵敏度,在非结核病人群中分别计算两种诊断方法的特异度,分别对两种方法的灵敏度和特异度做差,得出差值的标准差,运用可信区间方法判定EC皮试的临床效用。研究结果1.通过三臂检验的样本量模拟,在灵敏度方面:当SeB在[0.75,0.85]变化时,样本量随着SeB,SeC值的增大而增大。整体来讲,SeA=0.80所需的样本量要比SeA=0.82和SeA=0.85大得多。当SeA=0.80,SeB=0.75,SeC=0.80时检验效能最大,约为0.997;当SeA=0.80,SeB=0.85,SeC=0.85时检验效能最小,约为0.695。在特异度方面:样本量随着SpA和SpB的增大而增大。当SpA=0.90,SpB=0.97时所需的样本量最大,为1048;当SpA=0.95,SpB=0.90时所需的样本量最小,为46。可信区间下限大于非劣效界值,则可得出新的诊断方法在灵敏度（或特异度）方面非劣效于传统的诊断方法;可信区间下限大于优效界值,则可得出新的诊断方法在特异度方面优效于传统的诊断方法。2.以红晕为EC皮试诊断标准的灵敏度高于以硬结为诊断标准的灵敏度（P<0.01）;在健康人群中,皮试后24小时,以红晕为皮试诊断标准的特异度低于以硬结为诊断标准的特异度（P<0.01）,皮试后48小时,以红晕和硬结分别作为诊断标准的特异度比较无统计学差异（P=0.23）;在卡介苗人群中,皮试后24小时（P=0.18）和48小时（P=0.32）,以红晕和硬结分别作为诊断标准的特异度比较均无差异。在结核病患者中,皮试后48小时及72小时,硬结与红晕诊断结果的一致率高于皮试后24小时的一致率（P<0.01）;在非结核性肺部其他疾病患者（P=0.60）、健康人群（P=0.11）及卡介苗接种人群（P=0.49）中,皮试后各时间点硬结与红晕诊断结果的一致率均无统计学差异。在结核病患者中,单用红晕及平行使用硬结或红晕这两种诊断指标的灵敏度较高（P<0.01）;在非结核性肺部其他疾病患者中,联合使用硬结和红晕作为诊断指标的特异度最高（P<0.01）,在健康人群（P=0.27）以及卡介苗接种人群（P=0.42）中,四种诊断指标的特异度比较无统计学差异;在结核病患者和卡介苗接种人群中,单用红晕及平行使用硬结或红晕这两种诊断指标与临床诊断结果的一致性较高（P<0.01）。3.非结核人群中,EC皮试的阳性反应率显着低于结核病患者中EC皮试的阳性反应率（P<0.01）;各类结核病患者中,EC皮试的阳性反应率显着高于非结核性肺部其他疾病患者中EC皮试的阳性反应率（P<0.01）;各类结核病患者中,EC皮试的阳性反应率显着高于卡介苗接种人群中EC皮试的阳性反应率（P<0.01）;菌阴肺结核患者中,EC皮试的阳性反应率低于菌阳肺结核患者中EC皮试的阳性反应率（P<0.01）;不同治疗类型患者中,EC皮试的阳性反应率比较无统计学差异（P=0.86）。4.在结核病患者中,三种检测方法的灵敏度都很高,三者比较无统计学差异（P>0.05）;在健康人群特别是在卡介苗接种人群中,EC皮试的特异度很高,PPD皮试的特异度显着低于EC皮试和T-SPOT检测的特异度（P<0.01）;EC皮试、T-SPOT检测与临床诊断结果具有较高的一致率,PPD皮试与临床诊断结果的一致率低于EC皮试、T-SPOT检测与临床诊断结果的一致率（P<0.01）。5.在所有类型结核病患者中,三种方法之间两两比较,一致率在90.00%左右,三种方法两两之间一致率比较均无统计学差异（P均>0.05）;在卡介苗接种人群中,EC皮试和T-SPOT的一致率为94.94%,两种检测方法一致率比较无统计学差异（P>0.05）。在非结核性肺部其他疾病患者、健康筛选人群及卡介苗接种人群中,EC和PPD皮试,PPD皮试和T-SPOT检测之间一致率比较均有统计学差异（P<0.01）。6.在灵敏度方面,EC皮试的灵敏度非劣效于T-SPOT检测和PPD皮试。在特异度方面,EC皮试的特异度非劣效于T-SPOT检测,优效于PPD皮试。7.EC皮试后产生的不良反应主要为局部不良反应,多为注射部位瘙痒和疼痛,且不良反应多为轻度,未发生严重不良事件。结论1.运用三臂检验的方法对临床试验的样本量进行模拟并计算检验效能;根据文献报道,在临床大样本数据条件下简化了诊断试验临床有效性的判定方法,两种诊断试验灵敏度（或特异度）差值的可信区间下限大于非劣效界值（或优效界值）,则可以下临床非劣效（或优效）的结论。2.EC皮试的灵敏度和特异度很高,且与临床诊断结果的一致性较好;EC皮试与T-SPOT检测结果的一致性较高;在灵敏度方面,EC皮试非劣效于PPD皮试与T-SPOT检测,在特异度方面,EC皮试非劣效于T-SPOT检测优效于PPD皮试;安全性良好。EC皮试可代替T-SPOT和PPD皮试用于结核分枝杆菌感染的筛查,结核病的辅助诊断和鉴别诊断。
李娜[8]（2020）在《六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究》文中进行了进一步梳理结核病仍是严重威胁人类健康的重大传染病之一。为遏制结核病的严重流行并最终实现终止结核病的目标,迫切需要筛选和评价更多的免疫优势抗原或抗原组合用于结核病的免疫学诊断和新型结核疫苗研发中,以期改善诊断效能并促进有效结核疫苗的研发。本论文基于上述两个角度和方向开展了相关实验研究。一方面,选取了六种T细胞表位覆盖率为100%的结核分枝杆菌特异性蛋白抗原,对它们的独立和组合免疫学诊断价值进行了评价;另一方面,对潜在的免疫优势抗原Rv2318（UspC）的抗原性进行了初步研究。本研究选取 Rv0288、Rv1980c、Rv2029c、Rv2031c、Rv3874 和 Rv3875 六种MTB蛋白进行了免疫学诊断价值评价,并探索了潜在的优势诊断组合物。首先,利用大肠杆菌蛋白表达系统表达了这六种结核分枝杆菌特异性蛋白抗原,并通过亲和层析技术对六种重组蛋白进行了纯化;然后采集了 43名结核病患者（包括菌阳肺结核、菌阴肺结核和肺外结核患者）和38名健康志愿者的静脉血,用来分离外周血单个核细胞进行ELISPOT试验并分离血清进行ELISA实验;最后,使用非参数T检验-Mann-Whitney检验、Dunn’s多重比较检验、ROC分析和Spearman相关分析等方法对检测结果进行统计分析。结果显示,除Rv2029c外的其余五种抗原（Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874和Rv3875）均具有较好的细胞免疫诊断价值,体现诊断准确度的AUC值分别为0.852、0.814、0.852、0.874和0.872。仅Rv2031c具有一定的体液免疫诊断价值,其AUC为0.637。组合诊断性能分析表明,Rv3874-Rv3875和Rv2031c-Rv3874是优秀的双抗原诊断组合物,Rv2031c-Rv3875-Rv3874 和 Rv0288-Rv3875-Rv3874 是最佳的三抗原诊断组合物。四抗原组合Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c的潜在诊断价值则优于其他所有组合。因此,Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874和Rv3875五种MTB蛋白自身均具有较好的细胞免疫诊断价值,四抗原组合物Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c是最有诊断潜力的抗原组合。为筛选出更多的免疫优势抗原,本研究还对一种被研究得较少的Rv2318（UspC）蛋白的抗原性进行了初步探索。首先,根据IEDB数据库中Rv2318蛋白的T细胞表位信息,选取了两个表位集中区,通过重叠PCR技术将序列拼接,构建Rv2318P的重组克隆子,并进行了 Rv2318完整蛋白和表位拼接蛋白Rv2318P的表达和纯化;然后,通过采集志愿者（含结核病患者和健康志愿者）的静脉血进行ELISPOT和ELISA实验,评价了 Rv2318和Rv2318P的免疫反应性;最后,在BALB/c小鼠模型中对Rv2318和Rv2318P的免疫原性进行了评价。体外和体内实验的结果表明Rv2318（UspC）蛋白具有较强的免疫反应性和免疫原性,能诱发机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,因而是有较大潜力的结核疫苗候选抗原。同时,Rv2318和Rv2318P的比较分析表明,Rv2318表位拼接蛋白Rv2318P能有效保留Rv2318完整蛋白的免疫原性和免疫反应性,甚至优于其完整蛋白。证实了表位拼接方式作为优化抗原途径之一的可行性。因此,Rv2318（UspC）蛋白具有较强的抗原性,是潜在的疫苗候选抗原。Rv2318P可能是Rv2318的潜在替代抗原。未来需进一步探索Rv2318和Rv2318P的免疫保护效能,以明确它们作为疫苗成分的潜力以及表位剪接方法的有效性。总而言之,Rv0288、Rv1980c、Rv2031c、Rv3874 和 Rv3875 五种蛋白抗原均具有较好的细胞免疫学诊断价值,它们的组合中,三抗原组合Rv2031c-Rv3875-Rv3874 和 Rv0288-Rv3875-Rv3874 以及四抗原组合 Rv0288-Rv3875-Rv3874-Rv2031c为潜在的IGRAs优秀诊断组合物。Rv2318（UspC）蛋白及其表位拼接蛋白Rv2318P均具有较好的抗原性,是有较大潜力的结核疫苗候选抗原。表位拼接方式是可能的抗原优化的途径之一。
李琳雪[9]（2020）在《结核分枝杆菌Rv1860、Rv0494及Rv1876蛋白在活动性结核病诊断中的临床应用研究》文中指出目的:通过蛋白芯片技术评估结核分枝杆菌候选生物标志物Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白在活动结核病诊断中的临床应用价值,为活动结核病诊断研究提供新思路。方法:收集2018年1月至2019年3月就诊于遵义医科大学附属医院的活动性肺结核患者（ATB组）、结核潜伏感染患者（LTBI组）、肺炎、肺癌等疾病对照患者（D组）、健康志愿者（N组）血清各30份,用由不同浓度的Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白定制的蛋白小芯片与120份血清进行抗原抗体反应,对有效数据进行归一化处理,对Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白单独、二者相互联合及三者联合诊断来分析计算其曲线下面积（area under the curve,AUC）,对其在活动性结核病诊断中的临床应用价值进行评估。结果:（1）Rv1860、Rv0494、Rv1876用于鉴别活动性结核病与结核潜伏感染:针对血清IgG免疫应答,Rv1860y25的AUC为68.2%;Rv0494y的AUC为67.7%;Rv1876y的AUC为57.2%;Rv1860联合Rv0494的AUC为73.0%;三指标联合诊断的AUC为76.8%;（2）Rv1860、Rv0494、Rv1876用于鉴别活动性结核病与肺炎、肺癌:针对血清IgG免疫应答,Rv1860y25的AUC为70.1%;Rv0494y的AUC为69.8%;Rv1876y的AUC为61.7%;Rv1860联合Rv0494的AUC为73.6%;三项指标联合的AUC为74.4%;（3）Rv1860、Rv0494、Rv1876用于鉴别活动性结核病与健康人群:针对血清IgG免疫应答,Rv1860y25的AUC为75.6%;Rv0494y的AUC为77.3%;Rv1876y的AUC为62.9%;Rv1860联合Rv0494的AUC为79.0%;三指标联合的AUC为80.0%。结论:（1）血清Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白IgG抗体三指标联合检测可用于鉴别活动性结核病与结核潜伏感染。（2）血清Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白IgG抗体三指标联合检测可较好地区分活动性结核病与肺炎、肺癌。（3）血清Rv1860、Rv0494、Rv1876蛋白IgG抗体三指标联合检测可用于鉴别活动性结核病与健康人群,可应用于活动性结核病的辅助诊断。
肖佳妮[10]（2020）在《结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核应答特征及免疫保护机制研究》文中认为结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）通过空气经呼吸道传播后感染引起的传染病。全世界近四分之一的人口感染过M.tb,2018年中国在全球30个结核病高负担国家中位居第二,因此结核病防控形势十分严峻。多项研究认为M.tb脂蛋白因其分布特征和强免疫原性,可直接介导病原-宿主相互作用,在结核病诊断及疫苗研发中具有潜在价值。本课题组前期发现,Rv3006基因编码的脂蛋白Z（LppZ）在结核病患者中显示强细胞免疫反应性。为此,本研究利用原核表达得到的LppZ蛋白,系统分析了其在结核病诊断和疫苗研发中的价值,并探索了其参与抗结核免疫应答的相关机制。本论文主要包括以下三个部分:第一部分结核分枝杆菌脂蛋白Z在结核病诊断中的意义分别收集125例结核病患者（TB）、92例结核潜伏感染者（LTBI）和165例健康人（HC）的外周血样本,用ELISPOT和间接ELISA法检测人群中LppZ抗原特异性细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,TB患者中LppZ抗原特异性分泌IFN-γ的细胞数量显着高于HC,ROC曲线显示其与ESAT-6或CFP-10相当,具有良好的TB诊断价值;同时,LppZ抗原特异性IgA水平在TB和LTBI中显着高于HC,其中TB患者中LppZ抗原特异性IgA水平可随抗结核治疗逐渐降低,提示LppZ抗原特异性IgA有望作为辅助诊断指标筛查M.tb感染。综合人群中的研究结果,表明LppZ在M.tb感染后能够诱导高水平的细胞免疫和体液免疫应答,是一个强免疫原性的新结核分枝杆菌抗原。第二部分结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核免疫保护作用将小鼠免疫LppZ后,分别用ELISA检测血清中抗原特异性抗体水平,用ELISPOT和ICS检测脾脏抗原特异性T细胞应答。结果显示LppZ蛋白能够在小鼠体内诱导抗原特异性适应性免疫应答,包括血清LppZ抗原特异性Ig G水平显着升高、脾脏CD4+T细胞中分泌Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）的细胞数及CD8+T细胞中分泌IFN-γ的细胞数显着增加,同时抗原特异性多功能T细胞应答也增强。小鼠H37Rv攻毒模型结果显示,LppZ免疫小鼠相比对照组小鼠,其肺部和脾脏菌载量显着降低,并且与BCG免疫小鼠相当,同时肺部病理损伤明显减轻。上述结果表明LppZ免疫小鼠后,可发挥较好的抗结核免疫保护作用,提示LppZ有望作为新结核亚单位疫苗候选靶抗原。第三部分结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核免疫保护作用的机制研究本部分采用体内外研究策略,系统研究了LppZ抗结核免疫保护作用的相关机制。利用Air pounch试验模型发现,LppZ处理后在早期即可招募大量中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞的迁移;体外将LppZ蛋白刺激巨噬细胞系或是C57BL/6小鼠来源的腹腔巨噬细胞后,可以促进ROS和炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-12）的产生、诱导细胞发生非经典自噬（LC3-Ⅱ和p62显着增加、Beclin-1不变）、抑制胞内氧化磷酸化代谢水平（最大呼吸及备用呼吸能力均显着降低）,最终表现为对BCG除菌功能的增强。此外,LppZ处理后的巨噬细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达也明显上调,并呈现出时间和剂量依赖性;LppZ活化的巨噬细胞可以诱导抗原特异性CD4+T细胞产生大量的Th1和Th17型细胞因子（如IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α、IL-17）,提示其抗原提呈功能的增强。同时,将LppZ预先处理的巨噬细胞进行体外病毒攻毒后发现,LppZ处理组可以显着抑制VSV病毒在细胞内的复制,但是对于HSV病毒的抑制作用则不明显。上述研究结果表明结核分枝杆菌感染后,LppZ可以诱导产生很强的免疫应答,是一个新的强免疫原性的结核抗原,将其免疫小鼠后可以诱导产生较好的免疫保护作用,机制研究结果显示LppZ可以通过TLR2和TLR4活化巨噬细胞,导致细胞因子分泌、清除病原菌的能力和抗原提呈能力明显增加,此外,我们首次发现了LppZ处理的巨噬细胞可以抵抗其他病原菌感染的能力,显示出LppZ可以诱导巨噬细胞的驯化免疫功能。据此,LppZ作为一个新的结核抗原分子可以激活宿主的固有免疫和适应性免疫功能,在结核病诊断和结核新疫苗研发中具有潜在的应用价值。
二、应用ELISPOT试验测定重组卡介苗诱导的T细胞应答（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用ELISPOT试验测定重组卡介苗诱导的T细胞应答（论文提纲范文）
（1）旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 1.1 旋毛虫虫体抗肿瘤 |
| 1.2 旋毛虫可溶性粗抗原抗肿瘤 |
| 1.3 旋毛虫与肿瘤相关抗原抗肿瘤 |
| 1.4 旋毛虫排泄分泌抗原抗肿瘤 |
| 第二章 细菌作为活疫苗载体研究现状 |
| 2.1 单增李斯特菌 |
| 2.2 沙门氏菌 |
| 2.3 牛结核分枝杆菌卡介苗 |
| 2.4 乳酸菌 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 旋毛虫肌幼虫的富集与纯化 |
| 1.2.2 旋毛虫sHSPs基因的扩增 |
| 1.2.3 表达载体pValac-sHSPs的构建 |
| 1.2.4 蛋白sHSPs的表达及鉴定 |
| 1.2.5 NC8-sHSPs的生长特性 |
| 1.2.6 黏附、侵袭能力检测 |
| 1.2.7 质粒递送及表达能力检测 |
| 1.2.8 小肠内定植能力检测 |
| 1.2.9 安全性评价 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 sHSPs基因的选择 |
| 1.3.2 真核质粒pValac-sHSPs表达鉴定 |
| 1.3.3 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs的转化与构建 |
| 1.3.4 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs生长特性分析 |
| 1.3.5 重组植物乳杆菌NC8-sHSPs侵袭、定植能力 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抑瘤率检测 |
| 2.2.2 重组sHSPs的诱导、纯化 |
| 2.2.3 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 2.2.4 肠道灌洗液和血清总sIgA水平的检测 |
| 2.2.5 细胞因子检测 |
| 2.2.6 脾淋巴细胞亚群及数量检测 |
| 2.2.7 sHSPs对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.2.8 sHSPs诱导的特异性CTL的功能检测 |
| 2.2.9 免疫组化检测肿瘤内PCNA的表达 |
| 2.2.10 小鼠体重和病理组织学变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NC8-sHSPs处理对黏膜免疫的影响 |
| 2.3.2 NC8-sHSPs处理对体液免疫的影响 |
| 2.3.3 NC8-sHSPs处理对细胞免疫的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对 Lewis肺癌的治疗作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠Lewis肺癌模型的建立 |
| 3.2.2 NC8-sHSPs治疗对LLC生长的影响 |
| 3.2.3 NC8-sHSPs治疗对LLC小鼠生存率的影响 |
| 3.2.4 血清sHSPs特异性IgG的检测 |
| 3.2.5 血清、肠道灌洗液总sIgA水平的检测 |
| 3.2.6 血清细胞因子的检测 |
| 3.2.7 小鼠体重和组织病理学检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NC8-sHSPs治疗对黏膜免疫的影响 |
| 3.3.2 NC8-sHSPs治疗对体液免疫的影响 |
| 3.3.3 NC8-sHSPs治疗对细胞免疫的影响 |
| 3.3.4 NC8-sHSPs疗效分析 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）PD-1与TIGIT分子对结核特异性IFN-γ分泌影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 HIV/TB共感染目前流行情况 |
| 1.2 HIV/TB共感染诊断现状 |
| 1.3 免疫检查点分子PD-1和TIGIT在 HIV/TB共感染中的研究进展 |
| 1.4 免疫检查点分子PD-1和TIGIT抑制剂活性的检测方法 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 TIGIT及PD-1稳定表达细胞系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 实验仪器与设备 |
| 2.2.4 实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Lv-244-PD-1、Lv-244、Lv-201-TIGIT和 Lv-201 的载体构建 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 伪病毒颗粒生产 |
| 2.3.4 CHO-PD-1和CHO-TIGIT稳定细胞株构建 |
| 2.3.5 统计和分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 建立以磁珠为基础对TIGIT和PD-1抑制剂活性进行快速评价的新方法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 重组蛋白和磁珠 |
| 3.2.2 抗体 |
| 3.2.3 实验仪器与设备 |
| 3.2.4 实验试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组免疫检查点分子蛋白固定化磁珠的制备和评价 |
| 3.3.2 r CD155-Fc与TIGIT-Co磁珠和CHO-TIGIT细胞的结合优化 |
| 3.3.3 PD-L1-Fc与 PD-1-Co磁珠和CHO-PD-1细胞的结合优化 |
| 3.3.4 r PD-1-mo Fc与PD-L1-SA磁珠的结合优化 |
| 3.3.5 TIGIT-Co磁珠和CHO-TIGIT细胞评价TIGIT抑制剂活性方法 |
| 3.3.6 PD-L1-SA磁珠评价PD-1抑制剂活性方法 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 磁珠结合法测定TIGIT和PD-1抑制剂的活性示意图 |
| 3.4.2 免疫检查点分子重组蛋白在磁珠上固定效果评价 |
| 3.4.3 r CD155-Fc与TIGIT-Co磁珠或CHO-TIGIT细胞的结合 |
| 3.4.4 磁珠结合法和细胞结合法对两种TIGIT抑制剂活性进行检测 |
| 3.4.5 PD-L1-Fc与PD-1-Co磁珠和CHO-PD-1细胞的结合以及PD-1-moFc与PD-L1-SA磁珠的结合 |
| 3.4.6 磁珠结合法对两种PD-1抑制剂活性进行检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PD-1和TIGHT对 PBMC分泌TB特异性IFN-γ的影响研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 试剂与材料 |
| 4.2.3 实验仪器与设备 |
| 4.2.4 实验试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 人外周血单个核细胞(PBMC)分离 |
| 4.3.2 人外周血单个核细胞(PBMC)洗涤、计数与冻存 |
| 4.3.3 人外周血单个核细胞(PBMC)的复苏 |
| 4.3.4 流式细胞术分析PBMC中T细胞表面PD-1和TIGIT的表达 |
| 4.3.5 免疫酶联斑点法检测TB感染者及HIV/aTB合并感染者PBMC TB特异性IFN-γ分泌的影响 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 免疫检查点分子PD-1和TIGIT在健康志愿者、TB感染者和HIV/a TB合并感染者中T细胞表面表达的比较 |
| 4.4.2 联合应用TIGIT和 PD-1 抑制剂对IFN-γELISPOT检测TB单感染者和 HIV/a TB合并感染者PBMC TB特异性IFN-γ分泌的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）HLA限制性下结核重组重叠肽在结核诊断中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 结核病流行及临床症状 |
| 2 人类白细胞抗原 |
| 3 TB免疫机制 |
| 4 TB检测 |
| 5 TB治疗 |
| 6 TB疫苗研究现状 |
| 实验材料 |
| 1 感受态细胞、质粒、多肽 |
| 2 试剂及设备 |
| 3 主要试剂配置方法 |
| 实验方法 |
| 1 整体实验技术路线与蛋白制备流程 |
| 2 质粒提取 |
| 3 质粒转化 |
| 4 菌种活化 |
| 5 菌种发酵 |
| 6 收菌、湿菌洗涤、破菌 |
| 7 包涵体洗涤、包涵体变性、包涵体裂解 |
| 8 层析仪纯化 |
| 9 蛋白复性 |
| 10 ROP-TB蛋白去除内毒素 |
| 11 选取入组受试者 |
| 12 PBMC制备 |
| 13 ELISPOT检测 |
| 14 冻存细胞 |
| 15 数据统计分析与图形绘制 |
| 实验结果 |
| 1 重组质粒图 |
| 2 质粒测序结果图 |
| 3 IPTG诱导前后电泳结果图 |
| 4 收菌洗涤：上清、沉淀的电泳结果图 |
| 5 层析仪纯化蛋白 |
| 6 蛋白复性后ROP-TB电泳结果图 |
| 7 ROP-TB送出鉴定结果图 |
| 8 ELISPOT判读结果 |
| 9 受试者基本信息 |
| 10 TB受试者HLA分型结果 |
| 11 受试者HLA基因型分布与正常人对照组基因型分布差异分析 |
| 12 多肽与HLA基因型结果 |
| 13 受试者ELISPOT结果 |
| 14 结核混合肽、ROP-TB刺激点数分析 |
| 15 T-SPOT、ROP-TB ELISPOT两种检测方法分析 |
| 实验讨论 |
| 1 生物制备ROP蛋白与化学合成多肽结果讨论分析 |
| 2 HLAⅠ、Ⅱ类基因型讨论分析 |
| 3 ELISPOT检测结果讨论分析 |
| 4 HLA基因型与肽段反应的结果讨论 |
| 5 化学合成结核多肽、ROP-TB作为抗原检测TB的刺激点数分析 |
| 6 实验展望 |
| 实验结论 |
| 附录 |
| 附录 A 重组质粒测序结果图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）IL-7促进老龄小鼠T细胞免疫记忆及胸腺T细胞发育的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 IL-7促进老龄小鼠结核亚单位疫苗免疫产生长期免疫记忆 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 老龄化与结核病 |
| 1.1.2 结核亚单位疫苗 |
| 1.1.3 老年人接种疫苗的研究现状 |
| 1.1.4 衰老与记忆T细胞 |
| 1.1.5 免疫衰老与细胞因子水平 |
| 1.1.6 白介素7(IL-7)与免疫衰老 |
| 1.1.7 IL-7的应用 |
| 1.1.8 选题思路和研究内容 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要抗体 |
| 1.2.3 主要仪器和设备 |
| 1.2.4 主要使用的试剂盒 |
| 1.2.5 主要溶液配制 |
| 1.2.6 构建重组腺相关病毒 |
| 1.2.7 融合蛋白的制备及疫苗配制 |
| 1.2.8 动物饲养与疫苗接种 |
| 1.2.9 免疫检测 |
| 1.2.10 血清细胞因子谱检测 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 融合蛋白MH和LT29 的制备 |
| 1.3.2 r AAV-IL-7促进老龄小鼠抗原特异性记忆T细胞分泌细胞因子 |
| 1.3.3 r AAV-IL-7增强老龄小鼠抗原特异性CD4+T 细胞的增殖能力 |
| 1.3.4 r AAV-IL-7促进老龄小鼠血清中特异性抗体Ig G产生 |
| 1.3.5 r AAV-IL-7对免疫记忆分化相关细胞因子的调控 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 检测T细胞长期存活记忆T细胞(T_(CM))的方法 |
| 1.4.2 老龄小鼠接种疫苗后的长期免疫应答减弱 |
| 1.4.3 rAAV-IL-7促进老龄小鼠产生中央型记忆T细胞和持久免疫应答 |
| 1.4.4 rAAV-IL-7促进产生抗原特异性抗体 |
| 1.4.5 rAAV-IL-7促进老龄小鼠血清中IL-12p70和GM-CSF的水平升高 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 IL-7、Id3和Bcl6 促进小鼠产生结核亚单位疫苗长期免疫记忆 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 IL-7与免疫记忆 |
| 2.1.2 转录因子与记忆T细胞 |
| 2.1.3 选题思路和研究内容 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 抗体 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.2.4 主要使用的试剂盒 |
| 2.2.5 主要溶液配制 |
| 2.2.6 重组病毒载体的包装 |
| 2.2.7 融合蛋白的制备及疫苗配制 |
| 2.2.8 动物饲养与小鼠处理 |
| 2.2.9 免疫检测 |
| 2.2.10 IL-7和转录因子表达水平的检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 融合蛋白MH和LT70 的制备 |
| 2.3.2 重组IL-7腺相关病毒r AAV-IL-7在体内的表达 |
| 2.3.3 rAAV-IL-7辅助疫苗产生中央型记忆T细胞 |
| 2.3.4 rAAV-IL-7辅助结核亚单位疫苗产生长期免疫应答 |
| 2.3.5 IL-7调控免疫记忆分化相关转录因子Id3、Bcl6、Bach2和Blimp1表达 |
| 2.3.6 重组慢病毒rLV-Id3、rLV-Bcl6、rLV-Bach2和rLV-Blimp1 在体内的表达 |
| 2.3.7 过表达Id3和Bcl6 促进疫苗诱导产生中央型记忆T细胞 |
| 2.3.8 过表达Id3 和Bcl6 促进血清中特异性抗体产生 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 rAAV-IL-7促进产生中央型记忆T细胞和增强持久免疫应答 |
| 2.4.2 rAAV-IL-7促进转录因子Id3和Bcl6 的表达上调 |
| 2.4.3 过表达转录因子Id3和Bcl6 促进产生中央型记忆T细胞 |
| 2.4.4 rAAV-IL-7促进产生抗原特异性抗体 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 IL-7对老龄小鼠胸腺DN3细胞中DNA甲基化修饰的调节作用研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 衰老与胸腺退化 |
| 3.1.2 衰老与初始T细胞减少 |
| 3.1.3 IL-7在胸腺中的调控作用 |
| 3.1.4 IL-7减缓胸腺退化 |
| 3.1.5 表观遗传与DNA甲基化 |
| 3.1.6 衰老与DNA甲基化的相关研究 |
| 3.1.7 选题思路和研究内容 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 抗体 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.2.4 主要使用的试剂盒 |
| 3.2.5 主要溶液配制 |
| 3.2.6 实验动物 |
| 3.2.7 实验分组和处理 |
| 3.2.8 胸腺细胞的分选 |
| 3.2.9 RNA提取及RT-PCR |
| 3.2.10 DNA甲基化的检测 |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 rAAV-IL-7对胸腺和脾脏指数的影响 |
| 3.3.2 rAAV-IL-7促进老龄小鼠胸腺双阴(DN)细胞增殖 |
| 3.3.3 rAAV-IL-7调控老龄小鼠胸腺DN3细胞中甲基转移酶和去甲基化酶的表达 |
| 3.3.4 rAAV-IL-7促进DN3 细胞中Bcl2启动子区发生DNA去甲基化 |
| 3.3.5 rAAV-IL-7促进DN3 细胞中c-Myc启动子区DNA去甲基化 |
| 3.3.6 rAAV-IL-7促进老龄小鼠胸腺DN3细胞中Bcl2和c-Myc的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 rAAV-IL-7促进老龄小鼠胸腺DN细胞扩增 |
| 3.4.2 rAAV-IL-7调控DN3细胞中甲基转移酶(DNMTs)和去甲基化酶(TETs)的表达 |
| 3.4.3 rAAV-IL-7促进老龄小鼠DN3细胞中Bcl2启动子区DNA去甲基化及表达升高 |
| 3.4.4 rAAV-IL-7促进老龄小鼠DN3细胞中c-Myc启动子区DNA去甲基化及表达升高 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核病新疫苗研究进展 |
| 1.1.1 进入临床试验的结核病疫苗 |
| 1.1.2 结核病亚单位疫苗的候选抗原 |
| 1.2 ESAT-6 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 ESAT-6 蛋白概述 |
| 1.2.2 ESAT-6在Mtb致病性中的作用 |
| 1.2.3 ESAT-6 调控宿主固有免疫应答 |
| 1.2.4 ESAT-6 作为疫苗候选抗原的研究 |
| 1.3 亚单位疫苗的佐剂研究 |
| 1.4 细菌信号分子c-di-AMP在感染与免疫中的作用 |
| 1.4.1 c-di-AMP调节细菌的生理 |
| 1.4.2 c-di-AMP调节宿主固有免疫应答 |
| 1.4.3 c-di-AMP在疫苗佐剂中的应用 |
| 1.5 黏膜免疫 |
| 1.5.1 sIgA介导的体液免疫应答 |
| 1.5.2 黏膜局部的细胞免疫应答 |
| 1.6 本研究设想 |
| 第二章 耻垢分枝杆菌ESAT-6 敲除株的免疫学特性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 培养基及缓冲液 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sg RNA敲除质粒的构建 |
| 2.2.2 Ms的培养、计数与感受态制备 |
| 2.2.3 MsΔE6 敲除株的构建与鉴定 |
| 2.2.4 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.2.5 r Ms生长及抗酸特性检测 |
| 2.2.6 r Ms感染巨噬细胞模型建立 |
| 2.2.7 基因转录水平检测 |
| 2.2.8 蛋白表达水平检测 |
| 2.2.9 r Ms在巨噬细胞内的存活 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Ms ESAT-6与Mtb ESAT-6 氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 MsΔE6 突变株的构建与鉴定 |
| 2.3.3 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.3.4 rMs的生长及抗酸特性 |
| 2.3.5 rMs感染巨噬细胞诱导炎症因子的转录水平 |
| 2.3.6 rMs感染巨噬细胞诱导i NOS的转录水平 |
| 2.3.7 rMs感染巨噬细胞激活炎症小体 |
| 2.3.8 rMs感染诱导巨噬细胞自噬 |
| 2.3.9 rMs在巨噬细胞内的存活 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ESAT-6 在调节巨噬细胞固有免疫中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞系 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ESAT-6 蛋白纯化 |
| 3.2.2 BMDM的分离与诱导 |
| 3.2.3 Mtb培养与计数 |
| 3.2.4 巨噬细胞体外刺激 |
| 3.2.5 基因转录水平检测 |
| 3.2.6 蛋白表达水平检测 |
| 3.2.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.8 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 3.2.9 Mtb在巨噬细胞中的存活 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ESAT-6 蛋白的纯化 |
| 3.3.2 ESAT-6 诱导巨噬细胞I型 IFN应答 |
| 3.3.3 ESAT-6 调控巨噬细胞自噬 |
| 3.3.4 m TOR在 ESAT-6 调控自噬中的作用 |
| 3.3.5 IL-17在ESAT-6 通过m TOR调控自噬中的作用 |
| 3.3.6 ESAT-6 促进MH-S细胞炎症因子的释放 |
| 3.3.7 ESAT-6 抑制Mtb在 MH-S细胞内存活 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ESAT-6 亚单位疫苗的免疫学特性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 临床样本信息 |
| 4.1.2 伦理声明 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 细胞培养基 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.0 亚单位疫苗的制备 |
| 4.2.1 动物免疫策略 |
| 4.2.2 抗体水平检测 |
| 4.2.3 肺组织免疫细胞亚群分析 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.5 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 4.2.6 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 4.2.7 组织总RNA提取 |
| 4.2.8 呼吸道菌群分析 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 结核病患者血清特异性抗体水平 |
| 4.3.2 亚单位疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 4.3.3 亚单位疫苗诱导的脾脏细胞免疫应答 |
| 4.3.4 亚单位疫苗诱导的肺部细胞免疫应答 |
| 4.3.5 亚单位疫苗黏膜免疫对呼吸道菌群的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ESAT-6 亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与实验动物 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Mtb感染模型的建立 |
| 5.2.2 抗体水平检测 |
| 5.2.3 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 5.2.4 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 5.2.5 脏器荷菌数 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠Mtb感染后的体液免疫应答水平 |
| 5.3.2 免疫小鼠Mtb感染后脾淋巴细胞增殖 |
| 5.3.3 免疫小鼠Mtb感染后诱导的脾细胞因子分泌水平 |
| 5.3.4 免疫小鼠Mtb感染后脏器荷菌数 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于流感病毒样颗粒载体的结核亚单位疫苗LV20的制备与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结核病现状 |
| 1.2 结核病疫苗研究现状 |
| 1.3 病毒样颗粒的概述 |
| 1.4 结核疫苗评价免疫指标 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pFastBacDual载体改造 |
| 2.2.2 质粒的提取 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.4 PCR扩增HM DNA序列 |
| 2.2.5 PCR产物纯化 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶回收 |
| 2.2.7 酶切 |
| 2.2.8 连接 |
| 2.2.9 目的质粒的转化 |
| 2.2.10 转座筛选获得重组杆粒Bacmid-HM-MS |
| 2.2.11 重组杆粒Bacmid-HM-MS提取 |
| 2.2.12 重组杆粒的验证方法 |
| 2.2.13 P0 代杆状病毒的制备 |
| 2.2.14 P1 代杆状病毒的制备 |
| 2.2.15 LV20 的表达 |
| 2.2.16 LV20 的纯化 |
| 2.2.17 LV20 的鉴定 |
| 2.2.18 动物疫苗免疫程序 |
| 2.2.19 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.2.20 T细胞抗原特异性IFN-γ、IL-2 分泌水平的测定 |
| 2.2.21 ELISA检测血清中抗原特异性抗体的分泌水平 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 结核融合抗原HM |
| 3.2 目的基因的获取 |
| 3.3 pFastBacDual-HM-MS重组质粒的构建 |
| 3.4 重组杆粒Bacmid-HM-MS的鉴定 |
| 3.5 杆粒转染结果 |
| 3.6 LV20 的验证 |
| 3.6.1 抗LT21 抗原鼠多克隆抗体制备 |
| 3.6.2 Western blot验证结果LV20 |
| 3.6.3 电子显微镜观察病毒样颗粒组装情况 |
| 3.7 T细胞IFN-γ、IL-2 分泌水平 |
| 3.8 血清中抗原特异性抗体的分泌水平 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 4.1 重组杆粒Bacmid-HM-MS的构建 |
| 4.2 LV20 的表达、纯化和鉴定 |
| 4.3 LV20 免疫原性检测 |
| 4.4 研究展望 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10变态反应原的临床效用的评价及其相关统计方法研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 结核病的流行及预防 |
| 1.1 结核病流行现状 |
| 1.2 菌型鉴定的意义 |
| 1.3 结核病的发病机制 |
| 1.4 卡介苗的预防作用 |
| 2 结核病的辅助诊断方法 |
| 2.1 影像学诊断 |
| 2.2 痰涂片镜检 |
| 2.3 细菌培养 |
| 2.4 核酸扩增检测 |
| 2.5 全自动医用PCR分析系统 |
| 3 结核分枝杆菌感染的筛查方法 |
| 3.1 结核菌素皮肤试验 |
| 3.2 γ-干扰素释放试验 |
| 4 结核分枝杆菌特异性抗原的认识 |
| 4.1 差异区域1 |
| 4.2 结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6与CFP10 |
| 5 ESAT6与(或)CFP10蛋白作为皮试试剂的应用效果 |
| 5.1 单用ESAT6或CFP10蛋白作为皮试试剂的应用效果 |
| 5.2 联合使用ESAT6和CFP10蛋白作为皮试试剂的应用效果 |
| 第一部分 临床有效性的统计学评价方法研究 |
| 1 临床有效性的三臂检验 |
| 1.1 三种方法灵敏度的非劣效性检验及样本量的模拟 |
| 1.2 三种方法特异度的非劣效与优效三臂检验及样本量的模拟 |
| 2 临床有效性的检验方法研究 |
| 2.1 两种诊断方法灵敏度的比较 |
| 2.2 两种诊断方法的特异度比较 |
| 第二部分 EC变态反应原用于结核分枝杆菌检测的临床效用评价 |
| 1 临床试验设计 |
| 1.1 受试人群的入排标准 |
| 1.2 样本量的设计 |
| 1.3 编盲与随机 |
| 1.4 揭盲 |
| 1.5 受试人群分组及试验前相关检查 |
| 1.6 试验用药及T-SPOT检测 |
| 2 统计计划和分析 |
| 2.1 分析数据集的选择 |
| 2.2 统计分析方法 |
| 2.3 安全性评价方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床研究病例概述及受试者特征 |
| 3.2 EC皮试后阳性指标的判定标准 |
| 3.3 EC在不同人群中的阳性反应率 |
| 3.4 EC皮试、PPD皮试及T-SPOT检测的诊断学评价 |
| 3.5 EC、PPD和T-SPOT的诊断结果比较 |
| 3.6 EC皮试灵敏度和特异度的临床有效性评价 |
| 3.7 研究病例的安全性分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 临床有效性的三臂检验模拟代码 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 六种结核分枝杆菌蛋白抗原的诊断价值评价 |
| 前言 |
| 1. 实验材料与仪器 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂及试剂配制 |
| 1.3 主要仪器与耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 六种重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2 人外周血样本的采集 |
| 2.3 人外周血ELISPOT实验 |
| 2.4 人血清ELISA实验 |
| 2.5 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 六种重组蛋白的纯化结果 |
| 3.2 ELISPOT结果 |
| 3.3 ELISA检测结果 |
| 3.4 组合诊断价值分析 |
| 3.5 六种抗原相关分析 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 UspC蛋白的抗原性研究 |
| 前言 |
| 1. 实验仪器与试剂 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 主要试剂及试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Rv2318P克隆子构建及三种蛋白的表达纯化 |
| 2.2 Rv2318和Rv2318P蛋白的体外免疫学评价 |
| 2.3 小鼠免疫 |
| 2.4 小鼠处死及脾细胞分离 |
| 2.5 ELISA双抗夹心法检测脾细胞培养上清的细胞因子浓度 |
| 2.6 ELISA间接法检测小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度 |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 重组Rv2318和Rv2318P蛋白的大小及纯度 |
| 3.2 体外免疫学评价结果 |
| 3.3 抗原刺激后小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子水平 |
| 3.4 小鼠血清中的抗原特异性抗体滴度 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结核分枝杆菌感染免疫机制研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（9）结核分枝杆菌Rv1860、Rv0494及Rv1876蛋白在活动性结核病诊断中的临床应用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核应答特征及免疫保护机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 第一章 结核分枝杆菌脂蛋白Z在结核病诊断中的意义 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 人群样本收集 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法和步骤 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌蛋白的原核表达和纯化 |
| 1.2.2 结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ释放实验 |
| 1.2.2.1 PBMCs的分离 |
| 1.2.2.2 ELISPOT检测PBMCs中经抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞数 |
| 1.2.3 结核分枝杆菌抗原特异性抗体水平检测(间接法ELISA) |
| 1.2.4 结核分枝杆菌蛋白的Western Blot鉴定 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 检测对象及样本 |
| 1.3.2 结核分枝杆菌LppZ蛋白的原核表达、纯化和鉴定 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌LppZ抗原特异性细胞免疫水平及其诊断价值 |
| 1.3.4 结核病患者中LppZ抗原特异性IgA水平的筛查 |
| 1.3.5 结核病患者中LppZ 抗原特异性IgA水平与LppZ 抗原特异性释放IFN-γ细胞数的相关性分析 |
| 1.3.6 结核潜伏感染者中LppZ抗原特异性IgA水平的筛查 |
| 1.3.7 LppZ抗原特异性IgA水平作为TB和 LTBI人群筛查中辅助性指标的可行性分析 |
| 1.3.8 PPD阳性的HC中 LppZ特异性IgA水平升高的潜在临床意义 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核免疫保护作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法和步骤 |
| 2.2.1 小鼠免疫模型的建立 |
| 2.2.2 小鼠脾脏细胞分离 |
| 2.2.3 免疫小鼠脾脏抗原特异性IFN-γ分泌水平的检测 |
| 2.2.4 免疫小鼠脾脏中功能性T细胞分析 |
| 2.2.5 免疫小鼠抗原特异性体液免疫应答水平的检测 |
| 2.2.6 免疫小鼠M.tb攻毒模型的建立 |
| 2.2.7 小鼠肺局部抗原特异性细胞应答水平的检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 LppZ免疫小鼠脾脏细胞抗原特异性细胞免疫应答水平的检测 |
| 2.3.2 LppZ免疫小鼠脾脏抗原特异性多功能T细胞的检测 |
| 2.3.3 LppZ免疫小鼠抗原特异性体液免疫应答水平的检测 |
| 2.3.4 LppZ抗原免疫后抗结核感染保护作用的测定 |
| 2.3.5 LppZ抗原免疫后攻毒小鼠的肺局部淋巴细胞的细胞免疫应答水平的检测 |
| 2.3.6 LppZ抗原免疫后攻毒小鼠的肺局部多功能T细胞免疫应答水平的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核免疫保护作用的机制研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法和步骤 |
| 3.2.1 小鼠RAW264.7 巨噬细胞系的培养 |
| 3.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离和培养 |
| 3.2.3 小鼠巨噬细胞的刺激及表型和功能检测 |
| 3.2.4 小鼠背部皮下空泡(Air Pouch)模型的建立 |
| 3.2.5 MPO酶活检测 |
| 3.2.6 流式细胞术检测免疫细胞表型 |
| 3.2.7 ELISA检测上清中促炎因子水平 |
| 3.2.8 TLR受体阻断实验 |
| 3.2.9 WB检测TLR下游信号通路关键分子的磷酸化水平 |
| 3.2.10 WB检测巨噬细胞的自噬功能 |
| 3.2.11 胞内ROS水平检测 |
| 3.2.12 LppZ蛋白刺激小鼠巨噬细胞后的BCG菌清除功能分析 |
| 3.2.13 巨噬细胞胞内ECAR或 OCR水平的检测 |
| 3.2.14 巨噬细胞体外抗原提呈能力(APC)的检测 |
| 3.2.15 CBA法检测培养上清中Th1、Th2和Th17 型细胞因子水平 |
| 3.2.16 经LppZ蛋白处理的巨噬细胞的病毒抵抗性检测 |
| 3.2.17 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 LppZ抗原招募炎性细胞的功能检测 |
| 3.3.2 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 3.3.3 LppZ蛋白活化小鼠巨噬细胞的关键受体及其下游信号通路分析 |
| 3.3.4 LppZ蛋白刺激小鼠巨噬细胞后的BCG菌清除功能分析 |
| 3.3.5 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞胞内ROS水平的影响 |
| 3.3.6 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞ECAR/OCR水平的影响 |
| 3.3.7 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞胞内自噬发生的影响 |
| 3.3.8 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞表面共刺激分子及MHC-Ⅱ分子表达水平的影响 |
| 3.3.9 LppZ蛋白刺激对小鼠巨噬细胞抗原提呈能力的影响 |
| 3.3.10 LppZ诱导巨噬细胞抗病毒能力增强的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
四、应用ELISPOT试验测定重组卡介苗诱导的T细胞应答（论文参考文献）
- [1]旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌抗肿瘤效应研究[D]. 岳涛涛. 吉林大学, 2021(01)
- [2]PD-1与TIGIT分子对结核特异性IFN-γ分泌影响研究[D]. 傅羽佳. 山西大学, 2021(12)
- [3]HLA限制性下结核重组重叠肽在结核诊断中的作用[D]. 陶思雨. 大理大学, 2021(09)
- [4]IL-7促进老龄小鼠T细胞免疫记忆及胸腺T细胞发育的机制研究[D]. 韩江媛. 兰州大学, 2021(09)
- [5]结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用[D]. 宁唤唤. 西北大学, 2021(12)
- [6]基于流感病毒样颗粒载体的结核亚单位疫苗LV20的制备与免疫原性研究[D]. 谢涛. 兰州大学, 2021(09)
- [7]重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10变态反应原的临床效用的评价及其相关统计方法研究[D]. 张慧. 中国人民解放军空军军医大学, 2020
- [8]六种结核菌蛋白抗原的诊断价值及UspC蛋白的抗原性研究[D]. 李娜. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [9]结核分枝杆菌Rv1860、Rv0494及Rv1876蛋白在活动性结核病诊断中的临床应用研究[D]. 李琳雪. 遵义医科大学, 2020(12)
- [10]结核分枝杆菌脂蛋白Z抗结核应答特征及免疫保护机制研究[D]. 肖佳妮. 上海交通大学, 2020