一、Discovery of immune related factors in Fenneropenaeus chinensis by annotation of ESTs（论文文献综述）
姜松[1]（2021）在《斑节对虾适应低鱼粉蛋白性状的遗传参数估计及分子机制解析》文中进行了进一步梳理斑节对虾（Penaeus monodon）俗称草虾、虎虾等,具有单个个体大、产量高、养殖利润大等特点,是世界主要养殖的对虾品种之一,也是我国华南地区的主养对虾品种。近年来,由于鱼粉资源的全球范围内缺乏以及鱼粉价格的逐年攀升,斑节对虾养殖产业中饲料成本逐年加大,这严重压低了斑节对虾养殖的利润,制约了我国斑节对虾养殖业的发展。因此,利用遗传育种的方法,选育出适合粗饲料（饲料中含有的鱼粉蛋白较低）养殖的斑节对虾优良新品种系,对我国斑节对虾新产业的健康可持续发展有着积极的促进意义。遗传育种工作中,准确估计不同家系的育种值,是开展良种选育的基本保证。分析不同家系在不同养殖条件下的转录组特性及肠道菌群结构,估计选育家系经济性状的表型和内在分子机制相关性,是遗传育种工作中非常重要的研究内容,是开展优良品种选育的工作基础。本论文首先进行了不同含量的浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉对斑节对虾的影响试验,确定了最佳的浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉蛋白的含量;在此基础上,通过构建专门化家系,通过对家系进行生长性能的评估以及遗传参数的估计,获得优良家系;利用F1代核心育种群体,构建F2代家系并进行遗传参数评估和形态差异分析,计算了斑节对虾耐粗饲料新品系F2代的育种值并通径分析方法分析F2代表型数量性状间的相关性及其对体质量这一重要经济性状的贡献率;对筛选到的特定家系进行了不同饵料组间的转录组测序,获得了耐粗饲料性状相关基因的表达调控模式;进行了特定家系的肠道菌群分析,比较了不同饲料组间斑节对虾肠道特定菌群菌群及多样性特点。具体结果如下:（1）以斑节对虾（0.85±0.02g）为试验对象,进行8周的生长实验,研究饲料中浓缩脱酚棉籽蛋白部分替代鱼粉对斑节对虾生长性能、肌肉成分、饲料利用、肝胰腺消化酶和抗氧化能力及肠道性状的影响,以期确定斑节对虾配合饲料中浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉的适宜比例。根据斑节对虾营养需求,设计5种与对照饲料（饲料中鱼粉含量为30%）等氮等能饲料,饲料中浓缩脱酚棉籽蛋白用量分别为5%、10%、15%、20%、25%,分别替代16.67%、33.33%、50%、66.67%、83.33%的鱼粉,试验结果显示:在对虾饲料总蛋白含量充足的情况下,使用浓缩脱酚棉籽蛋白部分替代鱼粉,其生长未受到明显影响,使用20%浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉的试验组效果最好,其增重率、特定生长率、成活率、饲料干物质表观消化率、饲料系数分别为206.27±12.09%、2.01±0.14%、60.83±2.05%、62.03±5.38%、2.08±0.25%,增重率、特定生长率、存活率、饲料干物质表观消化率均与对照组差异不显着（P>0.05）,饲料系数显着低于对照组（P<0.05）。试验结果表明,使用66.67%的浓缩脱酚棉籽蛋白替代饲料中的鱼粉,斑节对虾的生长性能不受影响,这为进一步进行耐粗饲料斑节对虾新品种系的筛选奠定了数据基础。（2）利用试验一得到的最佳替代比例,制作了对照组（鱼粉含量为30%）和试验组（鱼粉含量为10%,浓缩脱酚棉籽蛋白含量为20%）两种饵料,以用36个斑节对虾家系为试验材料,开展了在两种不同蛋白水平饲料下的生长测试,试验时间为8周。结果显示:在相同饲料中,不同斑节对虾家系收获体质量存在显着差异,在绝对增重率方面,对照组和试验组两种饲料饲喂表现最优家系比最差家系分别高出97.16%和95.46%。对照组和试验组两种饲料饲喂下,斑节对虾平均存活率差异显着,分别为80.59%和77.88%。在生产性能方面,对照组和试验组中家系产量最高值比最低值分别高出100%和124.44%。10号和6号家系在不同饲料组中均排在前10%,具有较好的生产性能。试验的研究结果为耐粗饲料养殖的斑节对虾新品种选育奠定了数据和材料基础。（3）本研究建立了36个斑节对虾家系,每个家系选取150尾斑节对虾,在对照组（Diet A,鱼粉蛋白水平为30%）和试验组（Diet B,鱼粉蛋白水平为10%,浓缩脱酚棉籽蛋白水平为20%）两种饵料下混养56 d,分析体质量和存活性状的遗传参数以及G×E互作效应。斑节对虾在Diet A组的生长性能优于Diet B组。在正常鱼粉蛋白饲料组中,斑节对虾体质量遗传力估计值为0.53±0.12,在试验组中为0.39±0.09,属高遗传力;存活性状遗传力估计值分别为0.38和0.22,也表现为中高遗传力水平。两个饲料组间体质量和存活性状的G×E互作效应均表现为高度遗传相关（0.84-0.92）,G×E方差组分与加性遗传方差组分比值均小于0.5,G×E效应均不显着。研究结果表明,尽管斑节对虾的生长和存活性状在种饲料下存在一定差异,然而基因型与饵料条件的互作效应并不显着,由此认为在饲料鱼粉蛋白水平10%-30%的范围内,不需要针对不同的饵料条件建立不同的选育系。（4）采用全人工定向交尾方式,于2020年构建了15个斑节对虾第二代耐粗饲料品系的全同胞家系进行生长性状数据测定及遗传参数评估。斑节对虾生长性状的变异系数为11.52-47.53%,存在较高的遗传变异。斑节对虾F2代群体生长性状的遗传力范围为（0.25±0.03）-（0.41±0.13）,属中、高度遗传力。体长和体质量的遗传力分别为（0.38±0.11）和（0.41±0.13）。生长性状间遗传相关性的评估结果均为高度正相关,其中体质量和体长之间的遗传相关性最高,为0.99,头胸甲宽和第一腹节高的遗传相关性最低,为0.71。生长性状表型数据间均呈显着相关,属中、高度相关。综上:斑节对虾F2代群体具有较高的遗传改良潜力,采用家系选育结合个体选育可获得较好的选育效果;生长性状间呈高度遗传正相关,可选择将体长和体质量作为选育的重点性状纳入综合选择指数中,其余的生长性状通过正遗传相关可获得间接选育效果,最终提高其生产性能。（5）开展了不同鱼粉蛋白水平饵料对斑节对虾特异性家系转录组的影响研究。研究结果表明,在不同遗传背景下（家系间比较）,有586个基因差异表达,其中上调表达基因520个,下调表达基因66个。进一步分析,获得差异最显着的Top 10 GO注释条目。结果表明,差异富集基因最显着的基因群主要涉及“蛋白质转运”、“蛋白质消化吸收”、“脂质吸收”等生物过程,“钙离子结合活性”、“G蛋白偶联受体”等信号转导的相关分子功能,位于“胞外区”、“细胞连接”等细胞部位。显着富集的KEGG调控通路也多为集中在蛋白质转运相关,包括“钙通路”、“谷氨酸能突触传导”等方面。差异表达基因主要涉及信号转导通路中的相关受体、调控蛋白及亚单位,吸收渗透调节中的各类通道蛋白、转运体,应激应答设计各类调控因子及酶等。（6）利用Hi-Seq高通量测序技术及生物信息学分析等方法,构建不同鱼粉蛋白水平饵料下两个斑节对虾特异性家系肠道样品肠道菌群的基因测序文库,分析比不同鱼粉蛋白水平下斑节对虾肠道菌群生物丰富度及多样性差异。在属的水平下,不同饲料组中斑节对虾肠道菌群相对菌属分布情况存在差异,高鱼粉蛋白饲料组中斑节对虾肠道菌群相对丰度较高的菌属是醋酸杆菌（Cetobacterium）、幽门螺旋菌（Paeniclostrdium）和罗姆布茨菌（Romboutsia）等,而低鱼粉蛋白饲料组中丰度较高的菌属为肠杆菌（Enterovibrio）和假单胞菌（Plesiomonas）等。从不同家系间比较分析的结果来看,X家系斑节对虾肠道的优势菌门分别是变形菌门（58.23%）和厚壁菌门（31.75%）,其他菌门丰度较低（5.00%以下）,Y家系以拟杆菌门（57.12%）和梭杆菌门（22.54%）为主。X家系中与营养代谢和生长相关的厚壁菌门显着增加,通过提高肠道中厚壁菌门和变形菌门丰度,有望提高斑节对虾的消化吸收功能,提高对低鱼粉水平饲料的利用率。
刘光富[2]（2019）在《低温胁迫下福寿螺的生理反应和差异表达基因的筛选及功能研究》文中认为福寿螺是一种外来入侵生物,原产于南美洲亚马逊流域,现遍布于我国长江以南15个省（直辖市、自治区）的各个作物区,对水生作物危害严重。福寿螺对逆境的适应能力极强,对高温、低温和寄主等能较快地作出适应,尤其是对低温的适应是福寿螺向北扩散的生物学基础。因此,福寿螺低温适应性机理的研究已成为生物学界关注的热点,但目前对福寿螺低温适应性以及入侵扩散的分子机理研究较少,因此对其扩散和危害的预防还缺少理论和实践依据。本论文以福寿螺主要入侵危害种类Pomacea canaliculata为研究对象,采用抑制消减杂交（SSH:suppression subtractive hybridization）、斑点杂交（dot blot hybridization）,荧光定量PCR（qPCR）和RNA干扰（RNAi:RNA interference）等技术手段,从生理生化和分子生物学角度研究福寿螺对低温胁迫的响应,为预测和有效控制该有害生物的扩散奠定了理论基础。主要结果和结论如下:1.福寿螺越冬幼螺过冷却点（supercooling points,SCP）和低温胁迫研究表明,福寿螺越冬幼螺SCP与样本采集时的环境温度呈显着正相关,在最冷月（2月份）采集样本时的SCP达最低值。福寿螺过冷却点范围在-7.14℃～-6.74℃之间,平均值为-6.94℃。福寿螺越冬幼螺的低温耐受性随环境温度的降低而增强,且这种耐寒性可通过低温驯化得以提高。福寿螺SCP和结冰点（Freezing point）受其体型的影响,螺壳高在12.6-20.0mm的幼螺具有较低的过冷却点和结冰点,表明该生长期的福寿螺具有较高的耐寒性。2.福寿螺低温胁迫下抗氧化酶活性测定结果表明,抗逆相关的保护酶系统（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPX）在防御逆境对机体的伤害中起着重要的作用。随着低温胁迫时间的延长,福寿螺肝脏SOD、GPX和CAT活力均逐渐上升,在胁迫12h时达到最大值,随后逐渐降低。MDA（丙二醛）含量也随低温胁迫时间延长而逐渐上升,24h达到最大值,之后,随着胁迫时间进一步延长,MDA含量逐渐降低,但仍显着高于对照组（P<0.05）;Na+/-K+-ATPase酶活力随时间延长呈现先下降后上升的趋势,酶活力在胁迫24h时达到最低,其后酶活力有所升高,但在120h仍显着低于对照组（P<0.05）。低温胁迫下福寿螺体内SOD、CAT、GPX和Na+/-K+-ATPase的酶活力的变化以及MDA含量的的变化表明,上述几种酶参与了福寿螺低温胁迫应答过程,均可作为检测其应答低温胁迫的标志物。3.福寿螺越冬幼螺生理生化指标和代谢酶活性测定结果表明,福寿螺幼螺在越冬期的葡萄糖、甘油含量变化与过冷却点呈显着负相关,说明葡萄糖、甘油为越冬期福寿螺幼螺体内潜在的抗冻保护物质。糖原是福寿螺体内重要的能源物质,福寿螺越冬幼螺的糖原在越冬期大幅降低,越冬后期又恢复至越冬初期水平。越冬期间,幼螺含水率随着季节温度的下降而逐渐降低,含水率的最低值出现在平均温度为最低值的2月,随后,随着温度的回升而逐渐升高;福寿螺幼螺解除休眠,生理代谢作用逐渐增强,体内含水率逐渐上升。越冬期间,脂肪作为一种重要的能源储备,其含量先上升后下降。越冬期间福寿螺代谢酶（丙酮酸激酶PK,乳酸脱氢酶LDH,甘油激酶GK和三磷酸甘油脱氢酶GPDH）的活性变化存在季节性差异,丙酮酸激酶活性在越冬初期和越冬期显着增加,2月份达最大值,随后逐渐下降,5月份达到最低值。乳酸脱氢酶活性在10月份达最大值,进入越冬期后逐渐下降,翌年2月份最低,而后随着环境温度的升高而升高。甘油激酶和三磷酸甘油脱氢酶是生物体内甘油合成代谢的关键酶,9月份至1 1月份甘油激酶活性逐渐下降,12月份活性逐渐增加,翌年2月份达最大;三磷酸甘油脱氢酶活性在越冬期一直增强,翌年2月份达最大值,随后下降。这种季节性差异提示各个代谢酶在福寿螺幼螺体内可能具有调节耐寒能力的作用。4.构建了福寿螺幼螺低温胁迫SSH文库,利用反向Northern杂交筛选阳性克隆,共获得了 245条有效表达序列标签（EST）。对筛选到的245条EST进行拼接和聚类,共获得202条uniESTs。通过BlastX和BlastN分析,有95条ESTs序列与已知功能的基因序列相似,其余107条与未知功能的基因序列相似。对具有已知或推定功能蛋白的95条uniESTs进行blast2GO分析,初步明确95个uniESTs序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用,按功能将其分为抗逆性,糖类转运及代谢,能量运输、信号转导、转录后修饰和分子伴侣和酶活调控等。5.在ESTs分析基础上,利用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析了差减文库中具有代表性的4个推定的与低温胁迫相关的差异表达基因,分别为HSP70（Heat shock protein70）、GK（Glycerol kinase）、GPDH（glycerol-3-phosphate dehydrogenase）和 NKA（sodium/potassium-transporting ATPase）。结果显示,HSP70、GK、GPDH和NKA四个基因在低温胁迫下的表达量呈现规律性的变化,提示所选四个基因与福寿螺的低温耐受性有关,其整体表达模式与差减文库的筛选结果一致,表明SSH结果能够真实反映被检测基因的表达变化,结果准确可靠。6.利用RNAi技术和qRT-PCR对HSP70、GK、GPDH和NKA基因的功能进行研究。结果表明,注射靶基因的dsRNA能有效抑制福寿螺HSP70、GPDH、GK和NKA的表达,干扰后的福寿螺幼螺在低温胁迫下死亡率明显升高,表明福寿螺HSP70、GPDH、GK和NKA基因在调控幼螺耐寒性方面发挥着十分重要的作用。
王富轩[3]（2019）在《凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制》文中研究表明白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是引发对虾流行性疾病的两种主要病原微生物,系统开展对虾针对这两种病原的免疫响应特征研究是发展对虾病害防治技术的重要基础。本论文以凡纳滨对虾为研究对象,通过比较转录组分析其重要免疫组织包括血细胞（Hc）、淋巴器官（Oka）和肝胰腺（Hp）在WSSV和Vp免疫刺激早期的响应特征,以解析凡纳滨对虾不同免疫组织对不同病原早期响应的分子机制。研究结果不仅可丰富甲壳动物免疫学的基础理论,也可为对虾的健康养殖与病害防治提供新思路。具体进展如下:（1）对虾三种重要免疫组织在Vp和WSSV免疫刺激早期的转录组分析:通过Illumina测序获得1,288,985,148条clean reads;通过de novo组装,得到59,583条Unigenes,其中有17,721（29.74%）条有注释信息。GO富集分析发现,代谢过程（metabolic process）、细胞过程（cellular process）和单有机体过程（single-organism process）是富集基因最多的生物学过程;KEGG pathway 分析发现大量与免疫相关的通路,包括内吞（Endocytosis）、溶酶体（Lysosome）、吞噬体（Phagosome）和过氧化物酶体（Peroxisome）等,表明了三个组织的生物学功能与免疫密切相关;通过WGCNA分析,将基因划分成17个模块,为后续关键基因的挖掘提供了重要参考。（2）对虾血细胞对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp刺激前后的血细胞（VHc）转录组中获得2454个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中上调基因1935个,下调基因519个;从WSSV感染前后的血细胞（WHc）转录组中获得3444个DEGs,其中上调基因3240个,下调基因204个。GO富集分析显示,这两种病原刺激均影响了血细胞的RNA代谢（RNA metabolism）、细胞酰胺生物合成（amide biosynthetic process）及基因表达（gene expression）等生物学过程。KEGG pathway富集分析表明,真核生物核糖体的生物合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes）和氨酰 tRNA 的生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）通路在两种病原刺激时均显着富集,暗示血细胞的蛋白合成过程受到影响。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp和WSSV刺激引起对虾血细胞的代谢、翻译、内吞、转运、免疫及神经内分泌等多种生理过程的改变。特别地,WSSV感染显着激活了对虾血细胞介导的神经内分泌免疫系统,引起18种神经肽前体基因表达水平的明显上调,并广泛改变该系统的相关过程,涉及神经肽前体加工过程、氨基酸神经递质代谢过程、生物胺合成途径及乙酰胆碱信号通路。与WSSV感染不同,Vp刺激对神经内分泌免疫系统的影响相对较小,仅有四种神经肽前体及其加工相关基因发生变化。这是第一个有关甲壳动物血细胞介导的神经内分泌免疫系统参与免疫刺激响应的报道,为对虾疾病的防治提供了新的思路。（3）对虾淋巴器官对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp感染前后的淋巴器官（VOka）转录组中获得2127个DEGs,其中上调基因809个,下调基因1318个;从WSSV感染前后的淋巴器官（WOka）转录组中获得1569个DEGs,其中上调基因138个,下调基因1431个。GO富集分析显示,氨基聚糖代谢过程（aminoglycan metabolic process）在两种病原刺激时均显着富集,其中涉及到大量几丁质结合蛋白。KEGG pathway富集显示,溶酶体（Lysosome）通路仅在Vp刺激的转录组中显着富集,表明淋巴器官溶酶体在Vp刺激时入可能发挥重要的清除作用;而与碳水化合物代谢相关的三条通路,包括肌醇磷酸代谢（Inositol phosphate metabolism）、丙酸代谢（Propanoate metabolism）和糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）只在WSSV刺激的转录组中显着富集,表明WSSV刺激明显影响了对虾淋巴器官的代谢过程。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp和WSSV刺激均可影响淋巴器官的proPO激活系统、溶酶体、细胞外基质、细胞骨架蛋白、几丁质结合蛋白等。进一步,鉴定了两类特异性响应Vp刺激的关键免疫分子,包括组织蛋白酶和卵黄膜外层蛋白I,它们在受到Vp刺激时表达水平均明显上调,暗示了其在淋巴器官抗细菌免疫应答中的重要作用。（4）对虾肝胰腺对Vp和WSSV免疫刺激的早期响应特征分析:从Vp感染前后的肝胰腺（VHp）转录组中获得373个DEGs,而从WSSV感染前后的肝胰腺（WHp）转录组中仅获得86个DEGs。GO富集分析发现,丙酮酸代谢过程（pyruvate metabolic process）在Vp和WSSV两种免疫刺激下均显着富集。KEGG pathway分析显示,糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）通路在两个转录组中均显着富集,进一步证实了上述结果。另外,谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、药物代谢-细胞色素 P450（Drugmetabolism-cytochrome P450）和外源物质代谢-细胞色素 P450（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）也被显着富集,表明了肝胰腺的关键解毒功能。对差异表达基因的进一步分析与聚类发现,Vp刺激引起一些免疫相关基因发生明显变化,包括模式识别受体、丝氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶抑制剂等。另外,鉴定了一些转运及解毒相关的分子,如ABC转运体和细胞色素P450,它们可能在肝胰腺的免疫过程中扮演重要角色。（5）对虾重组激活基因和免疫致敏相关分子的鉴定:首次在对虾中鉴定了脊椎动物抗体基因重排过程中起关键作用的重组激活基因RAGs的同源基因,即LvRAG1L和LvRAG2L,它们在蛋白序列、表达模式及可变剪接等方面与几种已报道的高等无脊椎动物和头索动物RAGs具有明显的相似性,为RAGs的起源与进化提供新的分子证据。另外,鉴定了对虾中免疫致敏相关分子DSCAMs和FREPs,分析了它们的基因结构及对病原感染的响应特征,结果显示:对虾DSCAMs具有多个旁系同源基因,参与对免疫刺激的响应;对虾FREPs可能通过多个基因座、可变剪接来增加其多样性,且广泛参与对Vp和WSSV免疫刺激的响应。上述结果可为对虾免疫致敏的分子机制研究提供重要参考。
于杰伦[4]（2019）在《日本沼虾免疫应答相关基因的筛选与鉴定》文中认为日本沼虾（Macrobrachium nipponense）是我国淡水虾类养殖业中重要的养殖品种之一,分布广泛。环境胁迫是制约水产养殖业健康发展的重要因素之一,其中氨氮和亚硝酸盐是众多化学污染胁迫因子中最为普遍,也是对机体生理功能影响最为显着的水体胁迫因子。本研究首先对日本沼虾在亚硝酸盐胁迫（10.0 mg/L）和氨氮胁迫（22.1 mg/L）下的免疫指标进行了研究,发现肝胰腺作为主要免疫器官,在日本沼虾抗氨氮和亚硝酸盐胁迫中具有重要作用,且48小时是关键时间点,之后分别进行了转录组实验。在亚硝酸盐胁迫实验中,以亚硝酸盐胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建3个胁迫和3个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库;在氨氮胁迫实验中,以氨氮胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建2个胁迫和2个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库。文库分别利用高通量测序平台分析鉴定日本沼虾肝胰腺中与氨氮和亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因,对胁迫下与免疫相关通路进行分析,并对与免疫应答相关的差异表达基因进行分析验证。主要研究结果如下:（1）在浓度为10.0 mg/L亚硝酸盐胁迫下,肝胰腺、血液、肌肉、鳃的SOD、T-AOC活性和血液组织的PO活性都有不同程度的变化趋势。肝胰腺、血液、和鳃组织的SOD活性均呈下降趋势;肝胰腺和肌肉的T-AOC活性、PO活性的最高点均出现在48h时间点上。可见肝胰腺作为免疫器官,在机体抗亚硝酸盐胁迫中有重要作用,48h是日本沼虾抗亚硝酸盐胁迫下的关键时间点。（2）在浓度为22.1 mg/L氨氮胁迫下,肝胰腺、血液、肌肉、鳃的SOD、T-AOC活性和血液组织的PO活性和都有明显的变化。肝胰腺、血液、肌肉组织的SOD活性、肝胰腺和肌肉的T-AOC活性、PO活性的最高点均出现在48h时间点上;肝胰腺的SOD和T-AOC活性是四种组织中最高的。可见,肝胰腺在机体抗氨氮胁迫中有重要作用,48h是日本沼虾抗氨氮胁迫下的关键时间点。（3）亚硝酸盐胁迫转录组测序,通过测序平台对构建的6个转录组文库进行测序,GO注释分析后发现,unigenes主要富集在代谢过程、催化活性过程、结合过程和细胞组分。KEGG通路富集到5529个unigenes,其中富集最多的是核糖体通路,RNA转运通路和溶酶体通路。是一共有13960个unigenes注释到26个KOG组中,信号转导机制和一般功能预测是富集最多的组。（4）亚硝酸盐胁迫转录组测序共鉴定出825个差异表达基因,包括762个显着上调基因和63个显着下调基因。对差异基因的GO和KEGG富集分析显示,被显着富集的60条通路中,富集最多的是RNA转运通路、溶酶体通路和嘌呤代谢通路。在免疫相关通路中,主要富集的通路有溶酶体通路、甘油脂代谢通路、吞噬体通路和JAK-STAT信号通路等。（5）在亚硝酸盐胁迫的转录组数据中,经过筛选得到21个与免疫应答相关的差异表达基因,其中19个显着上调,2个显着下调。对21个差异基因进行聚类分析,发现明显聚成两类。21个差异表达基因富集最多的在溶酶体通路,其次是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路、精氨酸脯氨酸代谢通路和JAK-STAT信号通路。（6）对亚硝酸盐胁迫下筛选出的免疫应答相关通路和基因进行研究,通过对溶酶体通路和JAK-STAT信号通路上的差异表达基因进行研究发现,亚硝酸盐胁迫启动了免疫应答相关基因的表达;证明溶酶体通路、JAK-STAT信号通路和相关免疫应答基因在日本沼虾受亚硝酸盐胁迫时,对机体有一定的保护作用。（7）通过氨氮胁迫转录组测序,构建了4个转录组文库进行双末端测序,对每个转录组文库获得的raw reads进行转录拼接,对clean reads进行分析筛选,有2858个unigenes被五大数据库共同注释,对unigenes进行GO注释分析后发现,它们主要富集在代谢过程、细胞过程、单个有机体过程组分。（8）通过筛选,从对照组和胁迫组中一共得到56663个表达的基因（fpkm>0.3）。在两组中共同表达的基因有27466个。对差异表达基因的GO分析显示有344个差异表达基因富集在单一生物体过程,上调基因主要富集在细胞过程（193）,下调基因主要富集在代谢过程（188）。对差异表达基因的KEGG分析显示被显着富集的20条通路:补体和凝血级联通路、血小板激活通路和糖酵解/糖异生是被富集的子通路最多的三条通路。（9）在氨氮胁迫的转录组数据中,经过筛选得到44个与免疫应答相关的差异表达基因,包括23个上调基因,21个下调基因。对相关的差异表达基因进行聚类分析,发现明显的聚成两类。KEGG分析显示,主要富集到与免疫系统相关的补体和凝血级联通路、血小板激活通路、抗原处理和呈递通路等。（10）对氨氮胁迫筛选出的免疫相关通路和基因进行研究,发现补体和凝血级联通路是富集免疫相关差异基因最多的通路。对通路上的差异表达基因C3和CFI进行研究,发现氨氮胁迫启动了免疫应答相关基因的表达,证明在日本沼虾受氨氮胁迫时,机体启动了补体和凝血级联通路等对机体有保护作用的免疫应答通路。综上所述,通过对日本沼虾在氨氮胁迫（22.1 mg/L）和亚硝酸盐胁迫（10.0 mg/L）时的免疫指标的影响进行了研究。利用高通量测序平台分别分析鉴定日本沼虾肝胰腺中与氨氮和亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因,对胁迫下与免疫应答相关基因和信号通路进行分析,共检测到825个与亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因和887个与氨氮胁迫相关的差异表达基因,筛选出21个在亚硝酸盐胁迫下免疫应答相关的差异表达基因和44个在氨氮胁迫下免疫应答相关的差异表达基因。筛选出2个与亚硝酸盐胁迫下免疫相关的通路和富集在通路上的免疫关键基因,1个与氨氮胁迫相关的免疫调控通路和富集在通路上的免疫关键基因。这些分子水平的反应证实了所筛选出的与胁迫相关的差异表达基因和细胞信号通路,在日本沼虾抗氨氮和亚硝酸盐胁迫的保护机制中起着重要的作用。这些基因和通路可作为应激条件下日本沼虾自身防御反应的分子免疫学指标。本研究产生了大量的数据,这为今后进一步揭示虾的免疫防御机制奠定了基础,也为日本沼虾的免疫反应提供了新的思路;为培育抗氨氮和亚硝酸盐胁迫的新品种奠定了基础。
刘泓宇,谭北平,董晓慧,迟淑艳,杨奇慧[5]（2014）在《低盐胁迫下凡纳滨对虾鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建及差异ESTs分析》文中研究表明本研究以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为对象,分别以低盐度胁迫下（4 ppt）凡纳滨对虾鳃丝cDNA为检测子,正常海水中凡纳滨对虾鳃丝cDNA为驱动予,采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建了急性低盐胁迫诱导下凡纳滨对虾鳃丝消减cDNA文库。文库的重组率均高于95%,插入片段集中在250750 bp之间,随机测序后在线拼接得到15组片段重叠群和37个单一序列共52个非重复序列。同源检索发现30个非重复序列与GenBank中的已知基因序列有较高的相似性。按差异表达基因编码的蛋白具体功能可分为6小类,依次为:（1）离子通道及转运蛋白;（2）蛋白合成翻译及转录因子;（3）应激抗氧化因子;（4）能量代谢;（5）信号受体和转导;（6）细胞纤维及骨架蛋白,所占比例分别为23.3%、20.0%、20.0%、16.7%、10.0%和10.0%。经功能聚类分析发现文库中含有大量离子通道蛋白及功能转运酶、胞内信号传导分子、细胞骨架蛋白等渗透调节和应激适应性相关基因,表明急性低盐胁迫诱导凡纳滨鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建成功。
方旅平[6]（2017）在《度夏仿刺参腐皮综合征病原研究及伯麦罗弧菌诱导的SSH文库构建与ESTs分析》文中研究指明仿刺参[Apojtichopus japonicus,（Selenka,1867）]是我国海洋重要养殖经济动物,长期以来我国仿刺参养殖产业一直在北方地区开展,但目前仿刺参的人工养殖出现南移趋势,随着南方养殖规模的逐年扩大,养殖管理的不规范,导致仿刺参爆发病害,其中,腐皮综合征是目前南方仿刺参养殖过程中最常见的疾病。南方夏季水温高,仿刺参免疫力下降,此时最易发病,在病害爆发时可导致大规模个体死亡,严重威胁着我国南方仿刺参养殖产业。本研究致力于明确南移养殖度夏仿刺参腐皮综合征的病原菌,建立病原菌的快速鉴别技术;同时结合分子生物学技术研究腐皮综合征病原菌入侵仿刺参时的免疫防御机制,特别是分离腐皮综合征病原菌诱导下的差异表达基因,了解其表达模式,探讨腐皮综合征病原菌的诱导和免疫相关基因的关系,为克隆免疫相关基因创造条件,深入阐述仿刺参的免疫防御机制和培育抗病新品种奠定基础。主要结果如下:1.从患有腐皮综合征的度夏仿刺参上分离纯化获优势菌株,人工回接感染实验验证其为病原菌。利用注射感染和浸浴感染两种方式了解该病原菌对仿刺参的致病性,发现两种方式均能诱导发病,从而证明了本实验分离的菌株对仿刺参具有较强致病性。综合采用3种方法全面了解病原菌的特征并加以鉴定,确定该病原菌为伯麦罗弧菌（Vibrio pomeroyi Thompson etal,2003）。研究表明,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术准确、便捷、重复性高,非常适合于传统鉴定方法易混淆的弧菌种类鉴别,可作为病原菌快速鉴别的方法。2.将本次实验获得的伯麦罗弧菌菌株V.pomeroyiSUS与分离自巴西海域的V.pomeroyi LMG20537T（典型菌株）以及分离自彼得大帝湾的V.pomeroyi 929进行比较,结果表明来自不同海域的菌株对盐度和温度的耐受性与其生长的环境密切相关,表现出不同海域间的明显差异,其中采自夏季福建海域的V.pomeroyi SUS相对其他2个菌株对高温具有较好的耐受性;来自于巴西圣卡塔琳娜州盐度较高海域的的典型菌株V.pomeroyi LMG20537.T与另2株采集自盐度相对较低海域（福建莆田、彼得大帝湾）的菌株相比,对盐度具有较高的耐受性,能在含8%NaCl培养基上生长。3.采用抑制性消减杂交技术,以仿刺参体内承担主要免疫作用的体腔细胞为材料,构建了仿刺参经伯麦罗弧菌诱导的抑制性差减杂交cDNA文库。文库中的808个阳性克隆提取质粒后测序,共得到806条高质量序列,聚类后共获得318个unigene。对基因进行GO分类,发现GO分类为生物过程的unigene数量最多,细胞组分和分子功能的unigene数量比较持平。在细胞组分注释类别下,以细胞组成（cellpart）最多;在分子功能类中蛋白质结合功能（protein binding）最多;而在生物过程中,生物学调节过程（regulation of biological process）是包含差异基因最多的类别。4.据生物信息学分析结果,筛选出C型凝集素（contig116和contig17）、含铁蛋白（B07和H0 1）和血清样淀粉蛋白A（contig96）5个与免疫相关的ESTs。利用荧光实时定量PCR技术研究仿刺参5个ESTs在伯麦罗弧菌诱导下的差异表达,结果表明:C型凝集素由于种类不同,在病原菌诱导后在体腔细胞中随时间推移其表达量的变化模式不同;但在病原菌诱导后24h,两者在不同组织/器官中的表达分布模式比较一致,均在体腔细胞中表达量最高,体壁组织中表达量最低,contig17在体壁组织中甚至没有表达。血清淀粉样蛋白A在病原菌诱导后24h出现上调,48h转而下降,根据该蛋白的特性,我们可推断伯麦罗弧菌诱导48h后已不属于仿刺参对病原菌反应的急性期。含铁蛋白包括铁蛋白（B07）和核糖核苷酸还原酶（H01）,前者于病原菌诱导后在呼吸树中的表达量最高;后者则在体腔细胞中表达量最高,呼吸树次之。两者在病原菌诱导后时间序列上的表达模式也不同,铁蛋白在24h出现下调,而核糖核苷酸还原酶却在24h出现上调。可见含铁蛋白不仅具有氧的运输和电子转运功能,同时也与免疫防御息息相关。
王晓伟[7]（2013）在《调控拟穴青蟹卵巢发育的眼柄转录组学分析》文中指出拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国重要的经济养殖蟹种之一。近年来,其性腺发育调控机制的研究越来越受到重视。眼柄是甲壳动物重要的内分泌器官,其X器官-窦腺复合体（X-organ-sinus gland,XO-SG）合成和分泌的CHH家族神经肽调节生殖、蜕皮、摄食等多种生理过程。本研究通过454焦磷酸高通量测序技术,对青蟹雌雄眼柄转录组进行对比分析。在此基础上,筛选出与卵巢调控相关的ESTs,利用SMART-RACE等技术克隆获得甲壳动物高血糖激素3（crustacean hyperglycemic hormone-3,CHH3）、类卵黄发生抑制激素基因（vitellogenesis-inhibiting hormone-like,VIH-like）、G蛋白β1亚基（guanine nucleotide binding protein subunit beta-1,Gnb1）、酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ（14-3-3ζ）和MAP激酶活化蛋白激酶2（MAPK activated protein kinase 2,MK2）的cDNA序列全长。结果如下:1)通过454高通量测序技术获得了雌雄青蟹眼柄转录组,并进行了雌雄眼柄转录组的比较分析,获得雌性眼柄特异表达的转录子9897条,雄性眼柄特异表达的转录子21691条,雌雄眼柄共同表达的转录子6701条,其中4308条转录子差异表达。对部分转录子验证后,在雌雄眼柄中分别获得3条特异表达的转录子,11条转录子在雌性眼柄高表达,13条转录子在雄性眼柄高表达。2)本研究克隆获得青蟹卵巢发育调控相关的五个基因Sp-CHH3、Sp-VIH-like、Sp-Gnb1、Sp-14-3-3ζ及Sp-MK2的全长cDNA序列:Sp-CHH3的全长1671bp,其中开放阅读框（open reading frame,ORF）为375bp,编码124个氨基酸;Sp-VIH-like的全长479 bp,其中ORF为306 bp,编码102个氨基酸;Sp-Gnb1全长1487bp,其中ORF为1023bp,编码340个氨基酸;Sp-14-3-3ζ全长1092bp,其中ORF为747bp,编码248个氨基酸;Sp-MK2全长1899bp,其中ORF为1095bp,编码364个氨基酸。3)对Sp-VIH-like、Sp-Gnb1、Sp-14-3-3ζ、Sp-ERK2和Sp-MK2基因进行了实时荧光定量PCR分析,进一步了解它们在成熟期各组织的表达水平差异,以及在卵巢发育过程中它们在卵巢和眼柄中的表达量变化。结果显示,Sp-VIH-like基因在眼柄中呈特异性表达,在被检测的其他组织中未发现Sp-VIH-like基因。Sp-Gnb1和Sp-14-3-3ζ在卵巢的表达量显着高于其他组织。Sp-VIH-like基因在眼柄中的表达量从卵巢发育第Ⅲ期开始下降,直至第Ⅴ期;Sp-Gnb1、Sp-14-3-3ζ、Sp-ERK2及Sp-MK2基因在眼柄中的表达量均随卵巢的发育逐渐增加。Sp-14-3-3ζ和Sp-MK2基因在卵巢的表达量随卵巢的发育呈先升高后降低的趋势;Sp-Gnb1在卵巢发育过程中表达较为稳定,未出现显着变化。
肖丽萍[8]（2013）在《Real-time Q PCR芯片研究有机锡致鲍性畸变的分子机制》文中进行了进一步梳理以本实验室自建杂色鲍（Haliotis diversicolor）TBT暴露及副溶血弧菌诱导的ESTs数据库和鲍NCBI数据库为基础,经过生物信息学软件筛选获得性腺发育及应激诱导相关的基因序列150个,其中140个可归类于GO数据库中的细胞组分、生物学过程和分子功能。采用体内注射1μg/g（wt）TBT和TPT,分别暴露6h、24h、48h后解剖鳃、外套膜、性腺和肝胰腺组织作为材料,提取总RNA,利用q RT-PCR方法研究6个候选内参基因的表达变化和稳定性,鉴定有机锡暴露过程用于m RNA表达分析的内参基因,随后通过引物设计和验证,得到可采用的杂色鲍性腺发育及应激诱导相关基因共109个,筛选64个候选基因再运用q RT-PCR方法进一步对各基因进行表达分析,获得在不同组织和不同时相对TBT和TPT响应的基因共36个,最终选择了2个内参和30个效应基因构建了Real-time Q PCR芯片,具体结果如下:1)运用Ge Norm、Norm Finder和Ref Finder程序分析在不同有机锡暴露6h、24h、48h后鳃、性腺、肝胰腺和外套膜组织样品中ACT、18S r RNA、28S r RNA、ELFA、RPL8（ribosomal protein L8）、TUA（tubulin alpha）6个内参基因的表达稳定性,结果表明,杂色鲍在有机锡暴露后,ELFA可作为鳃、性腺以及所有样本组织中的最适内参,而18S和ACT分别作为肝胰腺和外套膜组织中的内参更合适,并用于校正和标准化之后的Real-time Q PCR芯片数据;同时,经过各内参基因校正来分析RXR基因在有机锡暴露6h后性腺组织中的表达情况,结果表明,在特定试验条件下,最适内参的筛选对于基因表达分析非常关键。2)运用q RT-PCR方法研究杂色鲍性腺发育及应激诱导相关基因对不同有机锡暴露的响应,筛选得到不同有机锡暴露、不同组织、不同时相中存在着显着性变化（P≤0.05）的基因36个。这些基因主要可分为免疫相关、解毒代谢相关和细胞周期相关共三类,其中与免疫相关的基因有10个:巨噬细胞表达蛋白1（MEP1）、胸腺肽（TMSB）、Ras相关核蛋白（Ran）、白介素1受体相关激酶4（IRAK4）、Ring-box蛋白（RBX）、组织蛋白酶L2（CTSL2）、高速泳动蛋白（HMG1）、激素原转换酶1（PC1）、胞嘧啶脱氨酶（CDA）、吲哚胺加双氧酶外显子1-13（IDO1-exon）。与解毒代谢相关的基因有5个:细胞色素氧化酶亚基III（COXIII）、细胞色素C氧化酶多肽5B（COX5B）、谷胱甘肽S转移酶亚型（GST-iso）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、金属硫蛋白（MT）。与细胞周期相关的基因有21个:硫氧还蛋白（TRX）、DHHC型锌指蛋白（ZDHHC）、锌指蛋白1（ZFP1）、血蓝蛋白（Ab Hc）、钙网素（CAM）、钙调蛋白2（CAM2）、钙调蛋白-等位基因31（Calp31）、钙调蛋白-等位基因39（Calp39）、斯钙素/锡钙蛋白（STC）、细胞周期与凋亡调控因子1（CARP-1）、转录因子AP-4（TFAP4）、诱导转化生长因子（β-ig-h3）、真核起始因子3亚基4（IF3-4）、CCR4-NOT转录复合体亚基4（CNOT）、核糖体蛋白S20（RPS20）、核糖体蛋白L7（RPL7）、非ATP酶蛋白酶体26S亚基10（PSMD10）、泛素结合酶（UBI）、CCAAT增强子结合蛋白（CEBP）、精氨酸/丝氨酸丰富剪接因子4（SRSF4）、视黄酸X受体（RXR）。众多的细胞周期相关基因21个以及多重功能基因5个（总共26个,占总效应基因的72.2%）的变化,表明有机锡暴露显着改变了杂色鲍细胞分化和细胞凋亡等重要细胞过程,极可能引起雌性性腺组织细胞的凋亡和重编程,诱导性畸变。3)选择具有显着性差异表达的21个细胞周期相关基因、5个解毒代谢相关基因和4个免疫相关基因以及2个内参ELFA和ACT,共32个基因建成杂色鲍性腺发育及环境应激相关基因的Real-time Q PCR芯片,可为海洋环境生物监测特别是底栖动物生境的分子生物标志物和毒理芯片的进一步建立奠定基础,并为重要水产经济鲍资源保护提供理论依据。
隗健凯,柳承璋,张晓军,王兵,董波,李富花,相建海[9]（2013）在《基于中国明对虾不同组织EST数据的基因表达差异分析》文中研究指明对前期获得的中国明对虾头胸部、血液、眼柄、卵巢4种组织的EST测序数据进行了生物信息学挖掘和分析。4种组织的原始EST序列分别为10 446条、2 690条、1 067条和1 282条,通过聚类拼接得到unigene 3 454条、1 053条、406条和544条,对其进行了NR、GO、KEGG等数据库的功能注释,并在此基础上进行了组织差异分析。通过同源比对的方法找出了各组织特异的转录本,并根据注释信息将其进行了GO功能分类。结果显示,血液组在细胞杀伤、迁移和节律等功能分类上特异性富集;眼柄组在色素生成、信号传递和生物学调控等功能分类上特异性富集;卵巢组在营养贮存运输、繁殖和定位等功能分类上特异性富集。拼接时聚类到一起的EST数目在一定程度上可以代表基因的表达量,据此对各组织的高表达基因进行了分析。结果显示,peritrophin、elongation factor 1-alpha、thrombospondin和arginine kinase 4个基因在组织中分布较为广泛且表达量高,提示其可能参与对虾多种重要的生物学过程。而在血液组中注释到的高表达基因还包括penaeidin、cytochrome c oxidase和14-3-3 like protein基因,在眼柄组中注释到的高表达基因还包括arrestin和rhodopsin基因。此外,为了解各组织共有基因的差异表达情况,对peritrophin和peroxiredoxin进行了分析,发现了peritrophin基因的多形式和高表达现象。
薛淑霞[10]（2013）在《凡纳滨对虾抗对虾白斑综合症病毒感染研究》文中研究说明近20年来,对虾白斑综合症病毒病一直是业内研究的热点。从最初的形态学观察,到各种抗病毒免疫相关基因的鉴定,都倾注了研究者们的大量心血。但是到目前为止这个“谜团”似乎还没有揭开的迹象。我们认为免疫反应是一个交互作用的复杂过程,只有从组学的角度上阐释对虾和病毒相互作用的分子机制,深入了解对虾的抗病毒免疫机理,才能有的放矢地控制病毒的发生与流行。测序技术的飞速发展为我们想法的实现提供了一个良好的平台。基于Illumina/Solexa高通量测序平台的转录组测序技术能够对任意物种的整体转录组情况进行检测,发现未知和稀有转录本,提供最全面的转录组信息；数字基因表达谱技术能够分析不同处理状态下的基因表达水平。与传统的测序技术相比,Illumina/Solexa测序技术具有高通量,快速和准确等特点。本研究以感染WSSV的凡纳滨对虾血淋巴为研究对象,应用Illumina/Solexa高通量测序技术对血淋巴的转录组进行深度测序。使用短序列组装软件SOAPdenovo对测序结果进行从头组装,建立凡纳滨对虾血淋巴转录组数据库；将转录组数据与nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等数据库进行序列比对、功能注释和代谢通路分析；利用数字基因表达谱技术对WSSV感染早期和晚期的差异表达基因进行筛选；并筛选了部分基因做功能鉴定。取得的结果和结论如下：1、转录组测序共获得2,581多万条90bp的高质量配对短序列。采用短序列组装软件SOAPdenovo进行序列组装,共获得52,073条unigenes,平均长度为520nt,N50值为745nt,测序质量评价结果表明,除了3’端和5’端存在少量reads外,其它reads的分布都相对均一。该研究成果极大地丰富了凡纳滨对虾转录组数据库,为发现新基因及分析差异表达基因奠定了坚实的基础。2、在组装获得的52,073条unigenes中,有23,568条unigenes可以注释到四个数据库；通过GO功能注释,共有6,562条unigenes被归类到50个功能分类中,这些功能分类主要涉及代谢相关,生长和发育调控,凋亡,生物合成,免疫防御,分子加工,信号传导及转录调节等；通过COG功能分类,共有7,822条unigenes被归类到25个功能类别中；通过KEGG代谢通路分析,共有14,941条unigenes注释到240个信号通路中；CDS预测表明有20,689条unigenes可以预测到蛋白编码框,其余未被预测到蛋白编码框的序列用ESTscan软件进行编码区预测,结果表明有5,669条可能为新的蛋白编码序列；KEGG分析显示有963条unigenes被显着富集到各个免疫相关的信号通路中,如泛素介导的蛋白酶水解通路,MAPK信号通路,jak-STAT信号通路和钙代谢信号通路等；从被注释到的基因中筛选到约有1,179条unigenes与其它物种的免疫相关基因具有相似性。由以上结果我们可以推测对虾的抗病毒免疫系统是一个由多个因子参与,涉及多个信号通路的复杂的生物反应过程。3、利用DGE测序技术,分别对LO样品（对照样）,L1样品（WSSV感染后5h样品）和L2样品（WSSV感染后48h）进行分析,三个样品均获得约6千万条高质量的表达序列标签；通过测序质量分析,测序饱和度和均一度评价,基因覆盖度分析,表明所获得的tags可以用作进一步的差异表达基因分析；将三个样本的tags比对回转录组,比较分析发现在病毒感染的早期,仅有315个差异表达基因,包括227个上调表达基因和88个下调表达基因；而在病毒感染的晚期,共有4,226个差异表达基因,包括2506个上调表达基因和1720个下调表达基因；GO功能注释表明,这些差异基因分别富集到不可溶解部分,肽酶活性和细胞氨基酸代谢过程等GO条目中；KEGG代谢通路分析表明,病毒感染晚期的差异表达基因大多富集到细胞外基质受体相互作用,补充和凝固级联,抗原加工和递呈等信号通路中；qRT-PCR实验验证表明所选四个基因的表达模式与DGE的测序结果趋势一致。通过以上分析结果我们可以得知,在病毒感染的早期,对虾的免疫反应是迟缓的,而在病毒感染的晚期,对虾的免疫系统才被充分激活。4、在转录组和数字基因表达谱测序结果分析的基础上,选取18个免疫相关基因,通过分析在严重感染频死的对虾血淋巴中这些基因的表达情况,筛选出6个表达量与对照组具有显着性差异的基因。其中胰凝乳样丝氨酸蛋白酶基因显着上调表达,其余五个基因包括热激蛋白70,对虾肽,粘性因子,增殖细胞核抗原和Argonaute显着下调表达；体外合成胰凝乳样丝氨酸蛋白酶的双链RNA,通过注射方法沉默该基因的表达,沉默效率实验表明在注射双链RNA24h后该基因即被沉默表达。沉默表达CH-SPase基因后,注射感染WSSV,发现实验组的对虾死亡率比对照组显着下降。病毒的拷贝数和VP28的表达量都相应降低。提示该基因在病毒侵染过程中起到了协助WSSV入侵的作用。
二、Discovery of immune related factors in Fenneropenaeus chinensis by annotation of ESTs（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Discovery of immune related factors in Fenneropenaeus chinensis by annotation of ESTs（论文提纲范文）
（1）斑节对虾适应低鱼粉蛋白性状的遗传参数估计及分子机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 水产动物育种值估计研究 |
| 1 育种值及其在育种中的重要性 |
| 2 育种值的估计方法 |
| 第二节 水产动物饲料蛋白质需求进展研究 |
| 1 水产饲料中动植物蛋白源替代鱼粉研究 |
| 2 饲料中蛋白质的转化效率 |
| 3 水产动物低鱼粉饲料蛋白产业未来的发展方向 |
| 第三节 高通量测序技术在水产动物研究中的应用 |
| 1 转录组学在水产生物疾病与免疫中的研究现状 |
| 2 转录组学在水产生物生殖与发育中的研究现状 |
| 3 转录组学在水产生物生长与营养中的研究现状 |
| 4 转录组学在水产生物毒理与抗逆中的研究现状 |
| 第四节 水产生物肠道菌群的研究 |
| 1 生物肠道菌群来源及其作用 |
| 2 水生生物肠道微生物组在水产养殖中的重要性 |
| 3 影响水生生物肠道微生物的因素 |
| 4 水生生物肠道微生物群的生理和免疫作用 |
| 第五节 本研究的目的与意义 |
| 第二章 浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉对斑节对虾的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验饲料 |
| 2.2 试验管理 |
| 2.3 样品采集及指标测定 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白源替代对对虾生长及饲料利用的影响 |
| 3.2 浓缩脱酚棉籽蛋白替代部分鱼粉对斑节对虾肌肉成分的影响 |
| 3.3 浓缩脱酚棉籽蛋白替代鱼粉对斑节对虾消化酶活力和抗氧化能力的影响 |
| 3.4 浓缩脱酚棉籽蛋白替代部分鱼粉对斑节对虾肠道组织的组织学影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 浓缩脱酚棉籽蛋白替代部分鱼粉对斑节对虾家系生长和存活的比较研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 数据采集与处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同饲料组中斑节对虾生长性状的表型参数 |
| 3.2 斑节对虾家系在不同饲料组中生长性能比较 |
| 3.3 斑节对虾家系存活情况 |
| 3.4 斑节对虾家系生产性能 |
| 4 讨论 |
| 第四章 浓缩脱酚棉籽蛋白替代部分鱼粉饲料下斑节对虾生长和存活性状遗传评估 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生长性状统计 |
| 3.2 不同饲料组斑节对虾体质量和存活率的遗传参数和G×E效应 |
| 4 讨论 |
| 第五章 斑节对虾耐粗饲料选育品系F2 代生长性状的遗传参数评估 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 亲本交配及催产 |
| 2.2 幼体培育及标记 |
| 2.3 生长性状数据采集 |
| 2.4 数据处理及统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 斑节对虾生长性状数据统计 |
| 3.2 生长性状表型相关及曲线拟合 |
| 3.3 生长性状遗传参数及相关分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生长性状的遗传变异差异 |
| 4.2 生长性状的表型相关性及生长特点 |
| 4.3 生长性状的多性状遗传参数评估 |
| 第六章 不同鱼粉蛋白水平饲料组间斑节对虾转录组分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 斑节对虾家系构建及特异性家系的筛选 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 RNA-Seq文库的制备与组装 |
| 2.4 基因的功能注释 |
| 2.5 DEGs的鉴定及富集分析 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 转录组测序及组装 |
| 3.2 基因功能及Nr数据库注释 |
| 3.3 GO功能注释 |
| 3.4 KEGG富集分析 |
| 3.5 差异基因统计 |
| 3.6 重要功能基因的筛选 |
| 4 讨论 |
| 第七章 不同鱼粉蛋白水平饲料组间斑节对虾肠道菌群分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 斑节对虾家系构建及特异性家系的筛选 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 细菌总 DNA 提取及多样性分析 |
| 2.4 生物信息分析流程 |
| 3 结果 |
| 3.1 质检结果与分析 |
| 3.2 OTU聚类分析 |
| 3.3 OUT韦恩图 |
| 3.4 两个饲料组下斑节对虾肠道菌群门水平菌落结构的影响 |
| 3.5 物种丰度聚类热图 |
| 3.6 Alpha多样性分析 |
| 3.7 Beta多样性分析 |
| 3.8 组间差异统计分析 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录:博士期间学术成果 |
| 致谢 |
（2）低温胁迫下福寿螺的生理反应和差异表达基因的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 福寿螺的危害与入侵机制 |
| 1.1.1 福寿螺的危害 |
| 1.1.2 福寿螺对温度的生态适应机制 |
| 1.1.3 温度对福寿螺存活以及分布的影响 |
| 1.1.4 福寿螺耐寒性 |
| 1.2 抑制消减杂交技术原理及应用 |
| 1.2.1 抑制消减杂交技术(SSH) |
| 1.2.2 抑制消减杂交技术和其他差异基因表达分析技术比较 |
| 1.2.3 SSH技术在基因功能研究中的应用 |
| 1.3 RNA干扰技术及其应用 |
| 1.3.1 RNA干扰技术 |
| 1.3.2 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 |
| 1.4 总体思路、研究意义、主要内容和技术路线 |
| 1.4.1 总体思路和研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 福寿螺过冷却点及耐寒性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试福寿螺 |
| 2.1.2 实验仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 福寿螺过冷却点和结冰点的测定 |
| 2.2.2 福寿螺越冬幼螺低温死亡率检测 |
| 2.2.3 不同越冬期福寿螺幼螺耐寒性的季节性差异 |
| 2.2.4 福寿螺不同组织的耐寒能力检测 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同螺高福寿螺的过冷却点和结冰点 |
| 2.3.2 不同季节采集福寿螺过冷却点及结冰点测定 |
| 2.3.3 福寿螺越冬幼螺低温死亡率 |
| 2.3.4 不同越冬期福寿螺幼螺耐寒性的季节性差异 |
| 2.3.5 福寿螺不同组织的耐寒能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 福寿螺在低温胁迫下的抗氧化反应研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试福寿螺 |
| 3.1.2 实验分组及材料处理 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 主要试剂(盒) |
| 3.1.5 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 低温驯化 |
| 3.2.2 样品制备 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 低温胁迫福寿螺肝脏MDA含量的测定 |
| 3.3.2 Na+/-K+-ATPase酶活力测定 |
| 3.3.3 保护酶活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 低温胁迫对福寿螺肝脏抗氧化酶活力的影响 |
| 3.4.2 低温胁迫对福寿螺肝脏Na+/-K+-ATPase活力的影响 |
| 3.4.3 低温胁迫对福寿螺肝脏MDA含量的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 福寿螺在低温胁迫下的生理生化研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试福寿螺 |
| 4.1.2 实验分组及材料处理 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 水分和脂肪含量的测定 |
| 4.2.2 甘油含量的测定 |
| 4.2.3 葡萄糖和糖原含量的测定 |
| 4.2.4 福寿螺幼螺糖代谢酶系酶活性测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 福寿螺含水量 |
| 4.3.2 福寿螺幼螺甘油、糖原、葡萄糖和脂肪含量 |
| 4.3.3 福寿螺幼螺糖代谢酶系酶活性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 低温胁迫下福寿螺差异表达基因的筛选 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试福寿螺 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 RNA提取 |
| 5.2.2 SSH文库的构建 |
| 5.2.3 文库鉴定 |
| 5.2.4 斑点杂交(差异表达基因的反向Northern分析) |
| 5.2.5 质粒的提取与测序 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 RNA质量测定 |
| 5.3.2 cDNA的合成 |
| 5.3.3 RsaI酶切结果 |
| 5.3.4 接头连接效率 |
| 5.3.5 差减cDNA文库消减效率 |
| 5.3.6 差减PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.7 文库容量 |
| 5.3.8 插入片段质量检测 |
| 5.3.9 斑点杂交筛选阳性克隆 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 福寿螺低温胁迫过程中差异表达基因分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验材料:低温胁迫下福寿螺抑制消减杂交文库(第五章) |
| 6.1.2 生物信息学分析软件及数据库 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 EST测序 |
| 6.2.2 序列注释 |
| 6.2.3 候选基因的RT-PCR验证 |
| 6.2.4 荧光定量PCR验证 |
| 6.2.5 高表达Unigene数据的功能鉴定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.2 ESTs测序结果分析 |
| 6.3.3 ESTs序列功能的分类注释和分析 |
| 6.3.4 序列注释及蛋白编码框的识别 |
| 6.3.5 候选基因的RT-PCR验证 |
| 6.3.6 定量PCR分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 福寿螺幼螺耐寒相关基因的干扰表达及功能 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 供实福寿螺 |
| 7.1.2 仪器和试剂 |
| 7.1.3 dsRNA模板的制备 |
| 7.1.4 福寿螺耐寒候选基因 |
| 7.1.5 dsRNA注射 |
| 7.1.6 RNA干扰结果鉴定 |
| 7.1.7 数据分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 含T7引物的PCR扩增 |
| 7.2.2 dsRNA的合成 |
| 7.2.3 dsRNA处理对候选基因表达的影响 |
| 7.2.4 候选基因的dsRNA处理对福寿螺幼螺低温耐受性的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 本研究的创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 对虾常见病害 |
| 1.2.1 白斑综合征 |
| 1.2.2 急性肝胰腺坏死病 |
| 1.3 对虾的免疫防御机制 |
| 1.3.1 模式识别 |
| 1.3.2 免疫信号通路 |
| 1.3.3 RNA干扰 |
| 1.3.4 酚氧化酶原激活系统 |
| 1.3.5 细胞免疫 |
| 1.3.6 其他重要免疫分子 |
| 1.4 免疫致敏与免疫记忆 |
| 1.5 转录组测序技术及其在非模式物种中的应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第2章 凡纳滨对虾免疫样品的制备及转录组测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 病原制备 |
| 2.2.4 病原注射及样品收集 |
| 2.2.5 总RNA的提取 |
| 2.2.6 文库构建与二代测序 |
| 2.2.7 转录组数据的分析 |
| 2.2.8 WGCNA分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 数据质控 |
| 2.3.2 组装统计 |
| 2.3.3 差异分析 |
| 2.3.4 基本注释 |
| 2.3.5 WGCNA分析 |
| 2.3.6 小结 |
| 第3章 凡纳滨对虾血细胞响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 半定量PCR |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 3.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 3.3.3 参与血细胞免疫刺激的差异表达基因的深入分析 |
| 3.3.4 血细胞神经内分泌免疫系统在WSSV感染早期的激活 |
| 3.3.5 小结 |
| 第4章 凡纳滨对虾淋巴器官响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 4.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 4.3.3 参与淋巴器官免疫过程的差异表达基因的深入分析 |
| 4.3.4 小结 |
| 第5章 凡纳滨对虾肝胰腺响应不同病原刺激的表达特征分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 实时荧光定量PCR |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 差异表达基因统计与验证 |
| 5.3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 5.3.3 免疫相关基因的深入分析 |
| 5.3.4 小结 |
| 第6章 凡纳滨对虾重组激活基因和免疫致敏相关分子的初步探究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂与仪器 |
| 6.2.2 实验动物 |
| 6.2.3 对虾组织及发育时期样品的收集 |
| 6.2.4 总RNA的提取及cDNA合成 |
| 6.2.5 基因克隆 |
| 6.2.6 生物信息学分析 |
| 6.2.7 载体构建 |
| 6.2.8 无内毒素质粒提取 |
| 6.2.9 亚细胞定位 |
| 6.2.10 实时荧光定量PCR |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 LvRAGs基因的初步探究 |
| 6.3.2 LvDSCAMs基因的初步探究 |
| 6.3.3 LvFREPs基因的初步探究 |
| 6.3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 主要试剂 |
| 附录Ⅱ 主要仪器 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）日本沼虾免疫应答相关基因的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 日本沼虾及养殖现状 |
| 1.2 水产养殖中常见环境胁迫因子的来源与危害 |
| 1.2.1 氨氮的来源和危害 |
| 1.2.1.1 养殖水体中氨氮的来源 |
| 1.2.1.2 氨氮对水生动物的危害 |
| 1.2.2 亚硝酸盐的来源和危害 |
| 1.2.2.1 水产养殖水体中亚硝酸盐的来源 |
| 1.2.2.2 亚硝酸盐对水生动物的危害 |
| 1.2.3 其他环境因子的来源与危害 |
| 1.3 环境因子对甲壳动物免疫系统的影响 |
| 1.3.1 氨氮胁迫对甲壳动物免疫系统的影响 |
| 1.3.2 亚硝酸盐胁迫对甲壳动物免疫系统的影响 |
| 1.3.3 其他环境因子胁迫对甲壳动物免疫系统的影响 |
| 1.4 常见体液免疫因子 |
| 1.4.1 酚氧化酶 |
| 1.4.2 超氧化物歧化酶 |
| 1.4.3 总抗氧化能力(T-AOC) |
| 1.5 转录组 |
| 1.5.1 转录组学与基因组学概述 |
| 1.5.2 转录组技术在水产动物上的应用 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验耗材 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 常用试剂配制 |
| 2.1.6 主要数据库及生物软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫指标测定方法 |
| 2.2.1.1 总蛋白定量实验BCA法 |
| 2.2.1.2 SOD测定 |
| 2.2.1.3 T-AOC测定 |
| 2.2.1.4 PO测定 |
| 2.2.2 总RNA的提取与检测 |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.3.1 转录组建库测序流程 |
| 2.2.3.2 转录组文库构建 |
| 2.2.3.3 转录组文库上机测序 |
| 2.2.4 转录组生物信息分析流程 |
| 2.2.4.1 测序数据控制及质控 |
| 2.2.4.2 转录组测序数据组装 |
| 2.2.4.3 转录组基因功能注释和表达水平分析 |
| 2.2.5 差异表达mRNAs的qRT-PCR验证 |
| 2.2.5.1 反转录合成cDNA |
| 2.2.5.2 差异表达基因引物合成 |
| 2.2.5.3 差异表达基因的qRT-PCR |
| 2.2.5.4 荧光定量PCR数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾免疫指标的影响 |
| 3.1.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾SOD活性的影响 |
| 3.1.2 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响 |
| 3.1.3 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾PO活性的影响 |
| 3.2 氨氮胁迫对日本沼虾免疫指标的影响 |
| 3.2.1 氨氮胁迫对日本沼虾SOD活性的影响 |
| 3.2.2 氨氮胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响 |
| 3.2.3 氨氮胁迫对日本沼虾PO活性的影响 |
| 3.3 亚硝酸盐转录组测序结果 |
| 3.3.1 RNA质量检测 |
| 3.3.2 原始测序质检情况与测序结果 |
| 3.3.3 Trinity拼接结果 |
| 3.3.4 基因功能注释 |
| 3.3.5 GO分类结果 |
| 3.3.6 KOG分类结果 |
| 3.3.7 KEGG分类结果 |
| 3.3.8 SSR分析 |
| 3.3.9 差异表达基因分析 |
| 3.3.9.1 差异表达基因聚类分析 |
| 3.3.9.2 差异基因GO和KEGG通路富集分析 |
| 3.3.10 差异表达mRNAs qRT-PCR验证 |
| 3.4 亚硝酸盐胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选与分析 |
| 3.4.1 免疫应答相关差异表达基因的筛选 |
| 3.4.2 免疫应答相关差异表达基因的聚类分析 |
| 3.4.3 免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析 |
| 3.4.4 免疫应答相关通路和差异表达基因的验证 |
| 3.5 氨氮转录组测序结果 |
| 3.5.1 RNA质量检测 |
| 3.5.2 转录组序列测定与组装 |
| 3.5.3 生物学重复样品间相关性检查 |
| 3.5.4 基因功能注释 |
| 3.5.5 GO分类结果 |
| 3.5.6 SNP和Indel分析 |
| 3.5.7 SSR分析 |
| 3.5.8 基因表达水平分析 |
| 3.5.9 差异基因分析 |
| 3.5.9.1 基因差异表达分析 |
| 3.5.9.2 差异基因聚类分析 |
| 3.5.9.3 差异基因GO富集分析 |
| 3.5.9.4 差异基因KEGG通路富集分析 |
| 3.5.10 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 3.6 氨氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因筛选与分析 |
| 3.6.1 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选 |
| 3.6.2 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的聚类分析 |
| 3.6.3 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析 |
| 3.6.4 免疫应答相关通路和基因的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 氨氮和亚硝酸盐对免疫指标的影响 |
| 4.2 氨氮胁迫对免疫应答相关基因与通路影响 |
| 4.3 亚硝酸盐胁迫对免疫应答相关基因与通路影响 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）低盐胁迫下凡纳滨对虾鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建及差异ESTs分析（论文提纲范文）
| 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验设计及样品采集 |
| 2.2 总RNA提取 |
| 2.3 鳃丝抑制性消减杂交文库构建 |
| 2.3.1 cDNA反转录 |
| 2.3.2 cDNA RsaⅠ酶切 |
| 2.3.3 接头连接 |
| 2.3.4 cDNA文库差减杂交 |
| 2.3.5 二轮差减套式PCR鉴定 |
| 2.3.6 消减效率检测 |
| 2.4 PCR产物载体连接转化及克隆 |
| 2.5 克隆测序及差异ESTs同源性分析 |
| 2.6 文库构建质量及插入片段检测分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA提取 |
| 3.2 Smart cDNA合成和RasⅠ酶切效率 |
| 3.3 接头连接效率检测 |
| 3.4 两轮杂交和PCR扩增结果 |
| 3.5 杂交cDNA文库消减效率检测 |
| 3.6 消减杂交文库插入片段的PCR鉴定 |
| 3.7 抑制性消减杂交cDNA文库差异EST序列统计和分析 |
| 3.8 低盐胁迫诱导差异表达相关基因功能分类分析 |
| 4 讨论 |
（6）度夏仿刺参腐皮综合征病原研究及伯麦罗弧菌诱导的SSH文库构建与ESTs分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 仿刺参病害研究 |
| 1.1.1 海参病害研究概述 |
| 1.1.2 度夏仿刺参疾病研究进展 |
| 1.1.3 仿刺参腐皮综合征病原微生物的研究 |
| 1.2 病原微生物的快速诊断技术 |
| 1.2.1 病原微生物经典形态特征及生理生化指标鉴定技术 |
| 1.2.2 病原微生物免疫学快速诊断技术 |
| 1.2.3 病原微生物核酸快速检测技术 |
| 1.2.4 生物质谱在细菌分类鉴定中的应用 |
| 1.3 仿刺参的免疫学研究发展 |
| 1.3.1 棘皮动物的免疫机制 |
| 1.3.2 温度对仿刺参免疫机能的影响 |
| 1.3.3 仿刺参免疫相关基因研究进展 |
| 1.4 抑制性消减杂交在海洋动物免疫相关基因功能研究中的应用 |
| 1.4.1 抑制性消减杂交技术原理及技术流程 |
| 1.4.2 抑制性消减杂交技术的优缺点 |
| 1.4.3 抑制性消减杂交技术在海洋动物免疫相关功能基因研究中的应用 |
| 1.5 表达序列标签研究相关的生物信息学方法 |
| 1.5.1 实验数据的获得与加工 |
| 1.5.2 序列片段的拼接 |
| 1.5.3 基因功能注释(Annotation) |
| 1.6 本研究的技术路线和目的意义 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 南移养殖仿刺参腐皮综合征的病原研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 症状研究及流行情况概述 |
| 2.3.2 细菌的回接感染结果 |
| 2.3.3 仿刺参注射感染和浸浴感染实验结果比较 |
| 2.3.4 病原菌生理生化指标的测定结果 |
| 2.3.5 病原菌的质谱鉴定 |
| 2.3.6 病原菌基因序列测定及系统发生树的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 病原菌鉴定的方法比较 |
| 2.4.2 伯麦罗弧菌的致病性 |
| 2.4.3 伯麦罗弧菌不同菌株的特征比较 |
| 第三章 仿刺参腐皮综合征病原菌攻毒前后SSH文库的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 仿刺参腐皮综合征病原菌攻毒前后体腔细胞总RNA的提取质量 |
| 3.3.2 抑制性差减文库的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 研究仿刺参免疫相关基因技术的选择 |
| 3.4.2 建库对象的选取和其提取RNA质量的保障 |
| 3.4.3 刺参抑制性消减杂交cDNA文库质量评价 |
| 第四章 病原菌攻毒仿刺参SSH文库的筛选及序列分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 文库重组质粒测序 |
| 4.2.2 文库测定数据生物信息学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 文库测序结果统计 |
| 4.3.2 文库测定数据的Blast和InterProscan分析结果 |
| 4.3.3 文库测定数据的GO分析统计结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 SSH文库基因的功能注释和分类 |
| 4.4.2 差异表达基因主要类群探讨 |
| 第五章 病原菌攻毒前后仿刺参免疫相关基因差异表达研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 内参基因的选择和免疫相关基因的初步筛选 |
| 5.3.2 胁迫后仿刺参免疫相关基因的时间顺序差异表达 |
| 5.3.3 胁迫后仿刺参免疫相关基因的空间顺序差异表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 研究基因差异表达的实验技术选择 |
| 5.4.2 病原菌胁迫下仿刺参体内C型凝集素的差异表达 |
| 5.4.3 病原菌胁迫下仿刺参体内血清淀粉样蛋白A的差异表达 |
| 5.4.4 病原菌胁迫下仿刺参体内含铁蛋白的差异表达 |
| 参考文献 |
| 结论与创新 |
| 参加的科研项目 |
| 博士期间发表的部分论文 |
| 致谢 |
（7）调控拟穴青蟹卵巢发育的眼柄转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 拟穴青蟹生物学特征 |
| 1.2 激素对虾蟹生殖的调控 |
| 1.2.1 CHH家族在生殖中的作用 |
| 1.2.2 GSFs在虾蟹类生殖中的作用 |
| 1.2.3 类固醇激素在虾蟹类生殖中的作用 |
| 1.2.4 前列腺素及其他哺乳动物激素在虾蟹类生殖中的作用 |
| 1.3 神经递质在虾蟹生殖中的作用 |
| 1.4 虾蟹类生殖相关的细胞周期调控 |
| 1.5 虾蟹性腺发育调控相关信号通路 |
| 1.5.1 ERK信号通路 |
| 1.5.2 泛素和类泛素化修饰途径 |
| 1.6 第二代高通量测序技术 |
| 1.6.1 454焦磷酸测序的基本原理和方法 |
| 1.6.2 高通量测序技术在水产生物研究中的应用 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 1.8 主要研究内容和技术路线 |
| 1.8.1 主要研究内容 |
| 1.8.2 技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 拟穴青蟹 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.1.4 主要应用软件与生物信息学网站 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 454高通量测序及生物信息学分析 |
| 2.2.3 测序结果的统计分析 |
| 2.2.4 SMART-RACE技术克隆基因全长 |
| 2.2.5 石蜡切片及HE染色 |
| 2.2.6 半定量PCR |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 第3章 结果 |
| 3.1 转录组分析 |
| 3.1.1 ESTs序列的分析和拼接 |
| 3.1.2 转录子的表达注释 |
| 3.1.3 GO和KEGG分析 |
| 3.1.4 性腺发育调控及免疫相关转录子的分类 |
| 3.1.5 差异表达基因分析 |
| 3.1.6 半定量PCR验证 |
| 3.1.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.1.8 CHH家族神经肽相关基因分析 |
| 3.2 卵巢发育调控相关基因的克隆与序列分析 |
| 3.2.1 Sp-CHH3基因序列分析 |
| 3.2.2 Sp-VIH-like序列分析 |
| 3.2.3 Sp-Gnb1基因序列分析 |
| 3.2.4 Sp143-3ζ 基因序列分析 |
| 3.2.5 Sp-MK2基因序列分析 |
| 3.3 ERK信号通路相关基因的表达特征 |
| 3.3.1 各基因在拟穴青蟹雌性个体各组织中的表达水平 |
| 3.3.2 卵巢发育过程中各基因在卵巢和眼柄中的表达变化 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 转录组 |
| 4.1.1 EST序列 |
| 4.1.2 转录子注释 |
| 4.1.3 GO和KEGG |
| 4.1.4 性腺发育调控及免疫相关转录子的分类 |
| 4.1.5 差异表达基因 |
| 4.2 卵巢发育调控相关基因 |
| 4.2.1 Sp-CHH3基因 |
| 4.2.2 Sp-VIH-like基因 |
| 4.2.3 Sp-Gnb1基因 |
| 4.2.4 Sp143-3ζ 基因 |
| 4.2.5 Sp-MK2基因 |
| 4.2.6 ERK信号通路在调控卵巢发育中的作用 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（8）Real-time Q PCR芯片研究有机锡致鲍性畸变的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 主要符号表 第1章 引言 |
| 1.1 有机锡污染与鲍资源的保护 |
| 1.2 腹足类性畸变的研究进展及其应用 |
| 1.3 腹足类性畸变分子机制的研究进展 |
| 1.3.1 脊椎动物类型的类固醇激素假说 |
| 1.3.2 神经肽假说 |
| 1.3.3 RXR假说 |
| 1.4 Real-time Q PCR芯片技术 |
| 1.5 内参筛选 |
| 1.6 研究目的和内容 第2章 杂色鲍性腺发育及应激诱导相关基因的筛选及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GO注释结果 |
| 2.2.2 性腺发育及应激诱导相关基因的筛选 |
| 2.3 讨论 第3章 TBT和TPT暴露杂色鲍内参基因的筛选 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 有机锡暴露以及样品的采集 |
| 3.1.3 实验主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 杂色鲍总RNA的提取 |
| 3.2.2 杂色鲍内参筛选结果 |
| 3.3 讨论 第4章 TBT和TPT暴露杂色鲍基因表达的分析及Real-time Q PCR芯片的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 有机锡暴露以及样品的采集 |
| 4.1.3 实验主要仪器和试剂 |
| 4.1.4 引物设计 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 TBT和TPT暴露对杂色鲍若干基因表达的影响 |
| 4.2.2 Real-time Q PCR芯片构建 第5章 结论和展望 致谢 参考文献 在学期间发表的学术论文 |
（9）基于中国明对虾不同组织EST数据的基因表达差异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和数据来源 |
| 1.2 EST数据的预处理和聚类拼接 |
| 1.3 unigene的注释和功能分类 |
| 1.4 组织差异分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 原始数据的预处理和聚类拼接 |
| 2.2 unigene的注释和分类 |
| 2.3 不同组织特异unigene的分析 |
| 2.4 组织高表达unigene的分析 |
| 2.5 共有基因的差异表达情况 |
| 3 讨论 |
（10）凡纳滨对虾抗对虾白斑综合症病毒感染研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略词表 |
| 目录 |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 对虾白斑综合症病毒研究概况 |
| 1.1.1 WSSV的危害、形态结构及组织病理学特点 |
| 1.1.2 WSSV的宿主范围及可能的传播途径 |
| 1.1.3 WSSV基因组结构特征 |
| 1.1.4 WSSV感染不同时程基因表达研究 |
| 1.2 对虾免疫防御机制研究进展 |
| 1.2.1 物理防御 |
| 1.2.2 细胞免疫 |
| 1.2.3 体液免疫 |
| 1.2.4 对虾抗病毒免疫研究存在问题 |
| 1.3 转录组学研究方法及测序技术发展与应用 |
| 1.3.1 转录组学研究的基本方法 |
| 1.3.2 Illumina/Solexa测序技术应用研究进展 |
| 1.3.3 对虾转录组研究现状 |
| 1.4 本课题研究的目的和意义 |
| 1.5 本研究技术路线 |
| 第2章 凡纳滨对虾血淋巴转录组测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 文库测序 |
| 2.2.6 测序数据处理及分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RNA样品的制备及质量评价 |
| 2.3.2 测序产量统计及质量评价 |
| 2.3.3 De novo序列组装结果 |
| 2.3.4 组装序列质量评价 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 unigenes功能注释及代谢通路分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 分析方法 |
| 3.3 分析结果 |
| 3.3.1 数据库比对结果 |
| 3.3.2 GO功能分类 |
| 3.3.3 COG功能分类 |
| 3.3.4 KEGG代谢通路分析 |
| 3.3.5 蛋白编码框预测 |
| 3.3.6 凡纳滨对虾抗病毒免疫相关基因分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 WSSV感染不同时期的数字基因表达谱分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 测序文库构建及Illumina测序 |
| 4.4 测序结果分析方法 |
| 4.4.1 Tags的去冗余与比对分析 |
| 4.4.2 差异表达基因的鉴定 |
| 4.4.3 差异表达基因的qPCR验证 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 DGE测序评估 |
| 4.5.2 差异表达基因筛选 |
| 4.5.3 差异表达基因的功能注释 |
| 4.5.4 DGE分析的实验验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 胰凝乳样丝氨酸蛋白酶在WSSV侵染过程中的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 实验设计 |
| 5.2.4 WSSV的检测及粗提液的制备 |
| 5.2.5 WSSV的定量 |
| 5.2.6 RNA提取及cDNA合成 |
| 5.2.7 免疫相关基因的表达分析 |
| 5.2.8 胰凝乳样丝氨酸蛋白酶(CH-SPase)在注射感染WSSV时其表达模式分析 |
| 5.2.9 CH-SPase基因的沉默表达对感染WSSV的对虾死亡率及病毒增殖的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 WSSV定量标准曲线的建立 |
| 5.3.2 自然感染WSSV的对虾血淋巴中18个免疫相关基因的表达模式分析 |
| 5.3.3 CH-SPase在WSSV感染进程中的表达模式分析 |
| 5.3.4 dsRNA的体外合成及检测 |
| 5.3.5 CH-SPase dsRNA干扰效率的确定 |
| 5.3.6 CH-SPase基因的沉默对感染WSSV的对虾死亡率的影响 |
| 5.3.7 CH-SPase基因的沉默对感染WSSV的对虾体内病毒增殖的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要的结果结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、Discovery of immune related factors in Fenneropenaeus chinensis by annotation of ESTs（论文参考文献）
- [1]斑节对虾适应低鱼粉蛋白性状的遗传参数估计及分子机制解析[D]. 姜松. 上海海洋大学, 2021(01)
- [2]低温胁迫下福寿螺的生理反应和差异表达基因的筛选及功能研究[D]. 刘光富. 安徽农业大学, 2019(05)
- [3]凡纳滨对虾不同免疫组织在弧菌和WSSV免疫刺激早期的响应机制[D]. 王富轩. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2019(01)
- [4]日本沼虾免疫应答相关基因的筛选与鉴定[D]. 于杰伦. 山东农业大学, 2019(01)
- [5]低盐胁迫下凡纳滨对虾鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建及差异ESTs分析[J]. 刘泓宇,谭北平,董晓慧,迟淑艳,杨奇慧. 海洋湖沼通报, 2014(01)
- [6]度夏仿刺参腐皮综合征病原研究及伯麦罗弧菌诱导的SSH文库构建与ESTs分析[D]. 方旅平. 厦门大学, 2017(01)
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- [8]Real-time Q PCR芯片研究有机锡致鲍性畸变的分子机制[D]. 肖丽萍. 集美大学, 2013(08)
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