一、实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值（论文文献综述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中进行了进一步梳理背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
胡杰[2]（2021）在《SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究》文中研究指明目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题,全球范围内有大约2.4亿人感染乙肝病毒[1],乙肝病毒慢性感染可导致肝硬化、肝衰竭和肝癌[1]。目前两类HBV感染的治疗药物（干扰素类（Interferon）和核苷/核苷酸类似物（NAs））的疗效十分有限（1年期治疗HBs Ag阴转率通常<5%,延长治疗HBs Ag阴转率通常亦<10%）[2],加之HBV耐药突变株的出现,核苷酸类似物治疗效果常常不能持久;因此寻找新的抗病毒靶点具有非常重要的意义。代谢是生命活动中生物化学过程的总称,病毒在细胞内完成复制和包装等生活周期必然伴随着代谢的变化。细胞代谢重编程在激活免疫系统和炎症反应中起着关键的作用。一方面,在应对病原体感染或组织损伤时,激活的免疫反应向代谢系统发出反馈信号,诱导代谢重编程,增强分解代谢,从而向其他系统传递应激信号,引发一系列恢复性应激反应。另一方面,分解代谢的增强可以满足快速有效的免疫应答如免疫细胞迁移、吞噬和细胞因子产生等对生物分子和能量的需求。病毒感染诱导的代谢重编程不仅涉及代谢通路的改变,代谢酶和代谢产物还可以直接参与免疫调控[3-5]。最近的研究表明己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway,HBP）在宿主先天免疫中发挥重要作用。大约2%-5%的进入细胞的葡萄糖被转化为HBP的最终产物尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）[6],并作为O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修饰的供体[7]。HBP及其介导的蛋白O-GlcNAc修饰在宿主抗水泡性口炎病毒（VSV）[8]、流感病毒[9]和丙型肝炎病毒[10]的抗病毒免疫中起积极作用。包含SAM和HD结构域的I型蛋白（SAMHD1）是一种干扰素诱导的限制宿主因子,在先天性免疫反应中发挥重要的抗病毒作用[11]。宿主限制因子SAMHD1具有d GTP/GTP依赖的三磷酸水解酶活性（d NTP水解酶活性）,通过降低细胞内d NTP浓度,限制HIV-1的复制[12];同时SAMHD1蛋白还具有核酸酶活性,能够直接降解病毒RNA基因组,抑制病毒的复制和转录。研究发现SAMHD1的d NTP水解酶活性可以特异性抑制HBV DNA的合成和病毒复制,但不影响HBV ccc DNA的转录和基因表达[13,14]。对SAMHD1蛋白的翻译后修饰研究发现,SAMHD1可以发生磷酸化、乙酰化、氧化和泛素化修饰等,可能对其抗病毒功能发挥多重调控作用。我们之前的研究已经证明,Cyclin E2-CDK2可以介导SAMHD1磷酸化以消除其对HBV复制的抑制作用[14]。然而,目前尚不清楚SAMHD1是否可以发生O-GlcNAc修饰,以及SAMHD1的O-GlcNAc修饰是否影响其抗病毒功能。本研究将首先在HBV感染细胞模型和临床标本中检测糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化,观察干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响,深入探讨HBV感染后上调HBP途径和O-GlcNAc修饰的分子机制,并进一步阐明病毒感染通过代谢重编程促进宿主限制因子SAMHD1的O-GlcNAc修饰,在抗病毒天然免疫中的作用机理。方法:1.HBV感染细胞糖代谢、HBP途径以及O-GlcNAc修饰的变化:我们在HepG2细胞中过表达Ad HBV1.3,或者HBV感染的HepG2-NTCP细胞收集细胞代谢物,采用非靶标和靶标代谢物分析,检测葡萄糖和UDP-GlcNAc水平。同时通过Western blot检测HBV感染后蛋白O-GlcNAc修饰水平和HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白表达变化,通过q RT-PCR和免疫荧光检测HBV感染后葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达水平。2.干预O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响:通过GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849,以及OGA抑制剂Thiamet G处理HBV感染的Hep AD38、HepG2-NTCP和HepG2细胞,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA。我们还将在上述HBV感染复制细胞模型中采用shRNA分别敲低GFPT1,OGT,OGA,Western blot检测O-GlcNAc修饰水平,q PCR或Southern blot检测HBV DNA的变化水平。3.鉴定HBV感染后发生O-GlcNAc修饰的关键分子及其在抗病毒天然免疫中的作用:裂解去掉四环素的Hep AD38细胞,加入O-GlcNAc抗体孵育,富集可能有O-GlcNAc修饰的蛋白,通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测与OGT发生相互作用的蛋白,并筛选与OGT相互作用蛋白的主要区段。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定发生O-GlcNAc的位点并再次通过IP实验及s WGA实验验证其O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染对SAMHD1四聚化的作用,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1WT及S93A蛋白的d NTPase活性。我们将SAMHD1野生型WT或S93A变体转染到SAMHD1基因敲除的Hep AD38,HepG2以及HepG2-NTCP细胞中。提取HBV DNA后,通过荧光定量PCR,Southern blot检测S93A突变后对HBV复制的影响。将SAMHD1野生型WT或S93A突变体转染到SAMHD1基因敲除的THP-1细胞中,加入带有荧光素酶表达基因的HIV-1的单轮复制的假病毒,通过荧光素酶实验检测SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用。4.在HBV转基因小鼠和临床标本中验证SAMHD1的O-GlcNAc修饰:通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰。结果:1.通过非靶标和靶标代谢检测发现HBV感染后Glucose和UDP-GlcNAc显着升高:Western blot检测发现HBV感染后HBP途径和蛋白O-GlcNAc修饰是显着增强的。HBV感染后,HBP关键酶GFPT1,OGT,OGA的蛋白水平没有明显变化,通过q PCR和免疫荧光发现HBV感染后上调了肝细胞表面葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达,促进了葡萄糖摄取,为HBP合成UDP-GlcNAc提供了底物,导致蛋白O-GlcNAc修饰增加。2.GLUT1抑制剂WZB117,GFPT1抑制剂DON,OGT抑制剂ST045849处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而OGA抑制剂Thiamet G处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。shGFPT1,shOGT处理细胞后,O-GlcNAc修饰降低,并促进HBV复制。而shOGA处理细胞后O-GlcNAc修饰增强,能够显着抑制HBV的复制。3.通过LC-MS/MS鉴定可能发生O-GlcNAc修饰的蛋白有1034种。通过GO分析筛选与免疫相关的蛋白SAMHD1。进一步通过Co-IP实验和免疫荧光实验检测SAMHD1与OGT发生相互作用,并筛选与OGT相互作用的区段为1-150aa。通过IP实验和LC-MS/MS鉴定SAMHD1的Ser93为O-GlcNAc修饰的位点,并通过IP实验及s WGA发现S93A突变后O-GlcNAc修饰降低,说明SAMHD1的Ser93为主要的O-GlcNAc修饰位点。通过寡聚化实验检测HBV感染后SAMHD1四聚化增强,通过HPLC实验检测原核表达的SAMHD1 S93A蛋白的d NTPase活性降低。SAMHD1 S93A突变后丧失了对HBV复制的抑制作用,SAMHD1 S93A突变对HIV-1的抑制作用也消失了。4.通过LC-MS/MS检测慢性HBV感染者血浆中的UDP-GlcNAc水平升高。通过Western blot检测HBV转基因小鼠及慢性HBV感染者的O-GlcNAc修饰增高,s WGA实验检测慢性HBV感染者肝组织SAMHD1的O-GlcNAc修饰显着升高。结论:HBV感染促进HBP途径,使UDP-GlcNAc底物显着升高,并增强O-GlcNAc修饰。而HBP介导的高的O-GlcNAc修饰水平能够抑制HBV的复制,质谱检测到靶蛋白宿主限制性因子SAMHD1有O-GlcNAc修饰,进一步检测到Ser93位点为其发生O-GlcNAc修饰的关健位点,且SAMHD1的Ser93位O-GlcNAc正向调节宿主体内外抗HBV免疫应答。这些发现揭示了HBP、O-GlcNAc修饰和以SAMHD1为靶点的先天抗病毒免疫之间的联系。
何如怡[3]（2021）在《基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究》文中认为核酸检测是分子诊断的主要手段之一,在卫生保健、环境监测、生物安全以及食品分析等许多领域发挥了重要的作用,开发操作简单成本低的高灵敏度、高特异性核酸检测技术具有重要意义。近年来,基于CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system）系统发展的一系列高灵敏度和高专一性的核酸检测技术在临床诊断上取得了显着的进展,然而Cas效应蛋白需要使用RNA作为向导,并且依赖特殊序列,比如PAM（Protospacer adjacent motif）或者PFS（Protospacer flanking site）,来识别靶位点,这在一定程度上限制了其应用。与Cas效应蛋白类似,Argonaute（Ago）也是一类以核酸作为向导的核酸内切酶。PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来源于古生菌的原核Ago蛋白质,可以利用具有5’磷酸基团的单链DNA（大于15 nt）作为向导,从向导的5’端开始的第10和11个核苷酸之间的位点切割互补的单链DNA。本研究发现PfAgo切割产生的单链DNA能够作为向导引发新的酶切反应。基于此发现,我们建立了一种具有高灵敏度、高特异性和多重检测能力的核酸检测方法,通过对临床核酸样本的检测证明了该方法的可行性和应用潜力。随后,我们将该方法加以改进并用于SARS-CoV-2的核酸检测。同时,本研究利用向导的长度对PfAgo切割活性的影响,将极短PCR技术与PfAgo结合起来开发了另一种简单快速的核酸检测方法。综上,本研究通过深入探究PfAgo的酶学性质开发了三种高灵敏度、高特异性、高准确性的核酸检测技术,为分子诊断提供了新的方法选择,并为Ago蛋白的应用提供了新的思路。本论文的具体内容如下:1.PfAgo蛋白质的表达纯化及性质研究。根据PfAgo耐高温的性质,利用80°C水浴处理和Ni-NTA亲和纯化获得了高纯度PfAgo蛋白质。对PfAgo性质的进一步研究发现向导DNA（guide DNA,g DNA）与靶DNA（target DNA,t DNA）的单碱基不匹配会显着影响PfAgo对靶的切割效率。此外,g DNA 3’端的突出对PfAgo的切割活性没有影响,5’端突出会影响PfAgo的切割活性和切割位点。本研究发现PfAgo切割单链DNA产生的具有5’磷酸基团的单链DNA可以作为新的g DNA介导PfAgo靶向切割与之互补的单链DNA,表明PfAgo的切割反应可以传递。2.结合PfAgo切割反应可传递的特点和PCR技术开发基于PfAgo的核酸检测方法（PAND）。设计三条分别靶向待检测双链DNA不同位置的g DNAs（输入g DNAs）介导PfAgo切割双链DNA靶,并从中释放出一条单链DNA,作为新的g DNA（生成g DNA）与PfAgo蛋白结合,靶向切割互补的分子信标,从而产生荧光信号,实现检测的目的。该方法检测灵敏度可以达到1.6 a M、能够识别单碱基突变和实现五通道检测。对模拟样本和临床样本的检测结果表明该方法可以应用于16S r DNA、结核杆菌和乙肝病毒耐药性突变、BRAC1基因的单核苷酸位点多态性位点、循环肿瘤DNA以及人乳头瘤病毒（HPV）多亚型分型的检测。3.结合逆转录PCR技术和PfAgo切割反应开发了基于PfAgo的SARS-CoV-2检测（SARS-CoV-2 PAND）。通过筛选最佳的PfAgo/g DNA复合物,仅利用单条输入g DNA建立了高灵敏度、高专一性、高准确度的SARS-CoV-2核酸诊断方法,检测下限可以达到1拷贝每反应。该方法缩短了荧光定量PCR仪的使用时间,能够有效解决大规模检测时荧光定量PCR仪不足的问题。对44例新冠病毒疑似感染者的咽拭子核酸提取物的检测结果与荧光定量逆转录PCR（RT-q PCR）一致,同时对36例阳性样品进行了D614G突变检测,证明SARS-CoV-2 PAND可以用于SARS-CoV-2及其突变体的检测。4.基于PfAgo的切割活性只能由长度大于15 nt的g DNA触发的性质开发了结合极短PCR技术和PfAgo的核酸检测方法（USPCRP）。利用具有5’磷酸基团的短引物启动的极短PCR的扩增产物作为g DNA来介导PfAgo切割分子信标,进行DNA检测,该方法无需额外加入g DNA,具有100 a M的检测灵敏度和序列特异性。利用该方法成功对临床样本的HPV16E6基因和SARS-CoV-2 ORF1ab基因进行了检测,表明该方法能够用于临床诊断。
刘晓红[4]（2021）在《血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究》文中认为目的探讨乙肝表面抗原（HBs Ag）及乙型肝炎e抗原（HBe Ag）阴性,伴表面抗体（HBs Ab）、e抗体（HBe Ab）、核心抗体（HBc Ab）至少一项阳性的血清中,检测HBV DNA含量对隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的检出价值,及探讨OBI的发生机制。方法采用化学发光免疫分析法（CLIA）检测乙肝五项病毒血清标志物（HBV-M）,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行HBV-DNA含量复筛,对OBI检出情况进行分析。采用湿化学法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（BILT3）,分析受检患者肝损伤情况。采用CLIA方法检测丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、梅毒抗体（TP-Ab）、人类获得性免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）,分析是否合并其他病毒感染及宿主免疫应答有无明显差异。测序法进一步检测HBV病毒是否存在基因突变,分析OBI发生机制。结果本次论文实验期间收集HBsAg及HBeAg阴性,伴HBs Ab、HBe Ab、HBc Ab至少一项阳性的血清共计1138份,PCR共检出35份HBV-DNA阳性,OBI检出率3.08%,其中HBc Ab、HBs Ab阳性和HBc Ab阳性HBV-M模式的检出率最高,分别为4.11%、4.04%。HBc Ab随着样本吸光度/临界值（S/Co值）升高,HBV-DNA阳性检出率依次显着升高（P<0.05）。596例患者接受肝功能检查,肝损伤占22.99%,肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBc Ab高反应性（S/Co值≥10.0）均显着高于肝正常组（P<0.05）。35例HBV-DNA阳性标本接受HCV、TP、HIV检测,HCV阳性占11.43%,TP阳性占2.86%,HIV阳性为0,合并HCV病毒感染组与合并TP或HIV病毒感染组存在明显差异（P<0.05）。乙型肝炎病毒基因变异检测S区145位点、S区127位点、C区,未发现基因突变。结论常规检测HBsAg及HBeAg阴性伴HBcAb阳性提示存在OBI可能,且OBI发生风险随HBc Ab反应性S/Co值升高而明显升高。同时参考肝损伤指标,提示应当进一步行HBV DNA含量检测,为临床诊断OBI和降低OBI所致乙肝病毒传播风险提供参考。
许娇[5]（2021）在《FQ-PCR和ELISA联合检测用于乙型肝炎的临床价值》文中研究指明目的评价实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）联合检测在乙型肝炎诊疗中的临床价值。方法选取2017年10月至2018年12月盘锦市中心医院收治的100例乙型肝炎患者为研究对象,采用随机数字分组法将其分为研究组（34例）、对照1组（33例）、对照2组（33例）。研究组采用FQ-PCR和ELISA联合检测,对照1组采用FQ-PCR检测,对照2组采用ELISA检测,比较3组乙型肝炎患者免疫学指标,即乙型肝炎病毒表面抗原（HBs Ag）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBs Ab）、乙型肝炎病毒e抗原（HBe Ag）、乙肝病毒e抗体（HBe Ab）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBc Ab）,分析不同免疫学标志物下的检测结果。结果研究组HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe Ab、HBc Ab阳性检出率显着高于对照1组、对照2组,差异有统计学意义（P <0.05）;研究组大三阳乙型肝炎病毒DNA载量明显高于对照1组、对照2组,差异有统计学意义（P <0.05）。结论应用FQ-PCR和ELISA联合检验乙型肝炎病毒,在乙型肝炎患者早期诊断中具有积极的作用,同时还可提高诊断准确率。其中的免疫学标志物水平有助于指导治疗与评价预后。
韩聪[6]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
肖潇[7]（2020）在《新型分子检测技术在肝胆肿瘤中的初步应用》文中指出实验医学是推动临床精准医学发展的重要基石,20世纪70年代以来,作为最先进的实验医学技术,分子检测技术的研究经历了半个世纪的发展,已经逐步进入临床应用,并成为实验医学（体外诊断）领域的先进技术的代表。分子检测技术主要包括分子杂交、分子构象、聚合酶链式反应（PCR）和基因测序四大技术,随着技术应用的不断完善、进步和规范,已经广泛用于疾病的防、筛、诊、治等大健康管理,包括临床感染性疾病、肿瘤性疾病、遗传性疾病、优生优育、药物基因组、疾病风险和病程管理等多个领域。特别是分子诊断技术在肿瘤领域的研究与应用已成为肿瘤精准医学的热点,与PCR技术、测序技术密切相关的液体活检,包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体等的检测极大地提升、改善了肿瘤临床精准管理水平和患者预后。本研究以目前最新的三种分子检测技术方法为代表,聚焦下一代基因测序技术（Illumina平台）、数字PCR技术（微滴式数字PCR平台）、循环肿瘤细胞检测（阴性富集加叶酸受体PCR检测平台）,探讨这些先进分子检测技术在肝胆肿瘤临床辅助诊断和病程管理中的应用价值。原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）主要的组织学类型包括:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）和混合型肝癌。胆道肿瘤则是由胆道或是胆囊上皮的胆管细胞分化形成的一组异型性的肿瘤,两种肿瘤都在消化系统肿瘤中恶性致死性极高。第一部分:高通量测序分析HBV多耐药位点及HBs Ag+/HBs Ab+相关变异下一代基因测序技术（NGS）在肿瘤精准诊疗中具有重要作用,其检测周期短、通量高、灵敏度高,测序后得到的海量数据结果有利于更深层次的数据分析和挖掘,最终实现患者精准病因学诊断。乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝癌发生的最常见病因,目前抗病毒治疗是控制和预防慢性HBV感染患者病情进一步发展的唯一选择。一般认为乙肝病毒表面抗体（HBs Ab）能完全中和乙肝表面抗原（HBs Ag）。然而,临床在慢性HBV感染中会出现HBs Ab和HBs Ag共存现象,本研究通过本院及多中心入组慢性乙型肝炎（CHB）和HBV相关HCC样本共1066例,采用NGS分析患者HBV RT区耐药位点以及S区HBs Ag+/HBs Ab+双阳性患者的序列特征。RT区5种抗病毒药物的耐药分析显示,LAM和Ld T的耐药发生率（低频耐药+耐药）最高为61.66%和61.34%;ETV和ADV药物耐药发生率较低分别为21.25%和15.34%;TDF基因型耐药发生率最低为13.10%。LAM、Ld T、ETV产生耐药（突变率>20%）例数较多;ADV耐药相关的rt S78T、rt A181T/V、rt N236T位点低频突变（突变率5-20%）占阳性突变（突变率≥5%）的比率为59.09%、18.75%、38.46%,TDF的低频耐药占全部耐药的发生率较高为79.27%,而且其耐药相关的rt S78T、rt A181T/V位点低频突变（突变率5-20%）占阳性（突变率≥5%）突变的比率为59.09%、18.75%。HCC和CHB统计差异突变频率时发现,位点rt236、rt184在CHB和HCC组之间存在显着差异（P<0.05）。S区氨基酸突变分布提示,HBs Ag+HBs Ab+双阳性（DP）患者和HBs Ag+HBs Ab-单阳性（SP）患者在主要亲水区（MHR）的平均突变率均高于其他区域,而且在MHR内部的“a”决定簇区域DP组显着高于SP组（P<0.05）。分组分析发现,在HCC组中P46L、L104F、T118P、R/K122T、T125P、I126T、Q129N、T131N、M133S、M133T、V168A、I195M、P203R、Y206C、F220C、V224A的16个位点在DP和SP组的突变率存在显着差异（P<0.05）;在CHB组T47K、P62L、L77R、Q101H、M103L、L104F、I126S、M133T、G145R、M198I、L216*的11个位点在DP和SP组的突变率存在显着差异（P<0.05）。在HCC组中16个位点和CHB组的11个位点中,共同的差异位点为M133T和L104F,其余位点则不同;HCC患者的16个差异位点均与HBs Ag结果呈负相关;T125P、L104F、I195M、T118P、R/K122T、Y206C、Q129N、V168A与HBs Ab结果呈负相关,而I126T、V224A、P46L、F220C、M133T、T131N、M133S、P203R与HBs Ab呈正相关。而CHB患者的M103L、L104F、Q101H、G145R、L77R、T47K、P62L、M133T、L216*与HBs Ag结果呈负相关,I126S、M198I与HBs Ag呈正相关;M103L、L104F、Q101H、L77R、G145R、L216*、T47K、M133T、P62L与HBs Ab结果呈负相关,而I126S、M198I与HBs Ab呈正相关。HCC的S区DP和SP组存在差异的16个位点P46L、L104F、T118P、R/K122T、T125P、I126T、Q129N、T131N、M133S、M133T、V168A、I195M、P203R、Y206C、F220C、V224A的突变频率与血清HBs Ag中和率的相关性分析结果显示,Q129N差异位点的突变频率与中和率之间存在负相关性（r=-0.41,P<0.05）。综上,本研究利用NGS技术分析了临床标本的RT区耐药位点和S区HBs Ag/HBs Ab双阳性相关突变情况。耐药定量检测是本研究的优势,且低频（5-20%）耐药的发现对于未来耐药发生具有重要预测价值,定量及超敏耐药检测以及HCC、CHB差异耐药位点的存在为临床提供了用药指导以实施更精准的抗病毒治疗;HBs Ag+HBs Ab+双阳性患者HBV的S区变异分析提示,HCC和CHB在疾病进展中可产生不同的突变,HCC患者的差异位点主要集中在“a”决定簇区域,并影响着HBs Ag和HBs Ab的中和反应,导致新的HBV重叠感染。这些突变的发现可能是HBV免疫逃逸、发生HBV传播甚至已接种疫苗人群感染的重要原因。第二部分:数字PCR定量检测TP53基因p.R273H突变对胆道肿瘤诊断和预后的初步临床研究数字PCR技术（d PCR）在微量核酸样本的微小突变差异检测方面的优势被普遍认可,我们利用d PCR技术对胆道肿瘤患者人体抑癌基因TP53的突变情况进行检测,并探索讨论其在临床中的应用价值。我们对人类癌症突变信息数据库网站（COSMIC）现有数据TP53基因中的胆道肿瘤进行分析,发现多个肿瘤驱动基因热点突变位点（p.R175H、p.R248Q、p.R248W、p.R273H）的突变率普遍较高。本研究将上海东方肝胆外科医院检验科样本库中现有保存的胆道系统肿瘤及其肿瘤旁组织共45对,分别DNA抽提后,利用微滴数字PCR（dd PCR）技术,对位点p.R175H、p.R248Q、p.R248W、p.R273H进行定量检测;对样本库中现存的血浆样本中76例胆道肿瘤患者作为实验组,40例胆囊炎患者作为疾病对照组,40例健康人作为健康对照组,血浆标本分别抽提游离DNA（cell free DNA,cf DNA）并进行4个突变位点的dd PCR检测。45对胆道肿瘤患者肿瘤与肿瘤旁组织的TP53基因突变位点定量分析表明,胆道肿瘤组织中的p.R175H位点突变率（%）与其肿瘤旁组织比较差异有统计学意义（P<0.05）,其余位点p.R273H、p.R248W、p.R248Q配对比较差异均无统计学意义（P>0.05）。进一步根据有无p.R175H突变比较两组患者临床指标差异,观察发现白蛋白和总蛋白指标在两组患者中有显着差异（P<0.05）,有p.R175H突变的患者这些指标都低于没有突变的患者。外周血cf DNA TP53研究表明,76例胆道肿瘤患者和40例胆囊炎患者血浆标本p.R273H位点突变频率（%）在胆囊癌、肝内胆管癌、胆道肿瘤组高于疾病对照组、疾病对照组+健康对照组（P<0.05）。进一步结合病理特征包括肿瘤大小、数量、是否转移以及TNM分期等重要肿瘤特征显示,p.R273H突变与肿瘤数量相关（P<0.05）,p.R248W、p.R248Q、p.R175H突变与肿瘤数量无关（P>0.05）。联合p.R273H、CA19-9、AFP三项的二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.547时,对胆道肿瘤诊断敏感度为73.7%,特异度为90.0%,曲线下面积为0.845[95%CI（0.775～0.914）]。基于p.R273H、CA19-9二项联合二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.177时,对胆囊癌诊断敏感度为79.2%,特异度为95.0%,曲线下面积为0.908[95%CI（0.831～0.985）]。基于p.R273H、p.R248W、CA19-9、AFP四项联合二元Logistic逐步回归模型在截断值为0.47时,对ICC诊断敏感度为75.0%,特异度为90.0%,曲线下面积为0.844[95%CI（0.764～0.924）]。生存曲线分析显示,与胆道肿瘤中p.R273H突变位点阴性患者相比,阳性患者的生存率显着降低（P<0.05）。综上,本研究基于d PCR技术的TP53基因突变分析,对胆道系统肿瘤的诊断和预后分析具有一定的临床意义。p.R273H突变定量检测可以有效提高胆道肿瘤的诊断效能,并可作为患者术后预后判断的有效指标。第三部分:循环肿瘤细胞检测技术在肝胆肿瘤临床诊断中的初步应用循环肿瘤细胞（CTC）检测技术作为液态活检中有效的实时监测方法,分离得到的细胞具有肿瘤的"完整"标记物,是目前肿瘤诊断研究领域的前沿技术。研究发现叶酸受体（FRs）在肿瘤组织中高表达,已有研究将FRs作为肿瘤特别是肺癌患者CTC检测的靶点并进入临床研究,在肝胆等多种肿瘤中是否可作为CTC检测的靶点有待进一步研究或询证验证。本研究聚焦肝胆肿瘤患者外周血以及组织中FRs表达情况。我们收取2020年于上海东方肝胆外科医院就医的肝胆肿瘤患者全血标本28例,疾病对照14例,健康对照组14例作为CTC研究实验对象;另挑选45对2012-2014年来自本科室样本库中的HCC及胆道肿瘤患者的肿瘤组织及其匹配肿瘤旁标本,研究叶酸受体蛋白组织中表达情况。结果发现,每3m L血液中叶酸受体数量在肝胆肿瘤中明显高于对照组标本（P<0.05）。30对肿瘤组织中叶酸受体α的m RNA表达水平显着高于肿瘤旁组织（P<0.05）;在HCC组中叶酸受体m RNA表达水平与糖类抗原19-9（r=0.636,P<0.05）、G谷氨酰转移酶（r=0.477,P<0.05）、天门冬氨酸转移酶具有相关性（r=0.5,P<0.05）。蛋白质印迹（30对组织）和免疫组化法（45对组织）分析肝胆组织的肿瘤和肿瘤旁中叶酸受体α蛋白具有显着差异（P<0.05）。综上,本研究结果提示,叶酸受体作为CTC的靶标可能也适用于肝胆肿瘤患者的血液检测,但对于预后评估的价值有待于进一步研究。与肿瘤旁对照组织相比,肝胆肿瘤组织中存在叶酸受体α的表达,其病理意义值得进一步研究。
赵春红[8]（2020）在《荧光定量PCR法与酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒的效果比较》文中提出目的比较荧光定量PCR法与酶联免疫吸附法（ELISA）检测乙型肝炎病毒（HBV）的效果。方法抽取2018年1月至2019年1月于阳泉市第一人民医院就诊中发现的HBV携带者200例,于空腹8～10 h状态下清晨采取肘静脉血,均行ELISA法、荧光定量PCR法检测,将乙型肝炎标志物结果分为7个模式,其中模式1为HBsAg HBeAg HBcAb阳性（大三阳）,模式2为HBsAg HBeAb HBcAb阳性（小三阳）。比较两种方法检测结果。结果 200例检测结果中乙型肝炎血清学标志物阳性模式1（大三阳）50例,HBV-DNA阳性率为98.00%（49/50）、HBV-DNA含量为（8.13±1.01）copy/ml,高于2、3、4、5、6、7模式相应值（P<0.05）;模式2（小三阳）患者60例,HBV-DNA阳性率为86.67%（52/60）,高于3、4、5、6、7模式的阳性率（P<0.05）。其余模式HBV-DNA含量、HBV-DNA阳性率比较差异未见统计学意义（P>0.05）。结论相较于ELISA法,荧光定量PCR法能定量反映HBV感染、复制情况,可为早期诊断乙型肝炎、传染性质判断及监测病情归转提供重要依据。
陈欢[9]（2020）在《肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响》文中进行了进一步梳理目的:内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是多种肝脏疾病中一种常见病理现象,可被乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）等多种因素所诱导,在前期研究中我们发现肝细胞ERS明显降低细胞外HBV DNA及相关抗原水平,然而ERS对肝细胞内HBV DNA复制及其抗原合成的影响尚不清楚,另外,肝细胞ERS对抗病毒药物的影响尚无研究。本课题旨在初步探讨ERS对HBV复制及恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒作用的影响。方法:以HBV稳定转染人肝癌细胞株Hep G2.2.15细胞为研究对象,用毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）诱导细胞发生ERS,以建立ERS细胞模型。应用流式细胞术检测TG对细胞凋亡的影响。应用蛋白免疫印迹（western blot,WB）法检测葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）、磷酸化真核起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha,p-e IF2α）和内质网甘露糖甙酶-Ⅰ样蛋白（ER degradation-enhancingα-mannosidase-like protein,EDEM）;实时荧光定量逆转录聚合酶连反应（real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测肌醇酶1（inositol requiring enzyme-1,IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）、GRP78 m RNA判断肝细胞ERS。通过实时荧光聚合酶链反应（real-time fluorescent polymerase chain reaction,PCR）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、q RT-PCR、化学发光微粒子免疫检测法及WB检测细胞培养上清中的HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag水平,细胞内的HBV DNA、3.5kb HBV m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag水平,初步探讨TG诱导的ERS对HBV复制的影响。随后用q RT-PCR检测法尼酯X受体（farnesoid X receptor,FXR）、肝细胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）、核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）等14种影响HBV复制的转录因子的m RNA水平,初筛出TG诱导的ERS影响HBV复制的转录因子;最后用ETV对TG诱导Hep G2.2.15 ERS进行干预,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果:1.流式细胞仪检测细胞凋亡率发现,0.5μM TG作用于Hep G2.2.15细胞24 h、48 h、72 h并未引起明显的细胞凋亡。2.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24h、48h、72h后,GRP78、PERKATF6IRE1 m RNA水平显着上调,GRP78、EDEM蛋白水平及e IF2α磷酸化水平显着增加。以上结果证实TG显着诱导Hep G2.2.15细胞发生ERS并激活内质网相关降解途径（ER-associated degradation,ERAD）。3.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24、48、72h,细胞培养上清中的HBs Ag、HBe Ag显着降低;细胞内HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag和HBc Ag蛋白水平显着升高。4.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞48h,诱导细胞ERS,发现促进HBV复制的11种转录因子,只有FXR上调,其余均呈不同程度的下调;抑制HBV复制的转录因子NF-κB显着性下调。5.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果提示,ETV显着下调Hep G2.2.15细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag及细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白;经TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS后,ETV同样显着下调细胞内外的HBV相关指标;TG处理Hep G2.2.15细胞,经ETV干预后细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显着降低,然而细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白却较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显着升高。以上结果表明TG诱导的ERS抬高了HBV复制基线,延长了细胞内HBV清除所需的时间。6.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天。通过抗病毒治疗后,TG处理的Hep G2.2.15细胞内的GRP78、PERK、ATF6、IRE1 m RNA显着下调,GRP78蛋白表达及e IF2α磷酸化水平也显着下调。结论:1.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS引起HBV DNA、HBs Ag胞内积累与HBV复制作用加强和HBV DNA、HBs Ag分泌减少有关;2.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS促进HBV复制,可能与FXR促进作用增强、NF-κB抑制作用减弱有关;3.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS延长了ETV处理后细胞内HBV清除所需的时间;4.ETV抗病毒作用后可部分缓解细胞ERS。
刘雨琦[10]（2020）在《猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立》文中研究指明猪圆环病毒2型是世界上公认的对养猪业造成严重危害的致病菌之一,可与多种其他病原体混合感染,引起仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征和增生和坏死性肺炎等多种疾病,对各国养猪业造成巨大的影响。猪圆环病毒3型是一种2016年在美国发现的新型病毒,之后在世界各养猪国均有PCV3感染的报道,对未来养猪业会造成不容小觑的影响。猪圆环病毒2型和3型同属于猪圆环病毒,引起的疾病临床表现类似,在我国7个省市均有混合感染的报道,在湖南、湖北和江苏等地,二者混合感染率可达42.9%。目前已建立PCV2和PC V3的免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法,其中包括常见的酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）、聚合酶链式反应（Polym erase Chain Reaction,PCR）和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PC R,q PCR）等检测方法。这些检测方法大多存在耗时长、灵敏度低、易污染等缺点。本实验旨在利用微滴式数字PCR技术（Droplet Digital PCR,dd PCR）建立一种快速、高效、可同时对PCV2和PCV3定量的检测的方法,可对猪的病料组织或者血清等低浓度样本进行特异性定量检测。具体研究内容如下。1.单重PCV2微滴式数字PCR检测方法的建立,单重PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。选择PCV2和PCV3中目的基因的保守序列片段（Gen Bank No.KC823059.1和KY778776）与载体p UC59合成质粒,并利用Primer Premier 5软件设计引物。通过引物筛选、优化退火温度和引物探针浓度比建立PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法,通过特异性实验探究建立的反应体系的特异性,并比较了所建立的PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度和重复性。实验结果表明,当引物探针浓度比为400 n Mv:200 n M和退火温度为56℃时,阳性液滴集中,扩增效果最好,对其他核酸样本无特异性扩增,灵敏度均能达到0.1 fg/μL,dd PCR最低可检出1.1 copies/μL的p UC59-PCV2和1.03 copies/μL的p UC59-PCV3。其中PCV2的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数（R2）分别为0.9941和0.9762,dd PCR的扩增效率为83.41%;PCV3的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数（R2）分别为0.965和0.9575,dd PCR的扩增效率为80.75%。PCV2微滴式数字PCR检测方法与PCV2实时荧光定量PCR检测方法的组内组间实验CV（%）值均小于5,PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV3实时荧光定量PCR检测方法的组内组间CV（%）值均小于6.06,说明本实验所建立的四种检测方法其可重复性好,稳定性强。2.双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。让每个微反应体系都含有两套引物探针,分别用含有FAM和VIC两种不同的报告基团探针进行检测,实现PCV2和PCV3能同时高效的准确定量,提高检测效率,降低检测成本。本实验建立的双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法和的双重PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法灵敏度均能达到0.1 fg/μL,其中双重dd PCR检测检出0.1 fg/μL的p UC59-PCV2和p UC59-PCV3的拷贝数为1.1 copies/μL和1.32 copies/μL,双重q PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数（R2）分别为0.9907和0.9682,双重dd PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数（R2）分别为0.9651和0.9638,扩增效率分别为83.9%和78.8%。方差分析结果表明四个F值均小于其F crit值,则F值在a=0.05的水平上不显着差异。说明本实验建立的双重微滴式数字PCR和双重实时荧光定量PCR与单重检测之间结果无显着差异,且均呈现良好的线性关系。3.实际样本检测和试剂盒研发。利用已建立的q PCR和dd PCR两种检测方法对95份疑似感染PCV2的病猪样本进行检测,其中q PCR的阳性检出率为60%（57/95）,dd PCR的检出率为62.10%（59/95）,两种方法检测结果的kappa系数为0.9766,说明两种方法具有很好的一致性。其中dd PCR对q PCR检测出的疑似结果,能够通过具体拷贝数做出阳性或阴性的判断,在低浓度的检测样本中发挥出独特优势。本章实验也研发了两种双重检测试剂盒,其中试剂盒具有良好的特异性和灵敏度,能满足各种环境和条件下的检测要求,且节约了成本,缩短了检测时间,在一次反应过程种能对PCV2和PCV3同时检出,将会有广阔的市场前景。
二、实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值（论文提纲范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HBV感染促进己糖胺生物合成途径 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 O-GlcNAc修饰对HBV复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰增强其抑制HBV的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 体内实验验证HBV感染后促进SAMHD1蛋白O-GlcNAc修饰 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 O-GlcNAc修饰与病毒感染免疫 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表的学术论文,申请课题,参加会议及获奖情况 |
（3）基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 核酸检测应用简介 |
| 1.2 核酸扩增技术 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.2.2 等温扩增技术 |
| 1.2.3 小结 |
| 1.3 核酸杂交技术 |
| 1.4 高通量测序 |
| 1.5 可编程核酸酶技术 |
| 1.5.1 基于CRISPR/Cas9 的核酸检测方法 |
| 1.5.2 基于CRISPR/Cas13 的核酸检测方法 |
| 1.5.3 基于 CRISPR/Cas12 的核酸检测方法 |
| 1.5.4 基于 CRISPR/Cas14 的核酸检测方法 |
| 1.5.5 小结 |
| 1.6 原核Argonaute |
| 1.6.1 原核Argonaute简介 |
| 1.6.2 原核Argonaute的体外应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第2章 Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的表达纯化及性质研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 寡核苷酸 |
| 2.2.4 本实验所用的培养基 |
| 2.2.5 主要缓冲液 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组PfAgo蛋白质表达载体的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌常规转化 |
| 2.3.3 重组PfAgo蛋白质的表达与纯化 |
| 2.3.4 考马斯亮蓝G250 法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳实验 |
| 2.3.6 TBE-PAGE电泳实验 |
| 2.3.7 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 2.3.8 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 2.3.9 不同长度的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.10 不同匹配区的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.11 PfAgo单碱基专一性探究的实验 |
| 2.3.12 验证PfAgo切割产生的ss DNA也能介导PfAgo酶切的实验 |
| 2.4 实验结果和分析 |
| 2.4.1 PfAgo基因的优化与合成 |
| 2.4.2 PfAgo的表达与纯化 |
| 2.4.3 PfAgo切割活性验证 |
| 2.4.4 g DNA与靶 DNA 的互补区域对PfAgo切割靶 DNA 的影响 |
| 2.4.5 g DNA与靶DNA的单碱基不匹配对PfAgo切割效率的影响 |
| 2.4.6 PfAgo切割信号传递活性验证实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于PfAgo的核酸检测方法 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 双链DNA |
| 3.2.4 寡核苷酸 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 待检测模拟靶DNA的制备 |
| 3.3.2 TBE-PAGE电泳实验 |
| 3.3.3 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 3.3.4 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 3.3.5 DNA扩增反应 |
| 3.3.6 PfAgo介导的核酸检测(PAND)实验 |
| 3.3.7 反应产物的荧光值测定实验 |
| 3.3.8 HEK293T细胞的培养和基因组DNA提取 |
| 3.3.9 PfAgo介导的核酸检测(PAND)的灵敏度验证实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.3.11 临床样品来源 |
| 3.4 实验结果和分析 |
| 3.4.1 探究不同商品化的PCR Mix体系对PfAgo切割靶DNA的影响 |
| 3.4.2 PfAgo介导的核酸检测方法的原理验证 |
| 3.4.3 输入gDNAs与PfAgo的摩尔比对 PAND 的影响 |
| 3.4.4 gn的序列对PfAgo介导的核酸检测的影响 |
| 3.4.5 PfAgo介导的核酸检测的灵敏度探究 |
| 3.4.6 PfAgo介导的核酸检测的专一性探究 |
| 3.4.7 PfAgo介导的核酸检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PfAgo介导的新型冠状病毒核酸检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 主要缓冲液 |
| 4.2.3 寡核苷酸 |
| 4.2.4 TBE-PAGE电泳实验 |
| 4.2.5 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 4.2.6 最佳输入gDNA的筛选 |
| 4.2.7 构建模拟靶质粒 |
| 4.2.8 筛选检测D614G突变的gDNAs |
| 4.2.9 SARS-CoV-2 PAND检测方法的构建 |
| 4.2.10 RT-qPCR实验 |
| 4.2.11 验证SARS-CoV-2 PAND的检测下限 |
| 4.2.12 临床样品来源 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 输入g DNA的优化和SARS-CoV-2 PAND的建立 |
| 4.3.2 SARS-CoV-2 PAND的优化 |
| 4.3.3 探究SARS-CoV-2 PAND的检测灵敏度 |
| 4.3.4 SARS-CoV-2 PAND对实际样本的检测 |
| 4.3.5 SARS-CoV-2 D614G突变体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结合极短PCR和 PfAgo的核酸检测技术 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 主要缓冲液 |
| 5.2.3 TBE-PAGE电泳实验 |
| 5.2.4 寡核苷酸 |
| 5.2.5 构建含有VP72 基因和HPV16E6 基因的质粒 |
| 5.2.6 USPCRP核酸检测方法的初步验证实验 |
| 5.2.7 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.2.8 USPCRP检测灵敏度探究的实验 |
| 5.2.9 USPCRP检测特异性验证实验 |
| 5.2.10 USPCRP检测RNA的实验 |
| 5.2.11 USPCRP临床样品检测实验 |
| 5.3 实验结果和分析 |
| 5.3.1 USPCRP核酸检测方法的初步验证 |
| 5.3.2 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.3.3 USPCRP检测灵敏度探究 |
| 5.3.4 USPCRP检测特异性验证 |
| 5.3.5 USPCRP检测模拟的DNA病毒基因 |
| 5.3.6 USPCRP检测临床样品 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）FQ-PCR和ELISA联合检测用于乙型肝炎的临床价值（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 基本资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 3组HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的阳性检出率比较 |
| 2.2 3组大三阳乙型肝炎病毒DNA载量比较 |
| 3 讨论 |
（6）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）新型分子检测技术在肝胆肿瘤中的初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文中常用缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 高通量测序分析HBV多耐药位点及HBs Ag+/HBs Ab+相关变异 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 数字PCR定量检测TP53基因突变对胆道肿瘤诊断和预后的初步临床研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 循环肿瘤细胞检测技术在肝胆肿瘤临床诊断中的初步应用 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 研究工作小结 |
| 参考文献 |
| 综述 循环肿瘤细胞在原发性肝癌中的研究和临床应用进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PCV的病原学特征 |
| 1.1.1 形态及理化性质 |
| 1.1.2 PCV基因结构特征 |
| 1.2 PCV的复制方式 |
| 1.3 PCV的分类 |
| 1.3.1 PCV1的基因结构 |
| 1.3.2 PCV2的基因结构与分型 |
| 1.3.3 PCV3的基因结构 |
| 1.4 PCV2和PCV3引起的相关综合征和疾病 |
| 1.4.1 PCV2引起的相关综合征和疾病 |
| 1.4.2 PCV3引起的相关综合征和疾病 |
| 1.5 PCV2和PCV3与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.1 PCV2与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.2 PCV3与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.3 PCV2与PCV3的混合感染 |
| 1.6 研究进展 |
| 1.6.1 免疫学诊断方法 |
| 1.6.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.6.3 PCV2和PCV3的双重检测 |
| 1.7 微滴式数字PCR |
| 1.7.1 数字PCR的简介 |
| 1.7.2 数字PCR的分类 |
| 1.7.3 ddPCR的优点 |
| 1.7.4 ddPCR的应用 |
| 1.8 论文研究内容、目的和意义 |
| 1.8.1 研究内容和方法 |
| 1.8.2 研究目的和意义 |
| 第二章 猪圆环病毒2型微滴式数字PCR定量检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验样品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌的培养 |
| 2.2.2 核酸的提取与反转录 |
| 2.2.3 标准品的制备 |
| 2.2.4 标准品的制备 |
| 2.2.5 PCV2的qPCR和ddPCR反应体系的建立和优化 |
| 2.2.6 qPCR和ddPCR检测PCV2的特异性实验 |
| 2.2.7 qPCR和ddPCR检测PCV2的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 2.2.8 qPCR和ddPCR检测PCV2的最低检测限实验和重复性实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 引物的筛选和体系的优化 |
| 2.3.2 qPCR和ddPCR检测PCV2的特异性实验 |
| 2.3.3 qPCR和ddPCR检测PCV2的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 2.3.4 qPCR和ddPCR检测PCV2的最低检测限实验和重复性实验 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 微滴式数字PCR检测猪圆环病毒3型方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验样品 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 引物的筛选和体系的优化 |
| 3.3.2 qPCR和ddPCR检测PCV3的特异性实验 |
| 3.3.3 qPCR和ddPCR检测PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 3.3.4 qPCR和ddPCR检测PCV3的最低检测限实验和重复性实验 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 双重微滴式数字PCR检测猪圆环病毒2型和3型方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验样品 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 标准品的制备 |
| 4.2.2 引物与探针的设计合成 |
| 4.2.3 双重qPCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.2.4 双重dd PCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.2.5 双重qPCR检测PCV2和PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 4.2.6 双重dd PCR检测PCV2和PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 4.2.7 方差分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 双重qPCR和双重dd PCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.3.2 双重qPCR和双重dd PCR检测PCV2和PCV3灵敏度实验 |
| 4.3.3 方差分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 实际样本检测和实际应用 |
| 5.1 实际样本检测 |
| 5.1.1 实验样本 |
| 5.1.2 提取方法 |
| 5.1.3 实际样本检测结果 |
| 5.2 猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测试剂盒的研发 |
| 5.2.1 简介 |
| 5.2.2 试剂盒组成 |
| 5.2.3 具体操作步骤 |
| 5.2.4 结果判读 |
| 5.2.5 注意事项 |
| 5.3 猪圆环病毒2型和3型实时荧光PCR检测试剂盒的研发 |
| 5.3.1 简介 |
| 5.3.2 试剂盒组成 |
| 5.3.3 具体操作步骤 |
| 5.3.4 结果判读 |
| 5.3.5 注意事项 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点和应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 中英文缩略表 |
| 攻读硕士学位期间的科研情况 |
| 致谢 |
四、实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值（论文参考文献）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]SAMHD1蛋白的O-GlcNAc修饰抑制HBV复制的机制研究[D]. 胡杰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究[D]. 何如怡. 湖北大学, 2021(01)
- [4]血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究[D]. 刘晓红. 锦州医科大学, 2021(01)
- [5]FQ-PCR和ELISA联合检测用于乙型肝炎的临床价值[J]. 许娇. 中国医药指南, 2021(02)
- [6]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [7]新型分子检测技术在肝胆肿瘤中的初步应用[D]. 肖潇. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [8]荧光定量PCR法与酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒的效果比较[J]. 赵春红. 中国实用医刊, 2020(18)
- [9]肝细胞内质网应激对HBV复制及恩替卡韦抗病毒作用的影响[D]. 陈欢. 遵义医科大学, 2020(12)
- [10]猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立[D]. 刘雨琦. 暨南大学, 2020(03)