一、一个新的人乳源性生物活性肽cDNA克隆与测序分析（论文文献综述）
谢纯[1]（2021）在《两栖动物源抗氧化肽OS-LL11可以抵御UVB辐射造成的小鼠皮肤损伤》文中研究表明[目 的]探索花臭蛙皮肤分泌物中特定的抗氧化肽在紫外辐射方面的保护作用,有助于新型药物或化妆品的研发并为我们理解两栖动物适应环境的分子基础提供依据。[方法]用紫外辐射灯照射小鼠背部皮肤,第一周每天进行辐射,辐射剂量150mJ/cm2,第二、三周隔天辐射,辐射剂量300 mJ/cm2,每次辐射结束将样品（OS-LL11溶于ddH2O）涂抹于小鼠背部皮肤上,实验结束后取小鼠背部皮肤组织进行病理组织切片染色观察表皮和真皮的变化;可能的机制研究主要包括检测样品在动物和细胞水平的抗氧化活性、抗炎活性以及抗凋亡作用。抗氧化活性的检测主要包括体外自由基清除能力测试（ABTS、DPPH）以及动物和细胞水平抗氧化相关酶、活性氧和抗氧化相关蛋白表达情况的检测（SOD、GSH、NO、H2O2、LPO、MDA、CAT、LDH、ROS、Keap1、HO-1、GCLM、NQO1）;抗炎活性的检测主要包括炎性细胞因子以及免疫调节因子的检测（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α）;抗凋亡作用的检测主要包括凋亡细胞以及凋亡相关因子的检测（TUNEL、8-OHdG、Bax、Bcl-2）.[结 果]（1）在本研究中,从花臭蛙中获得了一条抗氧化活性肽,命名为OS-LL11,在NCBI数据库进行的BLAST序列比对未发现有与之相似的氨基酸序列,是一个全新的肽,其前肽由61个氨基酸组成,从N端到C端的成熟肽序列为‘LLPPWLCPRNK’。（2）样品对实验动物表观影响方面的实验结果表明:经过OS-LL11处理过的皮肤在红斑、脱屑以及结痂方面的情况明显得到了改善;经过OS-LL11处理的小鼠背部皮肤表皮和真皮增厚的情况也得到了显着的改善。（3）可能的机制研究结果如下:OS-LL11具有直接清除ABTS自由基的能力;OS-LL11可以提升抗氧化酶的活性以及相关生化指标的水平,OS-LL11可以抑制ROS的释放,降低氧化应激相关生化指标的水平,提升抗氧化相关蛋白的表达;经过OS-LL11处理炎性细胞因子以及免疫调节因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α）的水平明显出现了降低;OS-LL11下调了凋亡小体的数量,一定程度上抑制了表皮内细胞凋亡的发生,OS-LL11下调8-OHdG的水平,提升Bcl-2的水平并降低Bax的水平并且保护了细胞免受氧化应激造成的细胞凋亡从而表现出抗凋亡能力。[结论]（1）从花臭蛙的皮肤分泌物中获取了一条全新的抗氧化肽OS-LL11,成熟肽氨基酸序列‘LLPPWLCPRNK’。（2）OS-LL11可以显着改善经UVB辐射诱导的小鼠背部皮肤受损情况,并可以降低经UVB辐射导致的表皮和真皮增厚的情况。（3）OS-LL11具备体外自由基清除能力,同时也具有一定的抗氧化能力;此外OS-LL11还具有抗炎能力;最后OS-LL11具有抗凋亡的作用。
郑利兵[2]（2019）在《大黄鱼piscidin 5 like的抗性特性研究》文中指出大黄鱼Larimichthys crocea是我国近海重要的经济鱼类,我国东南沿海最具特色的海水养殖鱼类,也是我国当前海水网箱养殖单一产量最高的品种。大黄鱼产业已是我国海水鱼类渔业链较为完整和辐射范围较广的产业。然而,人工养殖过程中导致了各种疾病的暴发,由刺激隐核虫Cryptocaryon irritans感染而引发的海水白点病尤为严重,可引起养殖大黄鱼的死亡率高达75%,造成巨大的经济损失。目前,化学药物如抗生素等的使用对海水白点病疗效不显着,还会引起药物抗性、药物残留、水体微生态系统遭受破坏等严重的副作用。因此,寻求一类可以部分替代或完全取代抗生素等化学药物的海水白点病防治药物是当前养殖生产亟需的。抗菌肽（Antimicrobialpeptides,AMPs）作为鱼类先天体液免疫中的重要组成成份,在鱼体的免疫防御中发挥重要作用,其多样的生物学活性已逐渐被发现,大量的新型AMPs被分离。Piscidins是一类具有预防细菌性、病毒性及寄生虫性疾病潜力的AMP。本论文基于刺激隐核虫人工感染大黄鱼3d后的肝脏转录组库,筛选差异表达AMPs,从中选择上调表达量和差异倍数均为最大的piscidin 5 like（命名为Lc-P5L）作为主要研究对象。在mRNA水平上,利用实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）和原位杂交（In situ hybridization,ISH）技术分别检测刺激隐核虫感染大黄鱼整个周期不同组织中Lc-P5L mRNA的转录应答模式,及组织、细胞定位变化;在蛋白水平上,构建了 Lc-P5L原核表达系统,优化了重组蛋白rLc-P5L的诱导表达、纯化工艺,分析了 rLc-P5L的抗菌、抗刺激隐核虫活性。主要结果如下:1、刺激隐核虫感染大黄鱼后肝脏转录组差异表达AMPs的筛选以差异表达基因为资源库,挖掘其中的差异表达AMPs,包括piscidin 5 like、piscidin 5 like type 4、liver expressed antibacterial peptide 2 like（LEAP 2 like）、LEAP-2 A、hepcidin、hepcidin-like、bactericidal permeability-increasing protein（BPI）共7种AMPs。其中LEAP 2家族的2个候选成员在刺激隐核虫感染3d后下调表达,其余5种均上调表达;另外,有3条序列与大黄鱼LEAP-2A基因组序列（KJ024788）具有很高的相似性,推测大黄鱼LEAP-2A基因存在可变剪切现象,但是否是因刺激隐核虫感染而引起,还有待于进一步的实验验证。2、刺激隐核虫感染前后Lc-P5L mRNA的组织、细胞定位利用ISH技术检测到Lc-P5L mRNA主要分布于大黄鱼健康个体的头肾组织中,其次为鳃、肠道、脾脏和肝脏,肌肉组织中未检测到任何阳性信号。转录表达Lc-P5L mRNA的为肥大细胞。头肾组织中,阳性信号主要围绕黑色素瘤巨噬细胞中心呈放射状分布,由内而外阳性信号数量增多、强度增强;肠道中阳性信号分布于粘膜下层;肝脏中较少的阳性信号随机分布于实质组织中。刺激隐核虫感染大黄鱼后,头肾、肠道、肝脏3种组织中Lc-P5L mRNA阳性信号的数量未发生明显变化,仅在信号强度上增强,说明这3种组织中Lc-P5L mRNA含量的增高是通过增强肥大细胞转录Lc-P5L mRNA的能力实现。大黄鱼健康个体鳃组织中阳性信号主要分布于鳃丝上,沿着鳃丝软骨两侧的血管分布,从底部到顶端逐渐增多,鳃小片的不同部位也有分布;刺激隐核虫感染后鳃组织中阳性信号数量增多、信号强度增强,且在鳃弓与鳃丝交接处出现明显阳性信号的聚集,而鳃丝顶端阳性信号的聚集程度减弱。健康大黄鱼个体脾脏中阳性信号主要沿着脾脏组织两侧边缘分布;感染后增多、增强的阳性信号分散分布于整个脾脏组织中。ISH的组织定位与qRT-PCR结果一致,也与已报道piscidin家族的组织、细胞定位相一致。3、刺激隐核虫感染大黄鱼后Lc-P5L mRNA的时空表达刺激隐核虫感染大黄鱼后,qRT-PCR结果表明所检测的6种组织中Lc-P5L mRNA都发生显着上调,显着上调的时间点与刺激隐核虫感染大黄鱼的发育周期相吻合,表明刺激隐核虫幼虫感染、滋养体寄生、滋养体脱落后的继发性细菌感染等不同阶段均能够引发宿主强烈的免疫反应。4、大黄鱼piscidin 5 like重组蛋白（rLc-P5L）的体外诱导表达、纯化工艺的优化以pET-28a为载体,E.coli BL21为表达宿主菌成功构建了大黄鱼原核表达系统,分别优化了 IPTG诱导和自诱导表达条件,建立了纯化工艺。体外原核表达系统在添加0.5%葡萄糖的改进LB培养基中,OD600达到0.5时添加终浓度为0.3mM的IPTG于28℃条件下诱导4h,或者在简化的自诱导培养基中37℃诱导6h均可获得最大诱导量。诱导表达的rLc-P5L以包涵体形式存在,通过咪唑梯度洗脱优化纯化条件获得rLc-P5L。利用western blot、质谱鉴定技术确证所获的rLc-P5L正确。构建的重组表达系统将为更深入地进行Lc-P5L的功能研究保障了材料供应,也为鱼类基因工程产品的发酵生产、创新药物或添加剂的开发等提供了重要的关键技术支撑。5、rLc-P5L的抗性特性体外抗菌试验结果表明rLc-P5L具有广谱抗菌活性,杀菌活性呈浓度和时间依赖性;扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）观察到 rLc-P5L能够引起菌体聚集,产生的大量丝状或絮状物缠绕、裹覆菌体;rLc-P5L能够通过一些病原相关分子模式靶向病原菌,并进入菌体内部结合到病原菌基因组DNA上。实验表明rLc-P5L还具备很强的抗虫活性,可通过解聚细胞核、破坏细胞膜导致虫体内容物外泄而杀灭刺激隐核虫。rLc-P5L抗性活性强,在抗菌、抗虫的有效浓度下,对真核细胞不具溶血性,有望成为创新药物、添加剂的重要候选物。
张民[3]（2018）在《海洋鱼类暴露17α-炔雌醇的毒性效应及其免疫毒性机制研究》文中研究表明17α-炔雌醇（EE2）广泛存在于海洋环境中,是一种重要的内分泌干扰物,具有内分泌干扰效应和免疫毒性,已有报道其毒性作用可影响鱼类的健康生长和种群繁殖,而先天性免疫在鱼类抵抗病原感染中具有重要作用,因此,研究环境雌激素类污染物对鱼类的免疫毒性效应具有重要的科学意义。虽然EE2对鱼类的生殖毒性和免疫毒性效应方面的研究有较多报道,但关于EE2免疫毒性机制的研究报道很少。本研究选择典型的内分泌干扰物EE2为受试物,以海洋模式动物海水青鳉和海水养殖经济鱼类黑鲷为研究对象,从基因和蛋白水平评价了不同剂量不同暴露时间的EE2对海洋鱼类胚胎、仔鱼和成鱼各组织的内分泌相关的雌激素受体（ER）基因以及不同免疫学参数表达模式的影响,并从这些因子变化中找到了雌激素受体（ER）基因与免疫因子抗菌肽基因的相关性,以此为研究重点,探讨了 EE2对海洋鱼类的免疫毒性效应的可能致毒调控机制。该研究对于深入理解环境污染物对海洋鱼类的毒性效应与鱼类先天性免疫因子的应答反应之间的相互作用机制具有重要的理论价值与指导意义。研究结果如下:（1）克隆获得了海水青鳉雌激素受体（OM-ERs）基因三个亚型的cDNA序列,分别命名为 OM-ERα、OM-ERβ1、OM-ERβ2;OM-ERα 基因（Genbank登录号:JF972761）的cDNA序列为2762 bp,编码618个氨基酸;OM-ERβ1基因（Genbank登录号:JF972762）的cDNA序列为2835 bp,编码562个氨基酸;OM-ERβ2 基因（Genbank 登录号:JF972763）的 cDNA 序列为 2471 bp,编码631个氨基酸。进化树分析显示,所克隆的基因是海水青鳉雌激素受体基因属于经典核受体家族成员,结构上包含经典5个功能域:A/B、C、D、E、F区。获得抗OM-ERα的多克隆抗体,并通过western-blot实验进行验证,结果显示抗体特异性符合实验要求。（2）揭示了 OM-ERα、OM-ERβ1和OM-ERβ2在海水青鲔健康成鱼各组织以及不同发育阶段中的表达特性;OM-ERα在精巢、卵巢和脾脏中表达量最高,其次为雌性肝脏,但在雄性肝脏较低;OM-ERβ1在肝脏、精巢和卵巢中表达量较高,且精巢显着高于卵巢,其次为肠和胃;OM-ERβ2在肝脏、精巢和卵巢中高表达,且精巢中的表达量高于卵巢。OM-ERs基因在肝脏和性腺中均高表达,推测其可能参与内分泌调节,且OM-ERα在免疫器官脾脏中也高表达,推测其反应可能与免疫反应有关。从胚胎到仔鱼不同发育阶段,OM-ERcα表达量均较低;OM-ERβl和OM-ERβ2的表达量随发育阶段的进行逐渐升高。（3）阐明了不同浓度（5、50、500ng/L）EE2暴露不同时间OM-ERs的表达模式;EE2暴露可以显着诱导雄性成鱼肝脏、精巢以及仔鱼的OM-ERα基因表达,且随着暴露时间的延长和浓度的增加,其诱导作用加强,其中成鱼肝脏变化最明显。EE2急性暴露下,高浓度诱导雄性成鱼肝脏内OM-ERβ1和OM-ERβ2表达,低浓度抑制其表达;而慢性暴露下,高浓度暴露抑制肝脏OM-ERβ2表达,低浓度诱导OM-ERβ2表达,呈现呈现低浓度诱导、高浓度抑制的趋势,这与仔鱼暴露EE2后OM-ERβ2的表达规律相同。EE2暴露显着诱导海水青鳉仔鱼和雄性成鱼肝脏内OM-vtgl基因的表达,且呈浓度依赖和时间依赖关系,而胚胎OM-vtgl基因变化不明显,说明成鱼和仔鱼比胚胎对EE2暴露更敏感。上述结果表明,不同发育期的海水青鳉对EE2暴露的敏感度不同,其OM-ERs基因的应答模式也存在差异。（4）阐明了不同浓度（5、50、500 ng/L）EE2暴露对海水青鳉雄性成鱼肝脏内免疫相关基因的影响;EE2急性暴露12-96 h和慢性暴露7-21 d均抑制OM-hepl的表达;EE2急性和慢性暴露显着抑制JAK/STAT免疫信号通路基因的转录表达;EE2急性暴露3-12 h,作为一种刺激原激活MyD88/NF-κB信号通路,随着暴露时间的持续,EE2抑制MyD88/NF-κKB信号通路,影响肝脏免疫功能;500ng/LEE2暴露14、21 d显着抑制代谢基因CYP1A1表达以及肝脏ACP、AKP酶活活性,降低机体对毒物的代谢能力,产生肝脏损伤。综上说明,EE2暴露显着抑制了海水青鳉和黑鲷的免疫反应和免疫活性。（5）揭示了 OM-hepl启动子区域的关键转录调控元件:通过基因步移技术,克隆获得了海水青鳉抗菌肽基因OM-hepl的5’侧翼序列2558 bp。利用双荧光素酶报告基因系统和鲤鱼EPC细胞系、人肝癌细胞系HepG2,构建OM-hepl启动子的多种删除与突变重组子,成功界定了该启动子的关键转录调控元件HepERE（-315 至-289 bp）,且 HepERE 包含预测的 ERE-like 结合位点（-315 至-293 bp）。利用EPC和HepG2细胞,发现EE2刺激显着抑制OM-hep1启动子活性;利用pCMV-HA载体在HepG2细胞内过表达OM-ERα,同样抑制OM-hep1启动子活性,表明ERα蛋白可能作为一个转录调控因子,在EE2刺激下对OM-hep1基因具有负调控作用。进一步通过活体试验,发现EE2暴露海水青鳉,显着诱导肝脏OM-ERα基因表达,而抑制OM-hep1基因表达;反之,注射雌激素受体抑制剂ICI 182780后,再进行EE2暴露,EE2对OM-hep1基因表达无抑制作用,活体试验验证了 OM-ERα与OM-hep1基因表达的关系。（6）利用凝胶迁移实验（EMSA）和表面等离子共振（SPR）技术进一步验证了 OM-hep1启动子的关键转录调控元件HepERE:人工合成生物素标记探针HepERE-biotin。pCMV-HA-OM-ERα 转染 HEK293T 细胞,提取核蛋白,进行EMSA实验,成功检测到超迁移条带,证明OM-ERα可与HepERE结合。研究表明,雌激素受体的DNA结合域（DBD）在不同物种间高度保守,利用BiacoreTM T200分子互作仪和表面等离子共振（SPR）技术,检测人hERα与HepERE的结合强度,结果显示,两者之间亲和力KD = 8.6 nmol/L,为强结合。上述结果表明,OM-ERα与OM-hep1启动子调控区上的HepERE调控元件强效结合。综上所述,EE2暴露对海洋鱼类具有免疫毒性效应,可影响鱼类的免疫应答与活性;并首次揭示,抗菌肽OM-hep1基因启动子区HepERE（包含ERE-like位点）是EE2暴露产生免疫毒性机制的关键转录调控元件;同时,揭示了一条新的鱼类hepcidin转录调控的信号通路,该信号通路在EE2刺激下由ERα和HepERE介导,显着丰富了关于哺乳动物和鱼类中hepcidin基因的转录调控机制;为深入研究海洋环境激素类污染物的免疫毒性与海洋鱼类健康生存的关系奠定了基础。
王明[4]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中认为外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
弓建芳[5]（2016）在《Ec-cLYZ基因和hLTF基因重组腺病毒的构建及其抑菌效果评价》文中研究表明与哺乳动物相比较,鱼类的获得性免疫系统较脆弱,固有免疫在抵抗外来病原入侵中发挥着极其重要的作用,石斑鱼的c型溶菌酶（Epinephelus coioides c type Lysozyme,Ec-c LYZ）是其体内重要的非特异性免疫因子之一,c LYZ不仅能抑制革兰氏阳性菌而且对革兰氏阴性菌也有抑制作用。人乳铁蛋白（Human Lactoferrin,h LTF）是主要存在于乳汁中的一种铁结合性糖蛋白,富含多种氨基酸,具有广谱的抗菌性及免疫作用、抗氧化作用、抗炎、抗病毒、抑癌等生物学功能。由于h LTF具有强烈螯合铁离子的作用,而铁元素几乎是所有细菌生长不可缺少的,因此,h LTF可以通过阻止细菌利用铁离子而发挥抑菌作用;其次,h LTF作为蛋白酶,还可以降解一些细菌的毒力,进而降低微生物的致病性。本研究通过构建Ec-c LYZ基因和h LTF基因的重组腺病毒,对其双基因协同抑菌效果进行评价。本试验根据Gen Bank中c LYZ基因序列（JQ287658.1）和h LTF基因序列（AY875691.1）,设计特异性引物,分别从石斑鱼头肾组织和人乳体细胞中扩增得到c LYZ基因和h LTF基因,将目的基因分别连接于p MD-19T载体,命名为p MD-c LYZ和p MD-h LTF;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和穿梭质粒p DC315-MCS-EGFP进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭载体p DC315-c LYZ、p DC315-h LTF和p DC315-c LYZ-h LTF;将构建好的重组腺病毒穿梭质粒p DC315-c LYZ、p DC315-h LTF、p DC315-c LYZ-h LTF、对照质粒p DC315-MCS-EGFP和骨架质粒,在脂质体Lipofiter TM介导下共同转染HEK 293细胞,进行病毒的包装与扩增;收获的重组腺病毒能够感染HEK293细胞并引起细胞病变,通过RT-PCR检测到重组腺病毒在细胞内的复制,Western blotting检测外源蛋白在细胞内的表达;重组腺病毒经纯化后用50%组织培养感染计量法（TCID50）测定病毒滴度,将获得的阳性重组腺病毒分别命名为Ad-c LYZ、Ad-h LTF、Ad-c LYZ-h LTF和Ad-GFP;重组腺病毒转染细胞后,提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度,通过滤纸片法测定目的蛋白提取液对试验菌株的抑菌效果;通过测定目的蛋白对试验菌株的最小抑菌浓度,比较目的蛋白和常用抗生素对试验菌株的抑菌效果。试验结果显示:RT-PCR检测证实携带目的基因的重组腺病毒成功导入HEK293细胞;经Western blotting检测,包装后的重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF和Ad-c LYZ-h LTF能够在HEK293细胞中有效表达目的蛋白,并扩增形成大量病毒颗粒,表明包装好的重组腺病毒具有良好的感染性;重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF、Ad-c LYZ-h LTF和Ad-GFP经纯化后,用TCID50法测定病毒的滴度分别为109.54 TCID50/m L、109.25 TCID50/m L、109.87 TCID50/m L和109.16 TCID50/m L,证实高效表达外源蛋白的重组腺病毒具有稳定的感染性,且得到的病毒滴度符合后续试验要求;重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF和Ad-c LYZ-h LTF感染细胞后提取总蛋白,经测定,蛋白浓度分别为2.481 mg/m L、2.675 mg/m L和3.228 mg/m L;敏感性检测结果显示5种致病菌对表达的c LYZ蛋白、h LTF蛋白和双基因蛋白均较敏感,且双基因蛋白对试验菌株的抑制作用较强;无乳链球菌、金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26001）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）、停乳链球菌（ATCC9809）和大肠杆菌（K88）的MIC分别为37.5μg/m L、37.5μg/m L、37.5μg/m L、75μg/m L和150μg/m L;最小抑菌浓度的目的蛋白对试验菌株的抑菌效果与常用抗生素相当,甚至更优。本研究首次将石斑鱼c型溶菌酶的广谱抗菌效果、人乳铁蛋白的抑菌杀菌作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合,表达上述基因的重组腺病毒,试验结果显示目的蛋白对试验菌株表现出良好的抑菌活性,为临床细菌性疾病的生物防治奠定了理论和试验基础。
王承东[6]（2015）在《大熊猫不同泌乳期乳汁microRNA表达谱研究》文中提出乳汁营养丰富,不仅食用方便,而且容易消化,特别是母乳,更是人类和其他哺乳动物婴儿最理想的天然食品,可以促进婴儿的免疫系统发育和功能完善,增强机体全身性的疾病抵抗能力。MicroRNAs （miRNAs）是一类长约22 nucleotide （nt）、单链、高度保守的非编码小RNA分子,在真核生物中广泛存在,主要通过与靶基因mRNA3’非编码区互补结合来抑制表达或使其降解,进而在转录后调控基因的表达。越来越多的研究表明,miRNA也参与到乳汁的生成功能,并影响其免疫调控相关的功能。然而,目前仍没有关于miRNA在大熊猫乳汁中的调控作用研究,其中的机理也不明确。于是,本研究以大熊猫不同时间点的乳汁作为研究材料（0d、3d、7d、15d、30d）,通过高通量测序的技术手段,检测乳汁中的microRNAome,并比较分析其阶段特征,为从分子水平解释乳汁的生成和调控的机制,主要结果如下：（1）本实验首次成功地构建了大熊猫泌乳初期5个不同时间点（出生后Od、3d、7d、15d、30d）乳汁中miRNA的动态表达谱,填补了目前miRBase数据库大熊猫miRNA信息记录的空白。（2）为了评估实验结果的可靠性和操作稳定性,对平行实验的结果做了相关性分析,同时用荧光定量的方式验证了高通量测序的数据。结果显示：生物学重复之间相关系数高（r>0.95,P<0.05）,表明本研究所用生物学个体具有非常强的重复性； 高通量测序与Q-PCR验证结果之间有很好的相关性（r>0.8,P<0.05）,反应了本研究所获得的高通量测序数据高可信度。综合表明,本次实验操作稳定性强,miRNA高通量测序的结果准确可靠,保证了后续的分析结果的可信、可靠。（3）高通量测序结果表明,大熊猫乳汁中表达了大量的miRNAs,绝大部分测序数据能够定位到大熊猫基因组中,并且能够比对到多种哺乳动物在miRBase数据库中的前体序列。过滤后的Clean数据,绝大部分的小RNA长度在21-24 nt,并且22 nt长度的测序数据占据大部分（47.89%）,其次为21和23nt长度的小RNA序列,分别占到了总测序小RNA数据的22.14%和20.32%,这些小RNA序列长度的特征符合典型的Dicer酶加工后的产物,满足miRNA的基本结构特性。（4）通过生物信息分析的方法,高通量测序结果在5个时期的乳汁共7个miRNA测序文库中（0d、3d-1、3d-2、3d-3、7d、15d、30d）,共鉴定了320个熊猫乳汁中表达的miRNA,其来源于226条前体miRNA序列。（5）通过序列比对分析,结果发现大熊猫表达的miRNA序列,在哺乳动物间高度保守。本次实验鉴定的miRNA序列绝大部分能在9个物种中同时比对上（18.75%）,其次有51条miRNA序列（15.94%）能同时比对到10个哺乳动物的miRNA前体数据库（miRBase 20.0）,并且有71条序列在大于10个哺乳动物间高度保守（22.19%）。95%以上的1niRNA序列,至少在5种哺乳动物中都保守性的存在。（6）与其他动物及组织的miRNA表达谱类似,依然存在多个前体序列（pre-miRNA）编码相同成熟miRNA序列的现象,最终大熊猫乳汁中所鉴定的320个成熟体miRNA,对应于282条特异性的miRNA序列,即至少有38条miRNA序列产生于两个及以上不同的前体序列或基因组位置。（7）在]miRNA表达量的丰度上,大熊猫乳汁分泌的各个阶段,都展现出极为类似的偏向于少数种类的miRNA非常高丰度的表达（表达量前25%的miRNA,能表达该阶段90%以上的表达量,并且表达量最高的10个miRNA能占到该库一半的表达量）,而绝大多数的miRNA呈低丰度的表达(75%的miRNA,仅表达该阶段不到7%的表达量。（8）通过比较分析不同泌乳阶段的miRNA表达谱,结果发现绝大多数种类的miRNA在各个泌乳阶段都有表达（154,54.61%）,并且其中的39种类型的miRNA序列持续高丰度表达（从出生到30天）,靶基因和通路分析结果暗示：这些持续高丰度表达的miRNA对维持大熊猫在调控大熊猫泌乳系统的完善和泌乳都发挥着重要的调控作用,也在调控大脑、神经、脉管系统、内脏器官、肢体等的发育和完善中具有重要作用；与持续高丰度表达的miRNA相比,虽然只有少数种类的miRNA仅在某一泌乳阶段特异性地表达（57,20.210%）并且表达的丰度很低（reads<1000）,但这些阶段特异性的miRNA适应了不同泌乳阶段的需要,特别是在初乳阶段促进免疫相关的通路和调控元件。（9）对各泌乳阶段同时表达的miRNA表达量做短时间序列分析（STEM）,以进一步探究不同泌乳阶段的miRNA表达规律,结果表明：其中有2种类型的表达模式呈显着富集的类型,并且在初乳中高表达的miRNA富集于细胞基础代谢相关的生物过程和通路,在常乳中富集的miRNA富集于脑、神经、心血脉管、内脏及肢体的发育等通路。（10）通过不同阶段乳汁中miRNA表达谱信息聚类分析,结果发现乳汁中miRNA的表达谱展现出泌乳阶段特异性,即在初乳与常乳间存在着统计学差异。结果表明：初生后0天和3天的乳汁聚为一类,而7天、15天和30天的乳汁聚为另一类。（11）高通量测序的（将测序得到的数据,与竹子的基因组序列和其在miRBase中收录的数据进行比对）和荧光定量验证的结果,都发现在大熊猫乳汁中,真实存在着竹子的miRNA序列,并且在熊猫体内具有很好的稳定性,暗示了大熊猫主食竹子中的miRNA可能是通过消化道而直接进入大熊猫的体内发挥其调控功能,从而潜在影响着大熊猫泌乳系统的发育和乳汁的分泌。综上所述,本研究不仅首次构建了大熊猫的miRNA表达谱,丰富了大熊猫基础数据库的参考信息,同时比较分析了大熊猫不同泌乳阶段miRNA表达谱的特征及差异,鉴定出了各泌乳阶段持续高表达和特异表达的miRNA,并预测分析了它们在乳汁中的生物调控作用,也探究了植物miRNA对大熊猫乳汁分泌的影响,研究结果有助于解释miRNA在大熊猫泌乳和早期免疫完善中的调控角色。
兰楠海[7]（2012）在《猪生长激素模拟肽的筛选与活性鉴定》文中研究说明猪生长激素是由191个氨基酸组成的多肽类激素,主要由脑垂体分泌。大量研究表明生长激素具有促进蛋白合成、脂肪分解、骨细胞增殖、加快脂类代谢等重要的生物学作用。研究者们最初尝试提取猪脑垂体组织中的生长激素,加以利用。但由于生长激素分泌呈周期性、分泌量少、纯化工艺复杂等各种因素,使得生长激素的研究只停留在试验阶段,80年代中后期,随着分子生物学的进一步发展,人们开始通过基因表达的方式制备重组的生长激素,这为猪生长激素的应用提供了有利的条件。在生产实践中,研究者开始小规模的应用生长激素,取得了一定的效果,重组的生长激素促生长作用效果明显,但顾虑到动物产品中激素残留问题,所以包括我国在内的世界上大多数国家禁止在动物生产中使用外源性生长激素。因此,深入研究生长激素的促生长机理并寻找安全有效的替代物,一直是动物促生长研究中的重要的研究方向。主要从以下几个方面开展了生长激素模拟物的研究:（1）基于配体诱导受体二聚化是生长激素受体激活的前提必要条件,所以通过制备生长激素受体的抗体（IgG类）的方式,来模拟生长激素作用。（2）通过寻找生长激素分子上的关键活性序列（主要生长激素与受体的结合位点）合成多肽,用以模拟生长激素作用。（3）基于Jerne的免疫网络理论,以“内影像”型抗独特型抗体作为生长激素的模拟物。（4）基于生长激素负反馈调节机制,即通过抑制生长抑素进而达到促进生长激素的分泌的目的。主要研究结果包括以下几个方面:（1）利用本实验室制备并已获得国家发明专利的猪生长激素抗体为靶标,通过噬菌体随机12肽库的“吸附—洗脱—扩增”淘选程序,经过反复三轮的淘选,筛选出了与猪生长激素单克隆抗体特异性结合的噬菌体。提取其ssDNA并进行测序,并对其测序结果进行肽序列分析,筛选出含有相同氨基酸组成且出现频率较高的氨基酸序列,然后对所得序列进行氨基酸序列比对分析,发现共有2组同源性较高氨基酸序列,结合计算生物学分析确定核心序列为RPCLPHCNSTSD（相关研究内容已申报国家发明专利,专利申请号为201110442548.8）。（2）在建立的体外猪肝细胞模型上,进行了猪生长激素模拟肽的活性验证试验,通过激光共聚焦显微镜观察、流式细胞分析、竞争性结合受体分析等技术手段验证了猪生长激素模拟肽能够与肝细胞表面的生长激素受体相结合。通过Western-blot与流式细胞技术证实了猪生长激素模拟肽可以激活猪肝细胞上生长激素受体并启动JAK-STAT信号转导通路,并且也证明了猪生长激素模拟肽能够促进肝细胞生长因子IGF-I的分泌。（3）猪生长激素模拟肽信号转导机制的研究表明,猪生长激素模拟肽与猪生长激素激活了相同的信号转导路径。此外,猪生长激素模拟肽以剂量依赖性的方式激活信号转到蛋白,呈钟形激活曲线,其最大的激活浓度为其KD值的1/2左右,同时辅以抗体激活猪生长激素受体机制为佐证,表明猪生长激素模拟肽可能是通过二聚化的方式激活生长激素受体。（4）从猪生长激素的负反馈调节机制方面进行了初步的研究,构建了猪生长抑素受体的模型,并通过计算机软件与服务器评估了生长抑素受体模型的正确性,这也为猪生长激素的负调节机制的研究奠定了一定的理论基础。综上所述,利用噬菌体展示技术筛选了猪生长激素模拟肽,通过筛选、鉴定、组合、和验证等过程,我们获得猪生长激素模拟肽的核心氨基酸序列,并在此基础上,以肝细胞为模型,在细胞水平上验证了猪生长激素模拟肽能够特异性的与猪生长激素受体结合,并启动JAK-STAT信号转导通路,刺激肝细胞分泌IGF-I。此外,本研究还从生物信息学角度对猪生长激素的负反馈调节机制进行了初步的分析与预测。本研究采用活性肽模拟猪生长激素的方式,为实现动物的调控促生长研究提供理论依据,也为进一步探讨免疫调控激素促生长作用的机理,研制开发可替代激素的安全有效的新型生长激素活性肽疫苗奠定理论和技术基础。
白冰[8]（2011）在《中国林蛙皮肤活性多肽基因表达的多样性研究》文中进行了进一步梳理生物活性肽是从动、植物等天然产物中以及微生物中分离出来的肽段,这些肽段可以是只有2个氨基酸组成的双肽,也可以是复杂的长链和环状多肽。生物活性肽按照功能可分为生理活性肽以及其它生物活性肽,其中生理活性肽包括抗菌肽,抗病毒多肽,神经活性肽,激素以及激素调节肽,免疫活性肽等等。由于人工化学合成或从天然产物中分离生物活性多肽成本高,价格昂贵,实际应用中存在许多困难,这就需要对活性多肽的物理化学性质,基因结构及表达情况等基础性问题进行深入的研究。中国林蛙（Rana chensinensis）是欧洲林蛙的中国亚种,其皮肤中含有大量丰富的生物活性肽。本研究根据蛙类Rana属中抗菌肽的信号肽末端的保守序列设计简并引物,并且利用RT-PCR技术从单个中国林蛙皮肤中共克隆得到196条cDNA序列,其中有173条为有义cDNA序列,共编码了35条不同的抗菌肽前体和23条不同的成熟肽,1条缓激肽前体和一些特殊的活性多肽序列。这点充分说明中国林蛙个体中活性多肽基因表达具有多样性的特点。其活性多肽前体的氨基酸序列呈现一定的规律性,信号肽区和酸性前肽区序列较保守,而成熟肽区域的氨基酸序列差异性较大。根据生物活性多肽中成熟肽序列差异可将这些多肽分为8个不同的抗菌肽家族和2个缓激肽。抗菌肽家族分别为temporin-1,brevinin-1,brevinin-2,chensinin-1, chensinin-2, chensinin-3, chensinin-4和chensinin-5家族,缓激肽分别为Bradykinin和Thr6-BK。利用生物信息学软件分析得到,8个家族的抗菌肽都呈阳离子性,理论等电点在5.76～10.07之间,分子量在1460.8～3702.4,一般由13～37个氨基酸残基组成。通过抗菌肽库网站的比对,发现中国林蛙皮肤中的大部分抗菌肽与库中已有的抗菌肽相似性达到70%以上,而抗菌肽brevinin-1CEf1和brevinin-1CEf2分别与西藏高原中的高山倭蛙（Nanorana parkeri）相似度为58.82%和50%。在二级结构分析中,除brevinin-1CEc,brevinin-1CEb和chensinin-2不具有α-螺旋区域,而是以含有延伸链为主,其余大部分抗菌肽都含有一段α-螺旋区域。从活性多肽的种类分析,中国林蛙皮肤中含有多种具有研究价值的生物活性肽,包括抗菌肽和缓激肽等。从活性多肽的基因和氨基酸序列分析,抗菌肽的序列高度同源,但成熟肽序列变异较大,其二级结构也存在着差异,这点决定了活性多肽在种类,结构,功能等方面具有多样性。
王臣[9]（2008）在《囊素样肽在哺乳动物中免疫调节机制研究》文中认为法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽类独有的中枢免疫器官,其功能类似与哺乳动物中的骨髓。三肽囊素作为BF组织中分离唯一已知的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。其具有独特组成结构,氨基酸组成顺序为Lys:His:Gly:NH2,其中Lys:His:Gly:NH2为1：0.9：1：0.8。目前,对于囊素免疫学功能的研究主要集中在禽类促进体液免疫方面,至于其在哺乳细胞中的免疫调节机制,还尚需深入研究,有关囊素发挥作用的具体机制尚不清楚,囊素是否与其它多肽一样存在膜受体以及是否通过受体介导而发挥生物学效应还未可知。这些都极大的限制了囊素作为免疫活性分子在临床的广泛应用前景。赵明军等利用噬菌体展示技术筛选与BS单克隆抗体特异性结合肽,发现“TXNL”肽是与BS单克隆抗体特异性结合的保守序列。竞争ELISA表明,该“TXNL”肽在一定程度上可以竞争性抑制BS与BS单克隆抗体结合。生物活性试验表明,该“TXNL”肽与BS也具有类似的生物学作用。提示,对囊素模拟肽的研究可阔宽囊素的应用前景,同时对于囊素免疫调节机制的研究具有积极意义。本研究,基于囊素和模拟肽分子设计几种囊素样肽,通过基因工程串连表达后,在小鼠模型中,研究其作为免疫佐剂在哺乳动物中的对乙脑亚单位疫苗和禽流感灭活疫苗的免疫调节作用,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为新型多肽免疫佐剂的潜能。同时以囊素分子为靶标,利用噬菌体展示技术,研究与之相互作用蛋白,为揭示囊素作用机制和进一步的囊素生物学功能研究提供新的线索。研究主要从以下几个方面展开：1囊素样肽基因的设计及在大肠杆菌中的表达按大肠杆菌惯用密码子通过SOE-PCR方法合成三种囊素样肽基因,108 bp的（K-H-G）10基因由10拷贝的BS（K-H-G）串联,上下游分别带有EcoRI和Sall site位点。116 bp的（T-X-N-L）8基因由8拷贝的BS模拟肽（T-X-N-L）串联,上下游分别带有EcoRI和HindⅢ位点。125bp的（T-X-N-L-K-H-G） 5基因由5拷贝的（T-X-N-L-K-H-G）串联,经测序证明序列正确后,克隆至pET32a载体中,三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE电泳证实,三种融合蛋白主要以可溶形式存在,分别为24.9、25.2和25.5 KDa大小。融合蛋白经Ni2-NTA亲合柱纯化,Western blot结果表明三种融合蛋白与bursin有着相似的免疫反应性。通过基因工程的方法得到囊素样肽的表达产物,为后续研究奠定了基础。2囊素样肽对乙脑亚单位疫苗的免疫效果影响为探讨囊素样肽的免疫调节作用,在小鼠模型中评价其对乙脑亚单位疫苗的免疫效果影响。通过检测保护性抗体JEV-E滴度、抗体亚型（IgG1和IgG2a）、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型发现。使用三种囊素样肽能都明显提高JEV-BD免疫小鼠的特异性免疫反应。IgG2a和细胞因子1NF-γ水平表明JEV-BD主要刺激Thl型免疫反应。而囊素样肽能明显增加小鼠的Th2反应。尤其是（T-X-N-L-K-H-G）5肽能平衡2种类型的免疫反应。实验结果预示,囊素样肽作为佐剂能明显增强JEV亚单位疫苗免疫小鼠的免疫反应,有望能成为一个有潜力的疫苗佐剂。3囊素样肽有效提高禽流感H9N2灭活疫苗对小鼠的免疫保护为进一步研究囊素样肽的免疫调节机制,4-6周龄小鼠随机分为6组,每组30只。用不同剂量合成的囊素样肽T-P-N-L-K-H-G与禽流感H9N2灭活病毒（W1V）混合后分别以肌肉接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别免疫PBS和常规灭活疫苗。最后一次免疫后1周攻毒。然后通过测定HI血清效价、HA抗体和抗体亚型、Thl和Th2类型细胞因子分泌水平、脾T细胞亚群和NK细胞变化、细胞特异性CTL活性以及攻毒保护力来评价囊素样肽作为分子佐剂的免疫调节作用。结果显示,肽佐剂能平衡IgG1和IgG2a的分泌水平。单独WIV抗原免疫主要诱导小鼠Thl类型细胞因子的产生,而肽佐剂能明显提高WIV抗原免疫后小鼠两种类型细胞因子的分泌水平,但对IL-10分泌水平没有促进作用。肽佐剂能有效促进WIV抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞中T细胞CD4+和CD8+亚群的分化。对小鼠脾淋巴细胞中NK细胞的增殖也具有调节作用。中、低剂量肽佐剂联合WIV抗原免疫后,可以诱发小鼠产生较好的针对H9N2病毒的特异性CTL反应,其杀伤率明显高于单独WIV抗原免疫组和H9N2疫苗组。小鼠攻毒后肺脏病毒含量检测显示,囊素样肽有助于WIV抗原免疫后小鼠肺脏病毒的清除。以上结果证实合成的囊素样肽通过介导细胞和体液免疫反应显着提高禽流感H9N2灭活病毒对小鼠的免疫保护。但囊素样肽免疫调节作用不存在剂量依赖关系,高剂量对免疫作用有一定的抑制。对囊素样肽的作用剂量关系还需进一步研究。4小鼠杂交瘤细胞膜Bursin受体的表达囊素能有效促杂交瘤细胞抗体的分泌,因而研究杂瘤细胞膜是否具有囊素受体的表达,对于全面阐清囊素促杂交瘤细胞抗体分泌的信号传导通路尤为重要。采用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪分析的方法,检测囊素与杂交瘤细胞膜相结合的情况以及二者的结合特性。实验结果证实,BS能特异结合在杂交瘤细胞膜上,与杂交瘤细胞的结合率不随有剂量效应关系且有饱和趋向性。加入FITC-BS在400ug/m、600ug/ml浓度时结合率达到最高。结合率分别为51.0%、50.6%。二者的结合率无显着差异（P<0.05）。而当加入人工合成的BS,在高于400ug/ml浓度时能明显抑制FITC-BS与杂交瘤细胞的结合,抑制率呈显着差异（P<0.05）。表明,BS与杂交瘤细胞的结合具有可逆性。因而,我们初步推测杂交瘤细胞膜上存在着特异的结合蛋白,该蛋白很可能是囊素的受体,参与了囊素促杂交瘤细胞抗体分泌过程。5囊素结合肽的筛选及活性鉴定以囊素分子作为靶标,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,经过4轮筛选,随机挑取20个克隆,ELISA法鉴定其亲和性,结果筛选得10个能与囊素较强结合的噬菌体克隆,竞争抑制试验证实其中2个克隆能竞争人工合成的多肽BS与囊素的结合。对阳性克隆进行测序并进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为ACTKHLCLLQPL; MSCNDTLCLLPN;其保守序列为LCLL。体外实验表明,2个人工合成的结合肽都能在一定程度上抑制囊素与杂交瘤细胞的特异性结合,这进一步证实杂交瘤细胞有囊素结合的受体,同时也提示,“LCLL”保守基序很可能是囊素细胞膜受体结合位点。6 B淋巴细胞中囊素结合蛋白的筛选B淋巴细胞是囊素相当重要的作用靶细胞,为研究囊素在B淋巴细胞中的作用机制及相互作用蛋白,利用噬菌体表面展示技术,以纯化的TRX-BS融合蛋白为靶蛋白,对鸡B细胞噬菌体T7 cDNA文库进行生物筛选,噬菌体经过3轮筛选后出现明显生物富集,随机挑选第三轮筛选的10个噬斑裂解液做PCR扩增,将其PCR产物序列测定后进行同源搜索,初步确定了2个与bursin结合的蛋白,为3-羟基异丁基-辅酶A水解酶（3-hydroxyisobutyryl-Coenzyme A hydrolase）和含EGF腓素样细胞外基质蛋白1（similar to EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1）。为进一步研究bursin勺生物学功能提供了新的思路。
刘光磊[10]（2008）在《奶牛乳中IgG变化规律及其转运影响因素研究》文中研究表明本研究以提高乳中IgG含量为主线,以乳中IgG生成和转运调控机理为研究目的,通过六个试验系统研究了影响IgG含量及转运的因素、转运受体基因多态性对IgG含量和转运的影响、免疫刺激后奶牛乳中IgG消长规律及转运变化、免疫刺激后基因表达变化等转运机理。试验一以单因素方差分析、多元相关分析、通径分析和典型相关分析研究了影响乳中IgG浓度及转运总量的影响因素。单因素方差分析和多元相关分析方法表明乳中IgG浓度与奶牛胎次（r = 0.378,P < 0.01）、泌乳天数（r = -0.145,P < 0.05）、乳糖（r = -0.223,P < 0.01）和体细胞分数SCS（r = 0.217,P < 0.01）相关显着;通径分析表明胎次对乳中IgG浓度的通径系数为Py1,x1 =0.31（P < 0.01）,为影响乳中IgG浓度的直接因素,而乳糖、产奶阶段和SCS的通径系数分别为Py1,x6 =-0.12、Py1, x2 =-0.11和Py1, x8=0.11,但均不显着（P > 0.05）表明这些因素为直接作用和间接作用综合作用的结果。典型相关分析结果表明,胎次、产奶阶段、乳成分等8项指标与免疫活性蛋白浓度之间存在4对典型变量,第一对和第二对典型变量分别包含了数据信息的67.3%和24.3%,具有统计意义。通径分析、典型分析可以刻画约IgG变异信息的30%、IgA 10%、IgM 20%、Lf 60%,说明本研究所涉及因素不能充分刻画乳中Ig浓度所有的变异,还有许多未知因素尚未涉及。本研究首次提出Lf指数（Lactoferrin Index）和IgG指数（Immunoglobulin G Index）,根据指数大小,可以预测乳中Lf和IgG浓度的高低。通过筛选,乳中Lf和IgG的含量分别提高了40.7%和19.5%,筛选效果显着。试验二进行了奶牛FcRn受体α链FCGRT基因和β链B2M基因SNP多态性与乳中IgG浓度及转运的相关研究,结果表明,FCGRT基因启动区存在4个SNP,分为6个单倍型,共有11种单倍型组合,但单倍型组合对牛奶IgG含量和牛奶IgG转运总量的效应均不显着（P>0.05）。在B2M基因外显子上存在3个SNP位点,分为4个单倍型,共有8种单倍型组合,单倍型组合对牛奶IgG含量和牛奶IgG转运总量的效应显着（P < 0.05）,对血清IgG含量和牛奶血液IgG浓度比值没有显着影响。单倍型组合H3H3奶牛个体为双碱基缺失纯合的奶牛个体,其奶牛个体有较低的乳IgG浓度和较高的血清IgG浓度（P < 0.05）,表明双碱基缺失纯合个体的乳腺转运IgG效率较低。通径分析表明添加B2M单倍型组合因素后,刻画IgG变异信息提高到40%.试验三以Lipase为抗原模型,成功的制备了免疫刺激复合物（ISCOM）疫苗,ISCOM微粒为典型的笼格状微粒,形态均一,大小平均为27.0nm,为二十面体结构。试验四在ISCOM疫苗制备的基础上,引进奶牛乳腺埋植技术和抗原缓释技术制备抗原缓释剂（ARD）,通过对奶牛乳腺埋植3种ARD,分别在埋植后0d、14d和28d刺激奶牛产生特异性抗体进入乳中。研究表明,乳腺埋植ARD对奶牛生产性能和乳成分没有影响,不会引发奶牛乳房炎;埋植后奶牛外周血液白细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数量增多,试验组T淋巴细胞SI指数在15d时显着增高（P<0.05）,表明ARD具有细胞免疫刺激作用,使奶牛的细胞免疫得到一定提高。奶牛血清中特异性抗体滴定效价均明显升高,ELISA滴定效价平均为2×106;埋植后9d便可检测到乳清中特异性抗体,其应答规律与3种ARD的释放一致。通过比较血清和乳清中特异性抗体含量变化,发现在血清效价相同的情况下,奶牛个体对IgG的转运存在差异;ARD埋植免疫后11d和20d抗体转运出现短暂性上升。试验五比较了初乳、常乳和免疫乳中特异性IgG效价,结果表明,ARD免疫后乳中ELISA效价平均为4.1×104,可以达到23d初乳的水平。试验六以泌乳小鼠为模型研究ISCOM免疫刺激后FCGRT和B2M基因mRNA表达情况,结果表明,小鼠乳腺B2M和FCGRT基因随着泌乳天数的上升而下降,B2M基因在0d表达最高,FCGRT基因在1d表达最高,此后维持在一个稳定水平;免疫荧光结果表明,0d的乳腺上皮细胞膜上的FcRn受体表达量要高于其它时间点。ISCOM的免疫刺激后,小鼠乳腺FCGRT和B2M基因mRNA表达上调,免疫后4d的FCGRT和B2M基因表达量要高于免疫后8d的表达量。
二、一个新的人乳源性生物活性肽cDNA克隆与测序分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一个新的人乳源性生物活性肽cDNA克隆与测序分析（论文提纲范文）
（1）两栖动物源抗氧化肽OS-LL11可以抵御UVB辐射造成的小鼠皮肤损伤（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 两栖动物源抗氧化肽结构和功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）大黄鱼piscidin 5 like的抗性特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 大黄鱼简介 |
| 1.1.1 大黄鱼生物学简介 |
| 1.1.2 大黄鱼的基因组学研究进展 |
| 1.2 鱼类抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)研究进展 |
| 1.2.1 鱼类AMPs |
| 1.2.2 鱼类piscidins |
| 1.3 刺激隐核虫 |
| 1.3.1 生物学特征 |
| 1.3.2 对宿主的危害 |
| 1.3.3 刺激隐核虫病的防治 |
| 1.3.4 刺激隐核虫病的研究进展 |
| 1.4 研究思路及目的意义 |
| 附:技术路线 |
| 第二章 刺激隐核虫免疫大黄鱼差异表达AMPs的挖掘及piscidin 5like基因序列、定位分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 肝脏比较转录组库组装分析 |
| 2.2.2 差异表达AMPs的挖掘 |
| 2.2.3 候选AMPs差异表达变化的验证 |
| 2.2.4 大黄鱼piscidin 5 like基因(Lc-P5L)序列分析 |
| 2.2.5 Lc-P5L的二级结构预测 |
| 2.2.6 Lc-P5L的三维结构预测 |
| 2.2.7 Lc-P5L mRNA的组织、细胞定位 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 转录组库免疫相关基因简要分析 |
| 2.3.2 候选AMPs分析 |
| 2.3.3 Lc-P5LmRNA的组织、细胞定位分析 |
| 第三章 大黄鱼piscidin 5 like的诱导表达、纯化及热稳定性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大黄鱼piscidin 5 like基因目的片段及pET-28a质粒的制备及酶切 |
| 3.2.2 重组表达系统的鉴定 |
| 3.2.3 大黄鱼piscidin 5 like重组蛋白(rLc-P5L)的诱导表达 |
| 3.2.4 rLc-P5L的可溶性分析 |
| 3.2.5 rLc-P5L的纯化与复性 |
| 3.2.6 rLc-P5L的冷冻干燥浓缩及浓度测定 |
| 3.2.7 rLc-P5L的western blot检测 |
| 3.2.8 rLc-P5L的质谱鉴定 |
| 3.2.9 rLc-P5L的热稳定性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 大黄鱼piscidin 5 like的抗菌活性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 rTRX-His-tag/rGFP-His-tag的表达纯化 |
| 4.2.2 rLc-P5L的MIC和MBC检测 |
| 4.2.3 rLc-P5L抗菌的浓度相关性检测分析 |
| 4.2.4 rLc-P5L的杀菌动力学曲线 |
| 4.2.5 rLc-P5L的抗菌SEM观察 |
| 4.2.6 rLc-P5L与细菌的直接结合活性 |
| 4.2.7 rLc-P5L与LPS、LTA的竞争性结合 |
| 4.2.8 rLc-P5L与细菌基因组DNA的结合活性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 大黄鱼piscidin 5 like的抗刺激隐核虫活性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 刺激隐核虫感染对Lc-P5L mRNA的诱导表达变化 |
| 5.2.2 刺激隐核虫感染对Lc-P5L mRNA的诱导定位变化 |
| 5.2.3 rLc-P5L对刺激隐核虫幼虫形态破坏的观察 |
| 5.2.4 rLc-P5L对刺激隐核虫滋养体形态破坏的观察 |
| 5.2.5 rLc-P5L对刺激隐核虫细胞核作用的观察 |
| 5.2.6 rLc-P5L的溶血活性检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 刺激隐核虫感染对Lc-P5L mRNA的时空诱导变化分析 |
| 5.3.2 刺激隐核虫感染诱导的Lc-P5L mRNA定位变化分析 |
| 5.3.3 rLc-P5L对刺激隐核虫的杀灭活性 |
| 5.3.4 宿主与刺激隐核虫的互作 |
| 结语 |
| 主要结果 |
| 主要创新点 |
| 研究展望 |
| 缩略语中英文对照表 |
| 参考文献 |
| 在学期间参加的科研项目及发表的论文 |
| 致谢 |
（3）海洋鱼类暴露17α-炔雌醇的毒性效应及其免疫毒性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 EDCs概述 |
| 1.2 17α-炔雌醇(EE2)及其毒性效应研究进展 |
| 1.2.1 EE2的污染现状 |
| 1.2.2 EE2的环境归宿 |
| 1.2.3 EE2对鱼类的影响 |
| 1.3 雌激素受体研究进展 |
| 1.3.1 雌激素受体的分子结构 |
| 1.3.2 雌激素受体的作用机制 |
| 1.3.3 雌激素受体在鱼类中的研究现状 |
| 1.4 抗菌肽的转录调控研究进展 |
| 1.4.1 抗菌肽的研究背景 |
| 1.4.2 抗菌肽的生物学功能 |
| 1.4.3 抗菌肽hepcidin的表达调控机制 |
| 1.5 海水青鳉作为模式生物的研究进展 |
| 1.6 本研究的技术路线、目的和意义 |
| 1.6.1 研究的目的和意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 海水青鳉雌激素受体基因的克隆与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 海水青鳉雌激素受体(OM-ERs)cDNA序列扩增 |
| 2.2.3 海水青鳉雌激素受体(OM-ERs)氨基酸序列分析与比对 |
| 2.2.4 海水青鳉雌激素受体(OM-ERs)系统进化树分析 |
| 2.2.5 OM-ERα单体DBD和LBD结合域的3D模型建立 |
| 2.2.6 Western-blot检测OM-ERα多克隆抗体的特异性 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 海水青鳉胚胎、仔鱼和成鱼OM-ERs在EE2暴露下的应答模式 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 海水青鳉vtg1基因和管家基因RPL7部分cDNA序列扩增 |
| 3.2.2 Dot-blot检测OM-ERα、OM-ERβ1和OM-ERβ2扩增片段特异性 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.2.4 OM-ERs基因在不同发育时期和不同组织中的表达特性 |
| 3.2.5 EE2急性暴露海水青鳉胚胎OM-ERs基因表达特性 |
| 3.2.6 EE2急性暴露海水青鳉仔鱼OM-ERs基因表达特性 |
| 3.2.7 EE2急性暴露雄性海水青鳉成鱼OM-ERs基因表达特性 |
| 3.2.8 EE2慢性暴露雄性海水青鳉成鱼OM-ERs基因表达模式 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 海水青鳉和黑鲷暴露EE2后的免疫应答变化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 海水青鳉免疫相关基因部分cDNA序列扩增 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.2.3 EE2暴露对海水青鳉免疫相关基因的影响 |
| 4.2.4 EE2暴露对海水青鳉NF-κB及JAK/STAT信号通路的影响 |
| 4.2.5 EE2急性暴露对养殖黑鲷生理生化指标的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 EE2暴露下海水青鳉抗菌肽基因OM-hep1转录调控机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 EE2抑制海水青鳉肝脏OM-hep1基因mRNA的表达 |
| 5.2.2 OM-hep1和OM-hep2基因上游调控序列的扩增与分析 |
| 5.2.3 OM-hep1和OM-hep2启动子功能检测 |
| 5.2.4 OM-hep1启动子关键转录调控区研究 |
| 5.2.5 OM-hep1关键转录调控区的界定与活性分析 |
| 5.2.6 OM-hep1启动子关键转录调控区上游序列功能分析 |
| 5.2.7 EE2刺激抑制OM-hep1启动子转录活性 |
| 5.2.8 过表达OM-ERα抑制OM-hep1启动子转录活性 |
| 5.2.9 EMSA验证OM-ERα与HepERE结合 |
| 5.2.10 DNA探针HepERE-biotin与ERα蛋白亲和力动力学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 在学期间参加的科研项目及成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（5）Ec-cLYZ基因和hLTF基因重组腺病毒的构建及其抑菌效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 鱼类溶菌酶概述 |
| 1.1 鱼类非特异性免疫 |
| 1.2 溶菌酶的理化性质 |
| 1.3 鱼类溶菌酶的研究进展 |
| 1.4 溶菌酶的作用 |
| 1.5 石斑鱼c型溶菌酶概述 |
| 1.6 c型溶菌酶的应用 |
| 2 人乳铁蛋白概述 |
| 2.1 人乳铁蛋白的结构 |
| 2.2 乳铁蛋白的生物学功能 |
| 2.3 人乳铁蛋白的应用和研究进展 |
| 3 腺病毒载体概述 |
| 3.1 腺病毒载体简介 |
| 3.2 重组腺病毒的构建 |
| 4 课题研究内容和意义 |
| 4.1 课题背景 |
| 4.2 课题研究内容 |
| 4.3 研究意义 |
| 第二章 Ec-cLYZ基因和hLTF基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 cLYZ基因和hLTF基因的RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 pMD-cLYZ和 pMD-hLTF双酶切鉴定结果 |
| 2.3 pMD-hLTF和 pMD-cLYZ测序结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 Ec-cLYZ基因和hLTF基因重组腺病毒质粒的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF和 pDC315-cLYZ-hLTF的菌液PCR结果 |
| 2.2 pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF和 pDC315-cLYZ-hLTF的双酶切结果 |
| 3 小结 |
| 第四章 重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒质粒转染HEK293 细胞结果 |
| 2.2 重组腺病毒感染HEK293 细胞后RT-PCR的检测结果 |
| 2.3 Western blotting检测cLYZ蛋白的表达 |
| 2.4 重组腺病毒的滴度测定结果 |
| 3 小结 |
| 第五章 重组腺病毒表达蛋白的抑菌效果评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白标准曲线的建立及浓度测定 |
| 2.2 试验菌株对目的蛋白的敏感度检测 |
| 2.3 目的蛋白的最低抑菌浓度的测定 |
| 2.4 MIC目的蛋白和常用抗生素的抑菌试验比较 |
| 3 小结 |
| 第六章 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）大熊猫不同泌乳期乳汁microRNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大熊猫 |
| 1.1 大熊猫简介 |
| 1.2 大熊猫的种群现况 |
| 1.3 大熊猫的社会价值 |
| 1.4 大熊猫研究及保护现况 |
| 2 乳汁 |
| 2.1 母乳的生物学作用 |
| 2.2 母乳的分类 |
| 2.3 母乳生成的机制 |
| 2.4 大熊猫母乳的研究现状 |
| 3 microRNA研究进展 |
| 3.1 microRNA简介 |
| 3.2 microRNA的生物合成机制 |
| 3.3 microRNA的作用机制 |
| 3.4 microRNA的研究方法 |
| 3.5 动植物miRNA的区别 |
| 4 实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 4.1 技术原理 |
| 4.2 方法分类 |
| 4.3 miRNA荧光定量PCR |
| 5 乳汁中的microRNA研究 |
| 第二章 本研究选题背景与目的 |
| 1 选题背景 |
| 2 主要研究内容 |
| 3 研究的目的 |
| 第三章 材料与方法 |
| 1 实验动物和乳汁收集 |
| 1.1 实验用大熊猫选择 |
| 1.2 大熊猫乳汁的收集 |
| 2 试验时间与地点 |
| 3 主要仪器和试剂 |
| 3.1 主要仪器 |
| 3.2 主要试剂 |
| 4 乳汁中高质量RNA的制备 |
| 4.1 RNA的提取操作 |
| 4.2 RNA量检测 |
| 5 小RNA测序文库构建及测序 |
| 6 测序数据的生物信息学分析 |
| 6.1 测序数据过滤 |
| 6.2 文库测序数据的标准化(归一) |
| 7 荧光定量验证 |
| 7.1 高通量测序数据的可靠性验证 |
| 7.2 乳汁中植物源性miRNA的验证 |
| 7.3 乳汁中miRNA稳定性验证 |
| 8 表达模式(STEM)分析 |
| 9 靶基因功能和通路富集分析 |
| 9.1 靶基因功能富集分析 |
| 9.2 靶基因通路(Pathway)富集分析 |
| 10 参考数据库与分析软件 |
| 第四章 结果与分析 |
| 1 总RNA质检以及small RNA测序文库构建质检结果 |
| 1.1 总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶检测结果 |
| 1.2 总RNA浓度检测结果 |
| 1.3 总RNA毛细管电泳检测结果 |
| 2 测序数据概述以及特征 |
| 2.1 测序数据过滤 |
| 2.2 小RNA序列的长度分布 |
| 2.3 首次鉴定的miRNA统计 |
| 2.4 鉴定所得miRNA的保守性分析 |
| 2.5 大熊猫乳汁中miRNA表达量特征 |
| 2.6 不同泌乳期miRNAome表达模式特征 |
| 2.7 乳汁中外源性miRNA的发现 |
| 3 大熊猫乳汁中高度表达的microRNA |
| 4 miRNA的表达模式分析 |
| 5 大熊猫不同泌乳阶段特异性表达的miRNA |
| 6 高通量测序数据的验证 |
| 7 乳汁中植物源性miRNA验证 |
| 7.1 植物源miRNA的耐高碘酸钠氧化验证 |
| 7.2 乳汁中植物源性miRNA的验证 |
| 7.3 乳汁中植物源性miRNA的浓度检测 |
| 8 乳汁中miRNA稳定性分析 |
| 第五章 讨论 |
| 1 miRNA分析方法的选择 |
| 1.1 高通量测序技术具有独特的优势 |
| 1.2 生物学重复合并建库在经费有限的情况仍有科研价值 |
| 2 乳汁中高表达的miRNAs促进乳汁分泌和婴儿的早期发育 |
| 3 阶段特异性表达的miRNA展现出功能适应性 |
| 4 大熊猫乳汁中真实地存在植物源性的miRNA |
| 4.1 存在的真实性 |
| 4.2 植物源性miRNA的浓度 |
| 5 乳汁中miRNA具有很好的稳定性 |
| 6 乳汁中miRNA的筛选及其功能验证 |
| 7 食物来源miRNA介导的跨物种研究 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 博士在读期间发表论文及科研成果 |
（7）猪生长激素模拟肽的筛选与活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪生长激素概述 |
| 1.1 猪生长激素的结构 |
| 1.2 猪生长激素的分泌器官及其生理作用 |
| 1.3 猪生长激素的作用机制 |
| 1.4 猪生长激素的安全性与应用局限 |
| 1.5 猪生长激素可替代物的研究进展 |
| 2 噬菌体展示技术 |
| 2.1 噬菌体展示技术的基本原理 |
| 2.2 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 3 生物活性肽的研究进展 |
| 3.1 生物活性肽的分类 |
| 3.2 生物活性肽的生理功能 |
| 3.3 生物活性肽在动物生产中的应用 |
| 第二章 采用噬菌体展示技术进行猪生长激素模拟肽的淘选和鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种来源 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要化学试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪生长激素单克隆抗体杂交瘤细胞株的复苏及亚克隆试验 |
| 2.2 猪生长激素单克隆抗体腹水的制备与纯化 |
| 2.3 利用噬菌体展示技术进行猪生长激素模拟肽的淘选试验 |
| 2.4 阳性噬菌体的扩增试验 |
| 2.5 噬菌体测序模板的快速纯化 |
| 2.6 阳性噬菌体与靶分子的特异性结合试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪生长激素单克隆抗体杂交瘤细胞株的复苏及亚克隆试验结果 |
| 3.2 单克隆抗体腹水及培养上清效价的测定 |
| 3.3 阳性噬菌体筛选结果 |
| 3.4 阳性噬菌体氨基酸序列比对分析 |
| 3.5 阳性噬菌体与抗体靶分子的特异性结合分析 |
| 3.6 猪生长激素模拟肽核心序列的确定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 猪生长激素模拟肽与肝细胞模型上猪生长激素受体特异性结合的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 猪生长激素模拟肽及猪的来源 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要化学试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪肝细胞体外培养试验模型的建立 |
| 2.2 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的荧光分子标记试验 |
| 2.3 猪生长激素模拟肽与肝细胞结合动力学试验 |
| 2.4 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的共定位试验 |
| 2.5 猪生长激素与猪生长激素模拟肽竞争性结合猪生长激素受体试验 |
| 2.6 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的封闭受体试验 |
| 2.7 猪生长激素和猪生长激素模拟肽与猪生长激素受体的饱和性结合试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪肝细胞体外培养试验模型的建立 |
| 3.2 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的荧光分子标记试验结果 |
| 3.3 猪生长激素模拟肽与肝细胞结合动力学及共定位试验结果 |
| 3.4 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的竞争性结合受体试验结果 |
| 3.5 猪生长激素与猪生长激素模拟肽的封闭受体试验结果 |
| 3.6 猪生长激素与猪生长激素模拟肽在细胞模型上饱和试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 猪生长激素模拟肽启动信号转导及机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪生长激素模拟肽激活细胞信号转导蛋白AK |
| 2.2 猪生长激素模拟肽启动JAK-STAT细胞信号转导通路 |
| 2.3 猪生长激素模拟肽刺激肝细胞分泌IGF-Ⅰ的测定试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪生长激素模拟肽激活细胞信号转导蛋白JAK结果 |
| 3.2 猪生长激素模拟肽启动JAK-STAT细胞信号转导通路研究结果 |
| 3.3 猪生长激素模拟肽刺激肝细胞分泌IGF-Ⅰ的测定试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 猪生长激素负反馈调节的生物信息学分析与预测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪生长抑素受体蛋白及模板蛋白的搜索 |
| 2.2 猪生长抑素受体的同源模建 |
| 2.3 猪生长抑素受体的结合位点分析 |
| 2.4 配体与猪生长抑素受体的对接与预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪生长抑素受体同源蛋白的序列水平评估结果 |
| 3.2 抑制剂与生长抑素的对接研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 结论与建议 |
| 1 结论 |
| 1.1 采用噬菌体展示技术进行猪生长激素模拟肽的淘选和鉴定 |
| 1.2 猪生长激素模拟肽的体外活性研究 |
| 1.3 猪生长激素模拟肽激活受体的机制研究 |
| 1.4 猪生长激素负调节机制的初步研究 |
| 2 创新点 |
| 3 存在的不足与建议 |
| 参考文献 |
| 缩略语中英文对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）中国林蛙皮肤活性多肽基因表达的多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 两栖类动物皮肤活性多肽研究概况 |
| 1.1.1 两栖类动物皮肤抗菌肽（antibacterial peptides） |
| 1.1.2 缓激肽及其相关肽（bradykinin and bradykinin-related peptides） |
| 1.1.3 两栖类促胰岛素释放肽（amphibian insulintropic peptides） |
| 1.1.4 两栖类动物抗氧化多肽（antioxidative peptides） |
| 1.2 关于生物信息学综述 |
| 1.2.1 生物信息学介绍 |
| 1.2.2 抗菌肽数据库的介绍 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cDNA 克隆与分子多样性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料和试剂 |
| 2.1.2 总RNA 的提取 |
| 2.1.3 中国林蛙抗菌肽的cDNA 的克隆 |
| 2.1.4 cDNA 的测序及分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Total RNA 的提取 |
| 2.2.2 中国林蛙皮肤抗菌肽cDNA 的克隆结果 |
| 2.2.3 中国林蛙皮肤生物活性肽cDNA 序列克隆 |
| 2.3 讨论 |
| 3 中国林蛙皮肤活性多肽的生物信息学分析 |
| 3.1 中国林蛙活性多肽一级结构预测结果与分析 |
| 3.2 中国林蛙活性多肽二级结构预测结果 |
| 3.3 中国林蛙抗菌肽两亲性预测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（9）囊素样肽在哺乳动物中免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 英文缩写及名称 第一篇 文献综述 |
| 第一章 法氏囊活性小肽囊素研究进展 |
| 1 囊素的发现 |
| 2 囊素的组织学分布 |
| 3 囊素三肽的生物学活性 |
| 3.1 免疫增强作用 |
| 3.2 细胞凋亡中的作用 |
| 3.3 其它生物学活性 |
| 4 囊素的作用机理 |
| 5 囊素应用前景 |
| 第二章 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1 噬菌体展示系统种类 |
| 1.1 噬菌体随机肽库技术 |
| 1.2 λ噬菌体cDNA文库技术 |
| 1.3 T4噬菌体展示系统 |
| 1.4 T7噬菌体cDNA文库技术 |
| 2 噬菌体展示文库的筛选技术 |
| 3 噬菌体展示文库的应用 |
| 3.1 筛选抗原模拟表位 |
| 3.2 药物靶点的筛选 |
| 3.3 细胞信号传导 |
| 4 噬菌体展示文库的展望 第二篇 研究内容 |
| 第三章 囊素样肽基因的设计及在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 三种BS样肽基因的亚克隆 |
| 2.2 重组蛋白的表达及Western-blot分析 |
| 2.3 重组蛋白的可溶性分析及纯化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 囊素样肽对乙脑亚单位疫苗的免疫效果影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT分析 |
| 2.2 JEV病毒抗体和抗体亚型检测 |
| 2.3 脾T细胞亚群分析 |
| 2.4 血清中IL-4和IFN-γ的测定 |
| 2.5 JEV中和抗体的产生 |
| 3 讨论 |
| 第五章 囊素样肽有效提高禽流感H9N2灭活病毒疫苗对小鼠的免疫保护 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HI抗体动态变化分析 |
| 2.2 HA抗体和抗体亚型检测 |
| 2.3 脾T细胞亚群、NK细胞变化分析 |
| 2.4 血清中细胞因子变化分析 |
| 2.5 特异性CTL对靶细胞的杀伤活性 |
| 2.6 免疫保护力分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 小鼠杂交瘤细胞膜Bursin受体的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 显微镜观察 |
| 2.2 杂交瘤细胞膜受体结合实验 |
| 2.3 杂交瘤细胞膜受体结合竞争抑制实验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 囊素结合肽的筛选与活性鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 噬菌体的富集效应 |
| 2.2 噬菌体克隆与BS结合特异性测定 |
| 2.3 验证噬菌体克隆特异性的竞争ELISA实验 |
| 2.4 阳性噬菌体DNA序列分析 |
| 2.5 结合肽P3、P5抑制囊素与杂交瘤细胞的特异性结合 |
| 3 讨论 |
| 第八章 T7 cDNA噬菌体文库筛选Bursin结合蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体文库质量的鉴定 |
| 2.2 特异性富集 |
| 3 讨论 参考文献 全文总结 致谢 攻读博士期间发表论文 附录 |
（10）奶牛乳中IgG变化规律及其转运影响因素研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛奶免疫活性蛋白功能及提高技术研究进展 |
| 2.2 免疫乳生产最新研究进展 |
| 2.3 奶牛乳腺Ig合成与分泌机理 |
| 2.4 免疫球蛋白转运受体研究进展 |
| 3 研究内容和技术路线 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 中国荷斯坦奶牛泌乳期乳中免疫活性蛋白含量影响因素 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验奶牛的选择及样品的采集 |
| 2.2 乳成分及体细胞数的测定 |
| 2.3 夹心ELISA测定Ig和Lf的含量 |
| 2.4 IgG/Lf高合成能力奶牛筛选软件开发及奶牛筛选试验 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单因素方差分析：乳中IgG含量的影响因素 |
| 3.2 多元相关分析及通径分析：影响乳中IgG含量的直接因素和间接因素 |
| 3.3 典型相关分析 |
| 3.4 IgG/Lf高合成能力奶牛筛选试验效果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 影响乳中IgG浓度的因素 |
| 4.2 影响乳中Lf浓度的因素 |
| 4.3 乳中Ig和Lf浓度与DHI数据之间的典型相关分析及其应用 |
| 4.4 本研究所涉及的因素未能足够刻画乳中Ig的变异信息 |
| 5 本章结论 |
| 第三章 中国荷斯坦奶牛FcRn受体α链FCGRT基因和β链82M基因SNP多态性与乳中IgG含量及转运的相关性研究 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验奶牛的选择及样品的采集 |
| 2.2 夹心ELISA测定血液及乳中IgG含量 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 PCR扩增、产物测序及SNP位点的确定 |
| 2.5 FCGRT基因利用SNP Stream进行基因分型 |
| 2.6 82M基因利用直接测序法进行基因分型 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DNA提取效果及PCR扩增结果 |
| 3.2 PCR产物测序分析发现SNP位点 |
| 3.3 FCGRT基因多态性分析及其与乳中IgG含量及转运的相关 |
| 3.4 B2M基因多态性分析及其与乳中IgG含量及转运的相关 |
| 4 讨论 |
| 5 本章结论 |
| 第四章 免疫刺激复合物（ISCOM）疫苗制作及对小鼠免疫功能的影响 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 抗原模型 |
| 2.2 ISCOM疫苗制作 |
| 2.3 ISCOM疫苗免疫效果 |
| 2.4 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ISCOM疫苗电镜观察结果 |
| 3.2 ISCOM疫苗体内毒性试验及安全剂量 |
| 3.3 ISCOM疫苗对小鼠血清特异性抗体效价的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ISCOM微粒的制备 |
| 4.2 Quil A是ISCOM疫苗安全性的限制因素 |
| 4.3 ISCOM对小鼠体液免疫的影响 |
| 5 本章结论 |
| 第五章 奶牛埋植抗原缓释剂（ARD）后乳中IgG含量及转运变化 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 第一期试验 |
| 2.2 第二期试验 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 第一期试验 |
| 3.2 第二期试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ARD埋植是一种新型的免疫乳生产方法 |
| 4.2 ARD生产免疫乳与其他方法的比较 |
| 4.3 抗体的乳腺转运在奶牛个体间存在较大差异 |
| 4.4 ARD埋植免疫后抗体转运出现短暂性上调 |
| 5 本章结论 |
| 第六章 初乳、常乳和免疫乳中的IgG含量的变化规律及比较 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 免疫后乳样品的采集 |
| 2.2 初乳和常乳样品采集 |
| 2.3 乳清和血清特异性抗体滴度的测定 |
| 2.4 乳清和血清中总IgG含量的测定 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳及相对定量分析 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 初乳中特异性IgG的变化规律及与免疫乳的比较 |
| 3.2 初乳、常乳中总Ig含量的变化规律及与免疫乳的比较 |
| 3.3 SDS-PAGE电泳及其相对定量分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 初乳中免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较 |
| 4.2 SDS-PAGE电泳及乳清中主要蛋白的相对定量分析 |
| 5 本章结论 |
| 第七章 小鼠ISCOM免疫刺激对乳腺IgG转运及FcRn受体表达的影响 |
| 1 研究内容与技术路线 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 ISCOM疫苗制作 |
| 2.2 泌乳小鼠的准备、免疫及样品采集 |
| 2.3 小鼠免疫细胞、细胞因子及IgG的测定 |
| 2.4 Real Time-PCR测定小鼠乳腺FcRn基因mRNA表达 |
| 2.5 免疫荧光测定乳腺FcRn在细胞膜的表达 |
| 2.6 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ISCOM免疫对小鼠细胞免疫功能的影响 |
| 3.2 ISCOM免疫对小鼠体液免疫功能的影响 |
| 3.3 ISCOM免疫对小鼠乳腺FCGRT和82M基因mRNA表达量的影响 |
| 3.4 ISCOM免疫对小鼠乳腺FcRn受体在细胞膜上表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ISCOM疫苗对小鼠体液及细胞免疫的影响 |
| 4.2 ISCOM疫苗对小鼠IgG转运的影响 |
| 4.3 ISCOM疫苗对受体表达的影响 |
| 5 本章结论 |
| 第八章 总体结论 |
| 1 论文总体结论 |
| 2 本研究创新点 |
| 3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 ELISA测定乳中总Ig含量和特异性抗体效价 |
| 附录二 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所《IgG/Lf高合成能力奶牛筛选系统V1.0》程序设计和解决方案 |
| 附录三 12 重SNPstream基因分型系统操作方法 |
| 附录四 本研究登录Genebank的SNP序列 |
| 附录五 SDS-PAGE电泳及Quantity One定量分析 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、一个新的人乳源性生物活性肽cDNA克隆与测序分析（论文参考文献）
- [1]两栖动物源抗氧化肽OS-LL11可以抵御UVB辐射造成的小鼠皮肤损伤[D]. 谢纯. 昆明医科大学, 2021
- [2]大黄鱼piscidin 5 like的抗性特性研究[D]. 郑利兵. 厦门大学, 2019(08)
- [3]海洋鱼类暴露17α-炔雌醇的毒性效应及其免疫毒性机制研究[D]. 张民. 厦门大学, 2018(12)
- [4]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [5]Ec-cLYZ基因和hLTF基因重组腺病毒的构建及其抑菌效果评价[D]. 弓建芳. 天津农学院, 2016(07)
- [6]大熊猫不同泌乳期乳汁microRNA表达谱研究[D]. 王承东. 四川农业大学, 2015(12)
- [7]猪生长激素模拟肽的筛选与活性鉴定[D]. 兰楠海. 吉林农业大学, 2012(05)
- [8]中国林蛙皮肤活性多肽基因表达的多样性研究[D]. 白冰. 辽宁师范大学, 2011(04)
- [9]囊素样肽在哺乳动物中免疫调节机制研究[D]. 王臣. 南京农业大学, 2008(06)
- [10]奶牛乳中IgG变化规律及其转运影响因素研究[D]. 刘光磊. 中国农业科学院, 2008(10)