一、硫酸乙酰肝素协同细胞因子对脐血造血细胞体外扩增及细胞免疫表型的影响（论文文献综述）
曹韪凡[1]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中提出近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
杨小萍[2]（2020）在《人骨骼肌源性血管外膜细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外支持作用的研究》文中研究表明目的从人骨骼肌组织中分离培养血管外膜细胞（pericytes/perivascular cells,PCs）并进行生物学特性鉴定,探究其对人脐带血（Umbilical cord blood,UCB）CD34+细胞的体外支持效力。方法1.利用多参数流式细胞术（multiparameter fluorescence-activated cell sorting,MP-FACS）从人骨骼肌中分选表型为CD146+CD56-CD34-CD144-CD45-的人骨骼肌血管外膜细胞（human skeletal muscle-derived pericytes/perivascular cells,hMD-PCs）,并对其进行生物学鉴定;2.采用密度梯度离心法分离获取人UCB单个核细胞（Mononuclear cells,MNCs）,利用免疫磁珠法分选UCB CD34+细胞;3.建立以CD146+hMD-PCs为滋养层的UCB CD34+细胞体外培养体系,同时设置以人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）为滋养层的阳性对照培养体系及无滋养层的UCB CD34+细胞单独培养体系为空白对照,分别于共培养1W、2W、4W对各培养体系的细胞数量、集落形成能力、免疫表型及培养上清液造血因子表达水平进行检测及统计分析。结果1.通过MP-FACS分选出CD146+hMD-PCs,回测纯度为（91.5±1.85）%（n=5）;其表达MSCs表面标志物CD105、CD90、CD73、CD44,不表达内皮细胞及造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45;经诱导分化培养可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞分化,并保留其成肌性;2.经免疫磁珠分选获取的脐血CD34+细胞阳性率为（85.35±3.25）%;3.UCB CD34+细胞按5×104/孔的密度分别与CD146+hMD-PCs、BM-MSCs共培养:（1）共培养1W后,CD146+hMD-PCs组、BM-MSCs组的细胞数分别为（5.36±2.63）×104、（4.08±1.88）×104,两组细胞数无显着增加,空白对照组的细胞数为（0.78±0.47）×104,细胞数明显下降;共培养2W后,CD146+hMD-PCs组、BM-MSCs组的细胞数分别为（5.78±1.41）×104、（5.2±1.59）×104,细胞数有所增长,而空白对照组几乎无细胞存活;共培养4W后,CD146+hMD-PCs组、BM-MSCs组细胞数呈下降趋势,分别为（3.55±2.65）×104、（2.86±1.27）×104;共培养至5W时几乎无细胞存活。经统计分析,实验组与阳性对照组1W,2W,4W的细胞数差异均无统计学意义（P>0.05,n=6）。空白对照组1W、2W的细胞数分别与实验组、阳性对照组相比,差异均有显着统计学意义（1W P<0.01,2W P<0.001,n=6）。（2）集落培养显示,CD146+hMD-PCs组、BM-MSCs组造血干祖细胞在共培养1W、2W、4W后的集落形成能力无显着统计学差异（P>0.05,n=5）,无滋养层培养体系因细胞数明显减少未能行集落培养。（3）经流式细胞术检测,CD146+hMD-PCs组共培养1W、2W、4W有核细胞中CD45+细胞、CD34+CD33-细胞、CD14+细胞、CD10+/CD19+细胞的比例与BM-MSCs组比较,无统计学差异（P>0.05,n=6）。（4）ELISA检测培养上清液细胞因子表达水平,CD146+hMD-PCs组与BM-MSCs组IL-3、IL-6、VEGF表达水平无统计学差异,CD146+hMD-PCs组HGF、MCSF、TNF-α及IFN-γ水平较BM-MSCs组高（P<0.05）,BM-MSCs组上清液中SCF及TPO较CD146+hMD-PCs组高（P<0.05）。结论CD146+hMD-PCs具有与BM-MSCs相似的生物学特性,且CD146+hMD-PCs做为滋养层细胞像BM-MSCs一样具有体外造血支持作用。
冯悦[3]（2019）在《UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究》文中指出目的:造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）是有自我更新潜力,并能够在人的一生中持续多向分化以形成多谱系血液细胞的一种成体干细胞。临床上主要是用造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）治疗多种血液系统疾病如造血系统恶性肿瘤,遗传缺陷和自身免疫性疾病和某些实体瘤。然而,人白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）配型困难是限制骨髓或动员外周血HSCT临床应用的最大障碍。脐血来源的HSCs免疫原性低,可降低移植物抗宿主病（Graft versus host disease,GVHD）的发生率,且细胞增殖潜力强,收集方便,具有更广阔的临床应用前景。但是,由于单份脐血细胞量过少,限制了其临床应用,因此可体外扩增脐血HSCs的药物成为研究热点。造血干细胞激动剂UM171是现阶段扩增脐血HSCs最优的小分子化合物。方法:首先,我们使用免疫磁珠法富集脐血中的CD34+细胞,构建含细胞因子组合的体外培养体系,以及以流式细胞术为主要检测手段的药物筛选体系。在此基础上,对合成的37种UM171小分子化合物进行了初筛、复筛,根据它们对脐血CD34+CD38-细胞的扩增效果和生物活性（EC50值）,挑选出最优化合物,并确定佳扩增浓度。之后,使用流式细胞术对扩增效果进行了验证,使用Metho Cult?H4434半固体培养基对培养后的细胞造血功能进行评价。接着,为探索化合物11扩增效果的机制,我们检测了培养后各亚型细胞的凋亡（Annexin-V凋亡检测）,周期（Ki67/7-AAD胞内染色周期检测）和细胞增殖分裂（CFSE）情况,并使用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RTq PCR）检测了HSCs自我更新相关基因的表达情况。结论:根据初筛结果,我们选出了6个潜力化合物,择其二进行了复筛,根据它们对脐血CD34+CD38-细胞的扩增效果和生物活性（EC50值）,得到化合物11为最优化合物,并确定了其佳扩增浓度为165n M,最佳浓度时的扩增效果显着优于多种HSCs扩增药物（遗憾的是,化合物11的效果未能企及UM171）,扩增后的细胞保持完整的造血集落形成能力。机制研究发现,化合物11对细胞凋亡无显着影响,对长期HSCs（Long termHematopoietic stem cells,LT-HSCs）和造血干祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cell,HSPCs）细胞周期进程也无显着改变。细胞分裂实验发现化合物11会减缓HSPCs的分裂,且化合物11可以保持更高的BMI1基因表达,这对HSCs的自我更新式分裂具有重要意义。总的来说,化合物11生物活性高,扩增效果佳,培养后的细胞保持着完整的多谱系分化潜力。机制研究发现,化合物11可能是通过减缓HSPCs分裂速度,避免耗竭,并促进干细胞自我更新式分裂,从而实现扩增效果。意义:本研究合成了37种新小分子化合物,并对其扩增脐血HSCs的效果进行了检验、筛选,发现了一种具有很好扩增效果的新型小分子化合物11。有望从这一新小分子化合物结构中探寻UM171结构活性关系,为寻找更高效的HSCs扩增剂奠定基础。
孟宪会[4]（2018）在《基于miRNA的间充质干细胞干性维持机制及应用研究》文中研究指明间充质干细胞（MSCs）是细胞治疗重要的种子细胞,在心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等衰老相关疾病的治疗中间充质干细胞表现出引入注目的潜能。间充质干细胞治疗的首要条件是在质量和数量上满足临床要求。一方面,体外扩增过程引起的细胞衰老和功能衰退是间充质干细胞培养的主要障碍,研究mi RNA对间充质干细胞干性维持和衰老的作用为解决间充质干细胞的规模化扩增问题提供了新的思路。另一方面,间充质干细胞组分在抗衰老应用中的有效性也需要进一步研究。本论文就这些问题展开研究,取得了以下成果:1.基于mi RNA表达谱探讨了mi RNA对间充质干细胞衰老的作用机制。我们利用高通量测序技术比较了脐带间充质干细胞培养早期和培养晚期两个阶段的mi RNA表达谱特征。通过建立mi RNA与靶基因的作用模型,我们分析了mi RNA表达谱对靶基因表达的影响。对衰老前后差异表达的靶基因进行功能聚类分析后我们揭示了mi RNA在间充质干细胞衰老过程中重要的调节作用。2.深入研究了mi R-18a在间充质干细胞衰老中的作用机制,提出了一种通过mi R-18a的持续表达减缓衰老、维持间充质干细胞自我更新和生物学功能的方法。我们发现内源性的mi R-18a在间充质干细胞的高表达是细胞抵御衰老的关键因素。通过荧光素酶报告基因实验和免疫印迹实验我们首次证明mi R-18a通过直接靶向CTDSPL的3’非编码区抑制了CTDSPL的表达,从而抑制了CTDSPL诱导的细胞衰老。最后我们通过慢病毒感染使mi R-18a在间充质干细胞中稳定表达,证明了mi R-18a的持续表达降低了细胞中活性氧的水平,减缓了间充质干细胞的衰老过程,同时促进了干细胞基因的上调,增强了细胞的生长活性和多向分化能力。3.比较了脐血与脐带间充质干细胞的基因表达特征和应用潜能。我们建立了人脐血间充质干细胞（CBMSCs）的分离培养体系,通过与脐带间充质干细胞的深入比较我们发现,mi RNA的调控特征显示脐带间充质干细胞的衰老主要受分化基因失调的影响,而泛素化依赖的蛋白降解过程对脐血间充质干细胞的衰老起了关键作用。对mi RNA表达谱和转录组的比较分析我们发现脐带和脐血间充质干细胞在代谢、黏附、增殖和免疫调节等方面显着的功能差异。最后我们还利用细胞因子抗体芯片对两种细胞的条件培养液中55种细胞因子的含量进行了检测。通过这些分析我们发现与脐带来源相比,脐血来源的间充质干细胞在神经、血管和胰岛等组织修复、造血干细胞支持以及免疫调节等方面表现出更突出的应用潜能。4.研究了脐血间充质干细胞分泌组分的抗衰老作用。我们首先证明了脐血间充质干细胞分泌组分能够显着降低由过氧化氢诱导的活性氧水平上升,减缓了细胞的衰老。然后以12个月自然衰老的小鼠为模型,我们分析了脐血间充质干细胞分泌组分对小鼠的影响。通过对小鼠外周血淋巴细胞中T、B、髓细胞亚群、NK细胞亚群、调节性T细胞、原始和记忆T细胞亚群的表征分析我们发现与对照组相比间充质干细胞的分泌组分能够显着改善衰老小鼠的免疫调节功能。进一步的组织切片分析显示间充质干细胞的分泌组分也显着改善了小鼠皮肤和肾脏组织的衰老情况。这些结果显示脐血间充质干细胞分泌组分能够抑制活性氧引起的细胞衰老、调节机体免疫功能,改善机体组织的衰老情况,减缓衰老。
龚子祯[5]（2018）在《多糖对CD34+细胞和CIK细胞体外扩增的影响》文中提出细胞制备是细胞治疗的一个重要环节,通过模拟微环境实现细胞的体外扩增可达到这一目的。微环境中存在的粘多糖在调控细胞的生存、增殖、凋亡和分化等方面起关键作用[1]。为此,本文研究多糖对造血干细胞（Hematopoietic stemcell,HSC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK cells）体外扩增的影响。本文首先以CD34+细胞为对象,在无血清培养体系中考察海藻酸钠、透明质酸、果胶和黄原胶四种多糖对CD34+细胞体外扩增的影响。结果发现:四种多糖中只有黄原胶对总细胞的扩增有促进作用,当培养体系中加入100 μg/ml的黄原胶时,培养至14 d时的总细胞扩增倍数可达到48.6±28.9,明显高于对照组的20.3±9.3（p<0.05）。但是分析培养物中的细胞组成时发现,其中富含造血干祖细胞的CD34+细胞和CD34+CD38-细胞的比例显着低于对照组（p<0.05）;在CD34+细胞中具有骨髓重建功能的CD48-细胞比例低于对照组;而淋巴系CD3+细胞和CD19+细胞比例增加。由此可见黄原胶促进CD34+细胞向淋巴系细胞分化。鉴于此,以外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）为对象,在无血清培养体系中,考察黄原胶在CIK细胞体外扩增中的作用。与不添加黄原胶的对照组相比,当培养体系中添加100μg/ml的黄原胶时,可使培养至21 d时的总细胞扩增倍数达到4534±886,显着高于对照组的1299±347（p<0.05）。培养物中CD3+D56+细胞的比例达到（25.5±4.6）%,明显高于对照组的（17.5±1.9）%（/p<0.05）,而CD3+和CD3+CD8+细胞比例均无明显变化;主要效应细胞CD3+CD56+的扩增倍数达到30102±10225,明显高于对照组的5897±2016（p<0.05）,说明黄原胶能有效促进CIK细胞的体外扩增。采用K562细胞为靶细胞,以10:1的效靶比评价扩增后CIK细胞的杀伤活性,结果发现:培养到21d时CIK细胞杀伤活性达到（45.3±3.5）%,明显高于对照组的（36.7±5.1）%（p<0.05）,说明黄原胶增强了细胞因子诱导获得的CIK细胞的杀伤活性。进-步分析了与杀伤活性相关的细胞膜上CD107a、胞内颗粒酶B和穿孔素的表达,结果发现扩增后的细胞中表达颗粒酶B和穿孔素的细胞比例分别达到（53.6±33.8）%和（48.3±11.1）%,明显高于对照组的（27.5±34.2）%和（37.5±11.2）%（p<0.05）,而表达CD107a的细胞比例与对照组相比没有显着变化。推测黄原胶通过提高扩增后CIK细胞中表达颗粒酶B和穿孔素的细胞比例来增强CIK细胞的杀伤活性。为探究黄原胶促进CIK细胞扩增的原因,分别在培养体系中添加组成黄原胶的葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸以及三种单糖的混合物考察其对CIK细胞扩增的影响。结果发现,培养至21d时,添加40 μg/ml的葡萄糖或甘露糖时的总细胞扩增倍数与对照组相近;添加20μg/ml葡萄糖醛酸时的总细胞扩增倍数与对照组的相对值为1.59±0.30,而培养物中CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞的比例与对照组相近,添加葡萄糖醛酸可使主要效应细胞CD3+CD56+细胞的扩增倍数为对照组的1.71±0.36倍;添加三种单糖的混合物时,总细胞和主要效应细胞CD3+CD56+细胞的扩增倍数分别为对照组的1.68± 0.41倍和1.89±0.48倍,与单加葡萄糖醛酸的结果相近。推测在培养过程中黄原胶通过释放葡萄糖醛酸来促进CIK细胞的扩增。以上结果为CIK细胞体外扩增过程的优化提供技术支持。
徐志娟,欧阳桂芳[6]（2013）在《脐血间充质干细胞的造血支持》文中提出背景:脐血造血干细胞移植价值日益突出,造血干细胞体外扩增已成为干细胞领域的研究热点。目的:复习相关文献,对脐血间充质干细胞支持造血作用研究现状与应用前景进行综述。方法:应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中2001至2012年关于脐血间充质干细胞造血支持作用的文章,中文检索词为"脐血间充质干细胞,造血干细胞,CD34+细胞,体外扩增",英文检索词为"Hematopoietic stem cell expansion,CD34+cell expansion,Umbilical cord blood mesenchymal stem cells"。最终选择35篇文章进入结果分析。结果与结论:脐血间充质干细胞支持造血作用的多种作用机制,包括分泌多种具有造血支持作用的细胞因子,表达与造血细胞相互作用的黏附分子等。因此,体外扩增造血干细胞,临床联合移植间充质干细胞和造血干细胞,提高造血重建的能力,具有广阔的研究前景。
刘颖[7]（2011）在《人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究》文中指出造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和调节造血干/祖细胞（haemopoietic stem/progenitor cell,HSPC）生长发育的内环境,其结构和功能的完整统一是维系造血功能正常进行的重要环节。作为造血微环境的重要组成部分,基质细胞可能通过形成造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）生长的“龛”,分泌造血生长因子（hematopoietic growth factor,HGF）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）等参与造血细胞的自我更新、增殖分化和归巢定位,在免疫调节方面也具有重要的作用。深入探讨基质细胞对骨髓造血功能的影响,从修复或重建骨髓微环境正常功能入手治疗造血功能损伤具有重要的理论价值和实际意义。基质细胞由间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）分化而来,是一个包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和网状细胞等成分复杂的异质细胞群。自1977年Dexter在体外培养出人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）获得成功后,人们对hBMSCs进行了深入的研究。经实验研究和临床实践证实,hBMSCs体外培养扩增联合HSC回输是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs来源受限,采集骨髓增加供者痛苦和风险,且细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄增加而下降。自体移植中患者自身基质细胞存在异常,而异体移植亦有可能带来移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）等免疫相关问题,均限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。人脐血来源丰富,取材方便,具有未成熟的干/祖细胞比例高且免疫原性较低等特点,在多种造血系统恶性疾病临床治疗中具有潜在的应用价值。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究,前期研究通过特定的细胞因子使hUCBDSCs得以有效扩增,扩增后的hUCBDSCs在细胞成分和免疫表型上与hBMSCs相似,能够分泌表达多种细胞因子,具备造血基质细胞的基本特征。以hUCBDSCs为滋养层的培养体系能有效支持脐血CD34+细胞体外扩增,特别对于促巨核细胞集落形成单位（colony forming unit-megakaryocte,CFU-Mk）形成的作用明显优于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促进巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意义。深入探讨hUCBDSCs移植在体内支持和调控造血、重建造血微环境的作用可为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。基于上述分析,本课题首先建立两种不同来源基质细胞滋养层（hUCBDSCs和hBMSCs）培养体系,采用CCK-8法和Transwell法分别观察两种基质细胞对脐血单个核细胞（human umbilical cord mononuclear cells,hUCB-MNCs）增殖、粘附和迁移的影响,并采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关分子mRNA的表达情况。在此基础上建立BABL/c小鼠造血微环境辐照损伤模型,采用hUCB-MNCs单移植,或分别联合两种不同来源基质细胞共移植的方法,比较观察两种基质细胞促进造血细胞体内归巢与植入、重建造血微环境及支持造血重建的作用,为安全有效的临床移植治疗提供新的辅助措施和手段。方法:1.体外构建hUCBDSCs和hBMSCs两种不同来源基质细胞滋养层培养体系。采用CCK-8法和Transwell法分别检测两种基质细胞对hUCB-MNCs体外增殖、粘附和迁移的影响;采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关因子（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA的表达情况。2.以近交系BABL/c小鼠作为受体鼠,经60COγ射线致死剂量8.5 Gy全身照射预处理后分别接受不同剂量hUCB-MNCs（2、4、6或8×106/只）单移植,或联合hUCBDSCs（2×106/只）共移植,移植后第6周流式细胞仪检测小鼠骨髓人源CD45+细胞植入率。3.采用CM-DiI荧光染料预染hUCB-MNCs,辐照后BABL/c小鼠分别接受hUCB-MNCs（2×106/只）单移植,或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。激光共聚焦显微镜追踪观察移植后荧光标记hUCB-MNCs在小鼠体内的迁移分布情况,比较各组造血细胞归巢率。4.辐照后小鼠分别接受hUCB-MNCs（2×106/只）单移植,或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。观察移植后各组小鼠存活情况,记录生存率;动态检测外周血血象恢复情况,骨髓组织病理切片观察骨髓病理变化;不同时相点计数各组小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、脾集落形成单位（CFU-S）、粒/巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和巨核细胞集落形成单位（CFU-Mk）产率。结果:1. hUCBDSCs对脐血单个核细胞体外增殖、粘附和迁移能力的影响同hBMSCs共培养组和hUCB-MNCs单独培养组相比较,hUCB-MNCs在hUCBDSCs共培养条件下增殖能力显着增强。两种基质细胞均能促进hUCB-MNCs的粘附,且共培养后hUCB-MNCs迁移能力也显着（P<0.05）强于无基质细胞支持对照。hUCBDSCs明显表达与造血细胞归巢植入密切相关的粘附分子、细胞因子及受体（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA,揭示其对造血细胞在体内的归巢和植入具有重要作用。2. hUCBDSCs联合移植促进造血细胞归巢和植入辐照后小鼠分别接受不同剂量hUCB-MNCs（2、4、6或8×106/只）单移植,或联合hUCBDSCs（2×106/只）共移植。采用不同剂量的hUCB-MNCs单移植后的植入率随hUCB-MNCs输注量增加而增长。hUCBDSCs联合移植能不同程度提高小鼠骨髓中人CD45+细胞植入比例,尤其当输注低剂量hUCB-MNC（s2×106/只）时,hUCBDSCs共移植较单移植的植入率提高最为显着。激光共聚焦显微镜下观察CM-DiI标记的hUCB-MNCs在移植后2～3天主要归巢至骨髓和脾脏。移植后48小时,hUCBDSCs共移植组归巢率显着（P<0.05）高于hBMSCs共移植组和单移植组,显示移植后早期hUCBDSCs能促进造血细胞向骨髓迁移归巢。3.hUCBDSCs联合移植修复受损微环境,支持造血重建两种基质细胞共移植组在移植后均能促进小鼠存活,血象恢复较快,在移植后28天内恢复至照射前水平。其中,hUCBDSCs共移植组血小板受抑程度较轻,回升也较快,并于移植后21天恢复至照射前水平;h BMSCs共移植组白细胞于移植后10天迅速回升,在此后恢复趋势高于hUCBDSCs共移植组;共移植两组间血红蛋白变化趋势无显着性差异。hUCBDSCs联合移植移植后促进骨髓组织恢复,重建受损微环境,提高CFUs（CFU-F,CFU-S,CFU-GM,CFU-Mk）产率,特别是CHU-Mk数量较h BMSCs联合移植增多,提示hUCBDSCs对于促巨核系增殖分化具有重要作用。结论:1. hUCBDSCs能促进脐血单个核细胞增殖、粘附和迁移,且促增殖能力较h BMSCs强。人脐血源基质细胞显着表达一些归巢相关因子的mRNA。2. hUCBDSCs联合移植能提高移植后小鼠造血植入率,特别当造血细胞输注为低剂量时,这种作用更加显着。3. hUCBDSCs联合移植能促进造血细胞早期迁移归巢至骨髓和脾脏,提高归巢效率。4. hUCBDSCs联合移植能提高小鼠存活,促进移植后造血重建并修复受损微环境。
邓婷芬[8]（2009）在《脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨》文中研究指明脐血作为一种造血干细胞资源越来越受到广泛重视,但由于单份脐血中造血干细胞数量不足,不能满足大多数成人和高体重儿童造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要,故限制了其广泛应用。体外扩增虽然可以增加造血细胞数量,但可能导致造血干细胞分化并降低其归巢和长期造血重建能力,因此提高脐血造血干细胞体外扩增质量仍是脐血移植中亟待解决的问题。间充质干细胞作为造血微环境主要细胞成分基质细胞的前体细胞,可以分泌与造血干细胞生长发育相关的黏附分子、细胞外基质和多种细胞因子,为造血干细胞体外扩增提供适宜的微环境。随着培养技术的提高,脐血间充质干细胞有着与其他来源的间充质干细胞所无法比拟的优势。本实验研究脐血间充质干细胞对人脐血单个核细胞体外扩增的支持作用。目的探讨脐血来源间充质干细胞（UCB-MSCs）体外分离、培养和初步鉴定的方法,以及UCB-MSCs联合外源性细胞因子对人脐血单个核细胞（UCB-MNCs）体外扩增的支持作用和最佳收获时间,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验方法。方法用羟乙基淀粉（HES）和人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用贴壁筛选法以MesencultTM专用培养基培养出脐血间充质干细胞,并通过流式细胞仪检测其细胞表面抗原。将新鲜脐血标本分离出的脐血单个核细胞接种于无血清培养体系（Stem spanTM）中培养18天,实验分三组,A组:为空白对照组（培养体系中无外源性细胞因子和UCB-MSCs滋养层）;B组:为因子组（培养体系中有外源性细胞因子但无UCB-MSCs滋养层）;C组:为实验组（培养体系中既有外源性细胞因子又有UCB-MSCs滋养层）。在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数（MNCs）、CD34+细胞数、CD133+细胞数、集落形成单位数（CFU）和细胞在周期（G2+M+S期）含量的变化。结果①从脐血中分离、培养的出间充质干细胞,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。②在体外培养过程中,外源性细胞因子及UCB-MSCs均对脐血单个核细胞的扩增起支持作用,但以UCB-MSCs联合外源性细胞因子组效果最好,该组各项指标在同一时间点较其它两组高,有统计学意义（P﹤0.05）,且维持造血至少达18天。③以UCB-MSCs联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞扩增,第10天上述各项指标达到最高峰,有统计学意义（P﹤0.05）。结论①采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞检测技术,可以成功地实现从脐血中分离、培养出间充质干细胞,并完成其细胞表型的初步鉴定。②UCB-MSCs联合外源性细胞因子可有效扩增脐血单个核细胞。③UCB-MSCs联合外源性细胞因子体外扩增脐血单个核细胞细胞收获的最佳时间为第10-14天。
井莹莹[9]（2009）在《hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响》文中研究指明目的:分别建立逆转录病毒载体和腺病毒载体介导的转人白血病抑制因子（human leukemia inhibitory factor,hLIF）基因饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法:将本科室构建和保存的hLIF基因重组逆转录病毒载体经鉴定正确后转染293T人胚肾成纤维细胞,经抗生素Zeocin筛选后获得稳定的转基因饲养层细胞,采用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测hLIF基因在饲养层细胞中的转录和翻译;将本科室保存的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38人胚肺成纤维细胞建立饲养层细胞,同样采用RT-PCR法和ELISA法检测hLIF基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测其纯度;将CD34+造血干/祖细胞分别与上述饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血细胞经CFDA SE（Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester,）荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,通过细胞荧光标记法和RT-PCR法检测小鼠骨髓内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果:建立的逆转录病毒载体介导转hLIF基因饲养层细胞经Zeocin筛选后均带有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因可以在293T细胞中有效表达;50MOI的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38细胞48h后,可见95%以上的细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定转基因细胞中有hLIF基因的表达;免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.6±2.58%,与逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞共培养7d后,细胞总数最高可扩增12.6±1.32倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为55.0%、59.3%;而Ad-hLIF转基因饲养层细胞可使CD34+造血干/祖细胞7d内扩增18.45±1.24倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为57.2%、59.8%,继续培养28d后,细胞总数扩增了356.95±0.87倍,其中CD34+细胞的数量出现了动态变化,在014d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低,共培养28d时,CD34+细胞数量仍比共培养前有较大升高,可扩增13.92±0.85。将扩增后的造血细胞移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法鉴定后,还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论:成功建立了逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞和Ad-hLIF转基因饲养层细胞,不仅体外可以有效的扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化,而且扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有一定的造血恢复功能。
袁雅红[10]（2008）在《人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用及体内移植促进造血重建的实验研究》文中研究指明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。在不同的诱导条件下,MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs的主要来源为成人骨髓,但成人骨髓源MSCs的细胞数量及增殖分化潜能会随着年龄的增大而下降,且病毒感染率较高,此外供者MSCs的采集需行骨髓穿刺术,因而MSCs的临床应用存在很大的局限。近年的研究表明,从胎盘中可分离出MSCs,它们和骨髓MSCs一样,在合适的培养条件下具有多向分化能力。MSCs作为骨髓造血微环境中的重要组成成分,它通过分泌多种造血生长因子以及细胞与细胞间的直接接触等方式作用于造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）,因而在造血调控中发挥重要的作用。目前,MSCs已被用来体外支持HSCs扩增,体内联合HSCs移植促进造血重建。本研究在成功分离培养人胎盘源间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs）的基础上,探讨人PMSCs在体内和体外支持造血的功能效应。本文分为两部分。第一部分阐述了人PMSCs的分离培养和鉴定,并探讨人PMSCs对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁和传代培养获得人PMSCs,运用流式细胞仪检测其表面标志,分别联合应用β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松体系和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松体系将其诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,继而采用碱性磷酸酶检测和vonkossa染色对其进行成骨分化鉴定,采用油红染色对其进行脂肪分化鉴定。将用密度梯度离心法分离的脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养,通过细胞计数和流式细胞仪分别检测造血细胞的生长情况。结果显示:1.从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs,贴壁细胞呈成纤维细胞状,经流式细胞仪检测其表型为CD29+、CD44+、CD105+、CD106+、CD166+、CD34-、CD45-、HLA-DR-;2.PMSCs经成骨诱导3周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,von kossa染色可见明显钙结节。PMSCs经成脂诱导2周后,油红染色呈阳性,有明显的脂滴出现;3.人PMSCs+脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45+细胞数在各培养时间点均明显高于对照组,在培养第7天,CD45+、CD14+及CD19+细胞数共培养组也明显高于对照组。结果表明,人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。第二部分利用同种异基因小鼠骨髓移植模型,比较经骨髓腔内注射（intra-bonemarrow injection,IBMI）和外周静脉输注（intravenous injection,Ⅳ）两种途径移植小鼠骨髓单个核细胞（BMNCs）后受体早期的造血重建情况,建立了小鼠IBMI技术平台,并利用IBMI技术初步探讨了人PMSCs联合脐血MNCs共移植入SCID鼠体内后的早期造血重建效应。以BALB/c小鼠为供体,通过IBMI和Ⅳ两种途径将其BMNCs移植入经致死量辐照预处理的C57BL/6受鼠体内。60只受鼠随机分为3组:骨髓腔内注射高剂量组1（IBM1组）、骨髓腔内注射低剂量组2（IBM2组）、尾静脉注射组（Ⅳ组）,每组20只。在骨髓移植后1、3、6、9 d分别计数各组受鼠胫骨骨髓腔内细胞总数,并用流式细胞仪检测供体植入水平（供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞数）。以人PMSCs和脐血MNCs为供体,通过IBMI方法或结合Ⅳ方法,将两种细胞联合或单独移植入经亚致死量辐照预处理的SCID受鼠体内。9只受鼠随机分为3组:联合移植A组（PMSCs+脐血MNCs,IBMI）、单独移植B组（脐血MNCs,IBMI）、联合移植C组（PMSCs经IBMI,脐血MNCs经Ⅳ）,每组3只。在移植后14 d取各组SCID小鼠注射侧和对侧胫骨腔内骨髓细胞,并用流式细胞仪检测分析人CD34+、CD45+细胞的植入水平。结果显示:1.IBM1组和IBM2组注射侧于移植后6 d胫骨骨髓腔内细胞总数、供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞总数均明显高于Ⅳ组;2.SCID小鼠移植后14 d,B组注射侧及对侧胫骨骨髓腔内的人CD34+、CD45+细胞的百分比均明显低于A组小鼠的注射侧和对侧。结果表明,IBMI较Ⅳ更能促进同种异基因骨髓移植后的早期造血功能重建;人PMSCs可以增加脐血MNCs的植入,促进造血重建。综上所述,本实验从人胎盘组织中成功分离培养获得PMSCs,人PMSCs在体外对脐血MNCs的生长有明显的支持作用。通过IBMI技术将人PMSCs与脐血MNCs共移植于SCID小鼠体内,人PMSCs可有效促进脐血MNCs的早期造血重建。这为进一步研究人PMSCs体内和体外支持造血的相关分子机理奠定了实验基础。
二、硫酸乙酰肝素协同细胞因子对脐血造血细胞体外扩增及细胞免疫表型的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硫酸乙酰肝素协同细胞因子对脐血造血细胞体外扩增及细胞免疫表型的影响（论文提纲范文）
（1）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（2）人骨骼肌源性血管外膜细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外支持作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人骨骼肌源性血管外膜细胞的分离、培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要材料及仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 人骨骼肌源性血管外膜细胞的分选 |
| 2.2 人骨骼肌源性血管外膜细胞的体外培养 |
| 2.3 人骨骼肌源性血管外膜细胞冻存 |
| 2.4 人骨骼肌源性血管外膜细胞的生物学特性鉴定 |
| 3.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.人骨骼肌MNCs分离情况 |
| 2.多参数流式细胞术分选CD146~+hMD-PCs |
| 3.CD146~+hMD-PCs纯度回测 |
| 4.CD146~+hMD-PCs培养及形态学观察 |
| 5.CD146~+hMD-PCs生物学特性鉴定 |
| 讨论 |
| 第二部分 脐血CD34~+细胞的提取及体外共培养体系的建立 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要材料及仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 脐血CD34~+细胞的分离与纯化 |
| 2.2 CD146~+hMD-PCs对脐血CD34~+细胞体外支持作用 |
| 3.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.人脐血CD34~+细胞的分离 |
| 2.流式细胞术检测脐血CD34~+细胞的阳性率 |
| 3.共培养体系中脐血CD34~+细胞生长状态 |
| 4.共培养后脐血CD34~+细胞数变化 |
| 5.共培养后脐血CD34~+细胞的集落形成能力 |
| 6.流式细胞术分析共培养后造血细胞免疫表型的变化 |
| 7.各培养体系上清液细胞因子水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（3）UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.造血干细胞 |
| 1.1 造血干细胞研究历史 |
| 1.2 造血干细胞的功能 |
| 1.3 造血干细胞的临床应用 |
| 2.脐血造血干细胞体外扩增培养 |
| 2.1 扩增培养的意义 |
| 2.2 研究进展 |
| 3.研究意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2.技术路线 |
| 3.实验方法 |
| 第三部分 实验结果 |
| 1.37 个小分子化合物的合成及结构 |
| 2.37 个小分子化合物初筛 |
| 3.潜力化合物复筛 |
| 4.化合物4和11 生物活性检测 |
| 5.最佳化合物11最适浓度选取及扩增效果评价 |
| 6.细胞凋亡 |
| 7.细胞周期检测 |
| 8.CFSE细胞增殖检测 |
| 9.相关基因表达分析 |
| 第四部分 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新 |
| 3.展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）基于miRNA的间充质干细胞干性维持机制及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 间充质干细胞的生物学功能 |
| 1.2 间充质干细胞衰老 |
| 1.3 miRNA对干细胞衰老和自我更新的作用 |
| 1.4 间充质干细胞临床应用的问题和挑战 |
| 1.5 本文结构安排和研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 脐带间充质干细胞衰老中的mi RNA表达谱研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 体外扩增脐带间充质干细胞的形态功能特征 |
| 2.3.2 体外扩增间充质干细胞的衰老情况分析 |
| 2.3.3 间充质干细胞衰老相关的mi RNA高通量测序分析 |
| 2.3.4 间充质干细胞衰老相关的mi RNA靶基因功能分析 |
| 2.3.5 参与衰老相关功能的miRNA分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-18a对脐带间充质干细胞衰老的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miR-18a通过靶向CTDSPL对间充质干细胞衰老的影响 |
| 3.3.2 miR-18a持续表达对间充质干细胞衰老和自我更新的作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 脐血间充质干细胞的基因表达和功能特征研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体外扩增脐血间充质干细胞的形态功能特征 |
| 4.3.2 miRNA对脐带与脐血间充质干细胞衰老的调控特征比较 |
| 4.3.3 miRNA对脐带与脐血间充质干细胞生物功能的作用比较 |
| 4.3.4 脐带与脐血间充质干细胞全基因组表达谱比较 |
| 4.3.5 脐带与脐血间充质干细胞旁分泌能力比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 脐血间充质干细胞分泌组分的抗衰老作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 CBMSCs分泌组分对过氧化氢诱导的细胞衰老的影响 |
| 5.3.2 CBMSCs分泌组分对衰老小鼠免疫调节功能的影响 |
| 5.3.3 CBMSCs分泌组分对小鼠组织细胞衰老的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 论文不足 |
| 6.4 展望 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）多糖对CD34+细胞和CIK细胞体外扩增的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 细胞治疗类型 |
| 1.1.1 干细胞移植 |
| 1.1.2 免疫细胞治疗 |
| 1.2 多糖的种类和功能 |
| 1.2.1 多糖的种类 |
| 1.2.2 多糖结构与功能 |
| 1.2.3 多糖的作用机制 |
| 1.3 多糖在促进细胞增殖中的作用 |
| 1.4 本研究的内容和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 脐血和外周血 |
| 2.2.2 单个核细胞和CD34~+细胞分离 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 细胞因子 |
| 2.2.5 免疫荧光抗体 |
| 2.2.6 多糖 |
| 2.2.7 其他试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 黄原胶特性分析 |
| 2.3.2 培养基Kla检测 |
| 2.3.3 单个核细胞和CD34~+细胞分离 |
| 2.3.4 细胞培养 |
| 2.3.5 细胞计数 |
| 2.3.6 细胞表型分析 |
| 2.3.7 CIK细胞功能检测 |
| 2.3.8 细胞凋亡分析 |
| 2.3.9 实时荧光定量PCR |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 第3章 多糖对脐血CD34~+细胞扩增的影响 |
| 3.1 多糖的种类和浓度对CD34~+细胞扩增与分化的影响 |
| 3.2 黄原胶对CD34~+细胞体外扩增过程的影响 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 黄原胶对CIK细胞扩增的影响 |
| 4.1 黄原胶对CIK细胞扩增的影响 |
| 4.2 黄原胶对扩增后CIK细胞功能的影响 |
| 4.3 黄原胶对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 黄原胶对培养基物理性质的影响 |
| 4.5 黄原胶组成成分对CIK细胞扩增的影响 |
| 4.6 黄原胶对CIK细胞聚团的影响 |
| 4.7 黄原胶对CIK细胞高密度扩增的影响 |
| 4.8 本章小结 |
| 第5章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 卷内备考表 |
（6）脐血间充质干细胞的造血支持（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 资料和方法 |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 资料提取 |
| 2 结果 |
| 2.1 脐血移植的优缺点 |
| 2.2.1 脐血间充质干细胞分泌多种具有造血支持作用的细胞因子 |
| 2.2.2 间充质干细胞表达的与造血细胞相互作用的黏附分子 |
| 2.2.3 间充质干细胞支持造血干细胞体外扩增 |
| 2.2.4 联合移植间充质干细胞对造血重建有促进作用 |
| 2.2.5 其他 |
| 3 脐血间充质干细胞在造血移植中的研究前景 |
（7）人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 实验方案与技术路线 |
| 第一部分 人脐血源基质细胞对脐血造血细胞体外增殖、粘附和迁移的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人脐血源基质细胞联合移植促进脐血造血细胞归巢植入的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 人脐血源基质细胞联合移植修复受损微环境重建造血功能的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质基质细胞在临床移植中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（8）脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨（论文提纲范文）
| 缩略词表（ABBREVIATION） |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容 |
| 研究目标和意义 |
| 研究对象材料 |
| 实验方法及步骤 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 逆转录病毒载体介导的转 hLIF 基因饲养层 细胞对脐血 CD34~+造血干/祖细胞的扩增作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 Ad-hLIF 转基因饲养层细胞对脐血 CD34~+ 造血干/祖细胞增殖和分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 扩增后脐血 CD34~+细胞移植亚致死剂量辐 照的 SCID 小鼠的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：造血干/祖细胞移植研究新进展 |
| 发表和待发表的论文 |
| 本论文受下列课题资助 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用及体内移植促进造血重建的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 研究背景 |
| 1. 间充质干细胞 |
| 2. 人胎盘源间充质干细胞 |
| 3. 骨髓腔内注射技术 |
| 4. 脐血移植 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓腔内注射人胎盘源间充质干细胞对脐血移SCID鼠后造血重建的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结与展望 |
| 研究生期间撰写和发表的论文 |
| 本研究所获基金资助 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、硫酸乙酰肝素协同细胞因子对脐血造血细胞体外扩增及细胞免疫表型的影响（论文参考文献）
- [1]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [2]人骨骼肌源性血管外膜细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外支持作用的研究[D]. 杨小萍. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [3]UM171类似物体外扩增脐血造血干/祖细胞的效果评价及机制研究[D]. 冯悦. 暨南大学, 2019(02)
- [4]基于miRNA的间充质干细胞干性维持机制及应用研究[D]. 孟宪会. 东南大学, 2018(03)
- [5]多糖对CD34+细胞和CIK细胞体外扩增的影响[D]. 龚子祯. 华东理工大学, 2018(01)
- [6]脐血间充质干细胞的造血支持[J]. 徐志娟,欧阳桂芳. 中国组织工程研究, 2013(01)
- [7]人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究[D]. 刘颖. 第三军医大学, 2011(12)
- [8]脐血间充质干细胞联合细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的探讨[D]. 邓婷芬. 广州医学院, 2009(07)
- [9]hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响[D]. 井莹莹. 苏州大学, 2009(09)
- [10]人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用及体内移植促进造血重建的实验研究[D]. 袁雅红. 苏州大学, 2008(11)